CN104772122B - 用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法，包括：1）将琼脂糖凝胶清洗，放入容器中，加入第一碱溶液，再加入环氧基化合物搅拌，得第一胶，清洗；2）冰浴下，在第二碱溶液中加入二丙三胺，调pH，加入第二碱溶液，加入第一胶，搅拌，得第二胶；3）清洗第二胶，在第二胶中，加入醇胺类有机物搅拌，得第三胶，清洗；4）配制碘乙酸溶液，将其pH调至4‑5，加入第三胶和EDC.HCl，保持pH4‑5，搅拌，得第四胶，清洗，得用于亲和层析的琼脂糖凝胶。本发明制备过程简单、易于操作，解决了抗原抗体纯化过程中的树脂制备成本高的问题，提高了多肽偶联的效率和吸附所要分离纯化蛋白质的量，扩大蛋白质生产规模。

Description

用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种琼脂糖凝胶的制备方法，特别是涉及一种用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法。

背景技术

亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。琼脂糖凝胶由于亲水性强，理化性质稳定，且具有疏松的网状结构，在一定的缓冲液离子浓度时对蛋白质几乎没有非特异性吸附，目前被广泛用于亲和层析，特别是抗原抗体纯化。针对含有巯基多肽或蛋白，目前商品化的Thermo ScientificSulfoLink偶联树脂，其为多孔的6%的交联微珠状琼脂糖，其固定化能力为每2mlSulfoLink偶联树脂可以固定1-2mg多肽或者2-20mg蛋白。但由于其制备成本较高，且同等体积所连接的多肽量并不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法。该方法能解决抗原抗体纯化层析过程中的树脂制备成本高且与多肽连接量不高等问题。

为解决上述技术问题，本发明的用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法，包括步骤：

1）将琼脂糖凝胶清洗后，放入容器中，并加入第一碱溶液后，再加入环氧基化合物搅拌，得到第一胶，并对第一胶进行清洗；

2）冰浴下，在第二碱溶液（第一份的第二碱溶液）中加入二丙三胺，调pH至9-10，再加入第二碱溶液（第二份的第二碱溶液）至终体积后，加入步骤1）获得的清洗后的第一胶，搅拌，得到第二胶；

其中，终体积与步骤1）中的琼脂糖凝胶的体积比范围为1:1～2:1；

3）清洗第二胶后，在第二胶中，加入醇胺类有机物搅拌，得第三胶，并对第三胶进行清洗；

4）配制0.1～0.15M碘乙酸溶液，将其pH调至4-5，加入步骤3）获得的清洗后的第三胶和EDC.HCl【1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐】，保持pH4-5，搅拌，得到第四胶，并对第四胶进行清洗，得到用于亲和层析的琼脂糖凝胶（即清洗后的第四胶）。

所述步骤1）中，琼脂糖凝胶包括：琼脂糖凝胶CL-4B（Sepharose CL-4B）或琼脂糖凝胶CL-6B（Sepharose CL-6B）；琼脂糖凝胶清洗中的清洗溶剂包括：纯水；

第一碱溶液包括：含NaBH₄的NaOH溶液；其中，NaBH₄与NaOH的质量比范围为1:4～1:5；

第一碱溶液的浓度范围为0.55～0.65mol/L；第一碱溶液与琼脂糖凝胶的体积比范围为6:5～6:3；

环氧基化合物包括：环氧氯丙烷或环氧氯乙烷；环氧基化合物与琼脂糖凝胶的体积比范围为6:5～6:3；

步骤1）中的搅拌的条件为：室温下搅拌12～20小时；

对第一胶进行清洗的步骤为：按纯水、有机溶剂、纯水的顺序分别洗涤第一胶。其中，有机溶剂包括：丙酮或乙醇。

所述步骤2）中，第二碱溶液包括：浓度为0.5～1.5mol/L pH9～10的NaHCO₃溶液；

在第二碱溶液中加入二丙三胺的过程中，第二碱溶液的用量（第一份的第二碱溶液）为：第二碱溶液与步骤1）中的琼脂糖凝胶的体积比范围为1:2～2:2；

在第二碱溶液中加入二丙三胺的过程中，二丙三胺的用量为：二丙三胺与第二碱溶液（第一份的第二碱溶液）的体积比范围为1:2～1:3；

步骤2）中的搅拌的条件为：室温下搅拌16～20小时。

所述步骤3）中，清洗第二胶的溶剂包括：纯水；醇胺类有机物包括：乙醇胺溶液或二乙醇胺；醇胺类有机物的浓度范围为0.5～1.5mol/L；醇胺类有机物（溶液）与步骤1）中的琼脂糖凝胶的体积比范围为2:1～3:1。

步骤3）中的搅拌条件为：室温下搅拌3～4小时；

对第三胶进行清洗的步骤为：用纯水、中性盐溶液、纯水依次洗涤第三胶；其中，中性盐溶液包括：0.5～2M NaCl或0.5～1M KCl。

所述步骤4）中，碘乙酸溶液与步骤1）中的琼脂糖凝胶的体积比范围为2:2～3:2；EDC.HCl与步骤1）中的琼脂糖凝胶的用量比范围为15g:100ml～30g:100ml。

步骤4）中的搅拌条件为：室温下搅拌1～2小时；

对第四胶进行清洗的步骤为：用纯水洗涤第四胶。

步骤4）中，用于亲和层析的琼脂糖凝胶的保存条件为：

4℃下，避光保存于10mM pH7.2乙二胺四乙酸溶液，其中，该乙二胺四乙酸溶液中含有浓度为0.02g/100ml～0.09g/100ml的NaN₃。

本发明在载体（琼脂糖凝胶）上通过环氧化合物的活化后再与6个或12个碳原子的间隔臂相连，通过碘乙酸将碘代乙酰基基团连至间隔臂上。因此，使用本发明获得的用于亲和层析的琼脂糖凝胶纯化抗原抗体时，琼脂糖凝胶上的碘代乙酰基会特异并高效地与暴露的多肽的巯基（–SH）反应形成共价的、不可逆的硫醚键，从而将多肽或蛋白永久地连接到琼脂糖凝胶上。

因此，本发明是一种制备用于亲和层析琼脂糖凝胶的新方法，而且该方法制备过程简单、易于操作，解决了抗原抗体纯化过程中的树脂制备成本高的问题。另外，本实验制备的琼脂糖凝胶微球其活化度高，故而能嫁接的亲和配基多，其固定化能力为每2ml琼脂糖凝胶可以固定3-5mg多肽，大大提高了多肽偶联的效率以及提高了吸附所要分离纯化蛋白质的量，扩大蛋白质生产规模。

具体实施方式

以下实施例中，涉及的化学试剂如未特别说明，可为商业化产品。

另外，实施例中涉及的步骤如未特别说明，可在室温、通风橱内进行操作。

实施例1

用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法，步骤如下：

1）取100ml琼脂糖凝胶CL-4B（Sepharose CL-4B）用1L纯水洗净并转至烧杯中，加入0.6M150ml含800mg NaBH₄的NaOH溶液中，室温下恒定搅拌，缓慢加入150ml的环氧氯丙烷恒定搅拌过夜（如16小时），得到第一胶。

2）按纯水、丙酮、纯水各1L的顺序分别洗涤（清洗）第一胶，取1M pH9.5NaHCO₃溶液50ml置于冰浴中，加入25ml二丙三胺，调pH至9.5，再加入1M pH9.5NaHCO₃溶液至终体积100ml，加人第一胶并在室温下恒定搅拌过夜（如16小时），得第二胶。

3）用1L纯水洗涤第二胶后，在第二胶中，加入300ml1M乙醇胺溶液，在室温下恒定搅拌3小时，得第三胶。

4）用纯水、1M NaCl、纯水各1L洗涤第三胶。取2.4g碘乙酸（避光）溶于100ml纯水调pH至4.5，并加入第三胶在室温下恒定搅拌，同时加入EDC.HCl【1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐】25g，保持pH4.5达一小时后，再搅拌一小时，得第四胶。

5）用1L纯水洗涤第四胶，得到用于亲和层析的琼脂糖凝胶（即清洗后的第四胶），保存在10mM pH7.2乙二胺四乙酸溶液（含NaN₃0.02g/100ml），4℃避光保存。

实施例2

用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法，步骤如下：

1）将琼脂糖凝胶CL-6B（如可为100ml）用1L纯水清洗后，转至烧杯中，并加入0.55mol/L的含NaBH₄的NaOH溶液（其中，NaBH₄与NaOH的质量比为1:4，含NaBH₄的NaOH溶液与琼脂糖凝胶的体积比为6:5）后，再加入环氧氯乙烷（环氧氯乙烷与琼脂糖凝胶的体积比为6:5）搅拌12小时，得到第一胶，并按纯水、乙醇、纯水的顺序分别洗涤第一胶。

2）冰浴下，在0.5mol/L pH10的NaHCO₃溶液（作为第一份的第二碱溶液，其与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比范围为1:1.5）中加入二丙三胺（二丙三胺与第一份的第二碱溶液的体积比为1:2.5），调pH至10，再加入0.5mol/L pH10的NaHCO₃溶液至终体积（终体积与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为6:5）后，加入步骤1）获得的清洗后的第一胶，搅拌20小时，得到第二胶；

3）纯水清洗第二胶后，在第二胶中，加入0.5mol/L二乙醇胺（二乙醇胺与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为2:1）搅拌4小时，得第三胶，并用纯水、0.5M KCl、纯水依次洗涤第三胶；

4）取碘乙酸（避光）溶于纯水中，配制成0.1M碘乙酸溶液（碘乙酸溶液与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为2:1.5），并将其pH调至4，加入步骤3）获得的清洗后的第三胶和EDC.HCl（EDC.HCl与琼脂糖凝胶CL-6B的用量比为15g:100ml），保持pH4，搅拌1.5小时，得到第四胶，并对纯水第四胶进行清洗，得到用于亲和层析的琼脂糖凝胶，保存在10mM pH7.2乙二胺四乙酸溶液（含NaN₃0.05g/100ml），4℃避光保存。

实施例3

用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法，步骤如下：

1）将琼脂糖凝胶CL-6B（如可为100ml）用1L纯水清洗后，转至烧杯中，并加入0.65mol/L的含NaBH₄的NaOH溶液（其中，NaBH₄与NaOH的质量比为1:5，含NaBH₄的NaOH溶液与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为2:1）后，再加入环氧氯乙烷（环氧氯乙烷与琼脂糖凝胶的体积比为2:1）搅拌20小时，得到第一胶，并按纯水、乙醇、纯水的顺序分别洗涤第一胶。

2）冰浴下，在1.5mol/L pH9的NaHCO₃溶液（作为第一份的第二碱溶液，其与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比范围为1:1）中加入二丙三胺（二丙三胺与第一份的第二碱溶液的体积比为1:3），调pH至9，再加入1.5mol/L pH9的NaHCO₃溶液至终体积（终体积与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为5:3）后，加入步骤1）获得的清洗后的第一胶，搅拌18小时，得到第二胶；

3）纯水清洗第二胶后，在第二胶中，加入1.5mol/L二乙醇胺（二乙醇胺与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为2.5:1）搅拌3.5小时，得第三胶，并用纯水、2M NaCl、纯水依次洗涤第三胶；

4）取碘乙酸（避光）溶于纯水中，配制成0.15M碘乙酸溶液（碘乙酸溶液与琼脂糖凝胶CL-6B的体积比为2:1.5），并将其pH调至5，加入步骤3）获得的清洗后的第三胶和EDC.HCl（EDC.HCl与琼脂糖凝胶CL-6B的用量比为30g:100ml），保持pH5，搅拌2小时，得到第四胶，并对纯水第四胶进行清洗，得到用于亲和层析的琼脂糖凝胶，保存在10mM pH7.2乙二胺四乙酸溶液（含NaN₃0.09g/100ml），4℃避光保存。

以上实施例制备的用于亲和层析的琼脂糖凝胶中，每2ml琼脂糖凝胶可以固定3-5mg多肽，提高了多肽偶联的效率和吸附所要分离纯化蛋白质的量，扩大蛋白质生产规模。

Claims (8)

1.一种用于亲和层析的琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1)将琼脂糖凝胶清洗后，放入容器中，并加入第一碱溶液后，再加入环氧基化合物搅拌，得到第一胶，并对第一胶进行清洗；

2)冰浴下，在第二碱溶液中加入二丙三胺，调pH至9-10，再加入第二碱溶液至终体积后，加入步骤1)获得的清洗后的第一胶，搅拌，得到第二胶；

其中，终体积与步骤1)中的琼脂糖凝胶的体积比范围为1:1～2:1；

3)清洗第二胶后，在第二胶中，加入醇胺类有机物搅拌，得第三胶，并对第三胶进行清洗；

4)配制0.1～0.15mol/L碘乙酸溶液，将其pH调至4-5，加入步骤3)获得的清洗后的第三胶和EDC.HCl，保持pH4-5，搅拌，得到第四胶，并对第四胶进行清洗，得到用于亲和层析的琼脂糖凝胶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，琼脂糖凝胶包括：琼脂糖凝胶CL-4B或琼脂糖凝胶CL-6B；

琼脂糖凝胶清洗中的清洗溶剂包括：纯水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，第一碱溶液包括：含NaBH₄的NaOH溶液；其中，NaBH₄与NaOH的质量比范围为1:4～1:5；

第一碱溶液的浓度范围为0.55～0.65mol/L；第一碱溶液与琼脂糖凝胶的体积比范围为6:5～6:3。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，环氧基化合物包括：环氧氯丙烷或环氧氯乙烷；

环氧基化合物与琼脂糖凝胶的体积比范围为6:5～6:3；

步骤1)中的搅拌的条件为：室温下搅拌12～20小时；

对第一胶进行清洗的步骤为：按纯水、有机溶剂、纯水的顺序分别洗涤第一胶；其中，有机溶剂包括：丙酮或乙醇。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，第二碱溶液包括：浓度为0.5～1.5mol/L pH9～10的NaHCO₃溶液；

在第二碱溶液中加入二丙三胺中，第二碱溶液的用量为：第二碱溶液与步骤1)中的琼脂糖凝胶的体积比范围为1:2～2:2；

在第二碱溶液中加入二丙三胺中，二丙三胺的用量为：二丙三胺与第二碱溶液的体积比范围为1:2～1:3；

步骤2)中的搅拌的条件为：室温下搅拌16～20小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，清洗第二胶的溶剂包括：纯水；

醇胺类有机物包括：乙醇胺溶液或二乙醇胺；醇胺类有机物的浓度范围为0.5～1.5mol/L；醇胺类有机物与步骤1)中的琼脂糖凝胶的体积比范围为2:1～3:1；

步骤3)中的搅拌条件为：室温下搅拌3～4小时；

对第三胶进行清洗的步骤为：用纯水、中性盐溶液、纯水依次洗涤第三胶；其中，中性盐溶液包括：0.5～2mol/L NaCl或0.5～1mol/L KCl。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，碘乙酸溶液与步骤1)中的琼脂糖凝胶的体积比范围为2:2～3:2；

EDC.HCl与步骤1)中的琼脂糖凝胶的用量比范围为15g:100ml～30g:100ml；

步骤4)中的搅拌条件为：室温下搅拌1～2小时；

对第四胶进行清洗的步骤为：用纯水洗涤第四胶。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，用于亲和层析的琼脂糖凝胶的保存条件为：

4℃下，避光保存于10mM pH7.2乙二胺四乙酸溶液，其中，该乙二胺四乙酸溶液中含有浓度为0.02g/100ml～0.09g/100ml的NaN₃。