CN110105447A - 一种猪伪狂犬病病毒高免血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪伪狂犬病毒高免血清的制备方法，它是以猪为免疫对象，使用灭活疫苗进行一次基础免疫和两次加强免疫，再用猪伪狂犬病病毒进行一次攻毒后，采集血清，即得；所述灭活疫苗含有干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子的免疫增强剂。本发明能克服猪来源的高免血清抗体中和能力差的问题，并能广泛运用于伪狂犬病病毒的JS‑2012株、Bartha‑k61株、HB‑98株、HB2000和/或JS‑A1株，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒高免血清的制备方法。
背景技术
高免血清，是利用某种疫(菌)苗按一定程序反复免疫某种动物，并经抗体检测其滴度达到一定水平后，屠宰被免疫动物并收集全血后，经特殊处理而制成的一种生物制品。高免血清主要用于生物制品的外源病毒检验。
猪伪狂犬病病毒高免血清主要用于兽用生物制品的外源病毒检验。随着猪伪狂犬活疫苗制造工艺的提升，各生产厂家成品疫苗的病毒效价由原来105.0TCID50/头份提升到106.0TCID50/头份以上，因此，需要制备中和效价更高的猪伪狂犬病病毒血清。
目前，大部分猪伪狂犬高免血清采用兔、羊等异源动物，但存在兔体的采集血量较少，羊外源病毒检测手段困乏、不够准确说明检测结果是否正确等因素的影响。而现有的猪来源的伪狂犬高免血清中和抗体的能力普遍偏弱，无法适用于现今高效价成品疫苗的检测。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了1.一种猪伪狂犬病毒高免血清的制备方法，其特征在于：它是以猪为免疫对象，使用灭活疫苗进行一次基础免疫和两次加强免疫，再用猪伪狂犬病病毒进行一次攻毒后，采集血清，即得；
所述疫苗含有免疫增强剂；
所述免疫增强剂是由0.9％氯化钠缓冲液中加入干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子配制成水相后，与吐温-60混合乳化制得；所述水相和吐温-60的体积比是(8～10)∶1；
每毫升所述水相含有0.1～100mg干扰素α、0.1～100mg干扰素β、0.1～200mg黄芪多糖和0.1～100mg巨噬细胞集落刺激因子。
如前述的方法，所述水相中含有50mg/ml干扰素α、50mg/ml干扰素β、200mg/ml黄芪多糖和10mg/ml巨噬细胞集落刺激因子。
如前述的方法，所述水相和吐温-60的体积比是9∶1。
如前述的方法，所述灭活疫苗是使用1体积份的免疫增强剂、49体积份灭活病毒和50体积份弗氏佐剂乳化混合而成。
如前述的方法，所述弗氏佐剂在基础免疫时为弗氏完全佐剂，加强免疫时为弗氏不完全佐剂。
如前述的方法，所述猪伪狂犬病病毒为该病毒的JS-2012株、Bartha-k61株、HB-98株、HB2000和/或JS-A1株。
如前述的方法，所述方法还包括血清纯化步骤。
如前述的方法，所述血清纯化步骤为：
(1)0.45微米滤器过滤澄清，收集样品约95ml；
(2)准备纯化用缓冲液：缓冲液A、B和C；
(3)用缓冲液A平衡柱体至基线；
(4)上样，缓冲液A再平衡至基线；
(5)用缓冲液B洗脱至基线，每5ml收集样本1次，直到洗脱至基线。收集后的样品中加入1/10体积缓冲液C进行中和。
如前述的血清纯化步骤，步骤(2)所述缓冲液A含有0.15M NaCl和20mM磷酸盐，pH＝7.0；所述缓冲液B含有0.1M甘氨酸，pH＝3.0；所述缓冲液C含有1M的Tris-HCl，pH＝8.0。
本发明使用猪为免疫对象，大大地提高了免疫血清的产量。
本发明合理地使用免疫增强剂和免疫策略，克服了猪来源的伪狂犬高免血清的中和抗体能力弱的问题，本发明每毫升高免血清可中和106.0-6.5TCID50/头份猪伪狂犬病病毒，经纯化后的血清可中和107.0-8.0TCID50/头份猪伪狂犬病病毒。完全能适应如今高效价伪狂犬活疫苗的检测。
本发明还能中和猪伪狂犬病病毒Bartha-k61株、HB-98株、HB-2000株、JS-A1株和JS-2012株，具有较宽的应用范围。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例和实验例中用到的部分试剂如下：
DMEM培养基：生产单位为gibco公司，LOT为1920796，按说明书配置成工作液。
胰酶：生产单位为gibco公司，LOT为1758947，按说明书配制成0.2％工作液。
新生牛血清：生产单位为gibco公司，LOT为1758947，按所需比例添加如DMEM培养工作液中。
抗体检测试剂盒CSFV、PRV、PRRSV抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；PCV2抗体检测试剂盒购自武汉科前公司。
血清纯化用填料：生产单位为GE医疗集团，LOT为17-5280-02。
实施例1猪伪狂犬病病毒疫苗准备
1.免疫增强剂的制备
在0.9％氯化钠缓冲液(pH7.2)中加入干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子配制成水相，使得每毫升水相含有50mg干扰素α、50mg干扰素β、200mg黄芪多糖和10mg巨噬细胞集落刺激因子，然后与吐温-60按体积比9∶1混合，25℃条件下用匀浆机以20-200Hz，乳化3-10min，制备成免疫增强剂。
2.病毒灭活剂的制备
BEI(二乙烯亚胺)灭活剂的制备，称取BEA 0.1g，NaOH 0.1g，分别用5ml去离子水溶解，混合后37℃水浴锅灭活1h。该溶液配制后应立即使用。
3.灭活病毒的制备
本方法采用BEI灭活伪狂犬病毒。将制备的灭活剂按1％比例加入到伪狂犬病毒液JS-A2012株(Reed-Muench法计算半数致死(感染)量为107.0-8.0TCID50/ml，以下测定方法相同)，37℃，120rpm灭活38-72h。经无菌检验及灭活检验合格，4℃保存，待用。
4.灭活疫苗的制备
灭活疫苗A的制备。将免疫增强剂以1/49的体积比加入到灭活病毒中，用组织匀浆机以600-1000HZ，乳化3-5min。该液与等体积弗氏完全佐剂(厂家Sigma公司，批号：F5881-10ML)乳化，用组织匀浆机以600-1000HZ，乳化1min的程序乳化，重复1-4次，直到水相与油相乳化完全。
灭活疫苗B的制备。将免疫增强剂以1/49的体积比加入到灭活病毒中，用组织匀浆机以600-1000HZ，乳化3-5min。该液与等体积弗氏不完全佐剂(厂家Sigma公司，批号：F5506-10ML)乳化，用组织匀浆机以600-4500HZ，乳化1min的程序乳化，重复2-5次，直到水相与油相乳化完全。
以上灭活疫苗后4℃保存，待用。
实施例2猪伪狂犬病病毒疫苗准备
1.免疫增强剂的制备
在0.9％氯化钠缓冲液(pH7.2)中加入干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子配制成水相，使得每毫升水相含有0.1mg干扰素α、0.1mg干扰素β、0.1mg黄芪多糖和0.1mg巨噬细胞集落刺激因子，然后与吐温-60按体积比10∶1混合，25℃条件下用匀浆机以20-200Hz，乳化3-10min，制备成免疫增强剂。2.病毒灭活剂的制备
同实施例1。
3.灭活病毒的制备
同实施例1。
4.灭活疫苗的制备
同实施例1。
实施例3猪伪狂犬病病毒疫苗准备
1.免疫增强剂的制备
在0.9％氯化钠缓冲液(pH7.2)中加入干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子配制成水相，使得每毫升水相含有100mg干扰素α、100mg干扰素β、200mg黄芪多糖和100mg巨噬细胞集落刺激因子，然后与吐温-60按体积比8∶1混合，25℃条件下用匀浆机以20-200Hz，乳化3-10min，制备成免疫增强剂。2.病毒灭活剂的制备
同实施例1。
3.灭活病毒的制备
同实施例1。
4.灭活疫苗的制备
同实施例1。
实施例4猪伪狂犬病病毒疫苗准备
1.免疫增强剂的制备
在0.9％氯化钠缓冲液(pH7.2)中加入干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子配制成水相，使得每毫升水相含有2mg干扰素α、2mg干扰素p、3mg黄芪多糖和4mg巨噬细胞集落刺激因子，然后与吐温-60按体积比10∶1混合，25℃条件下用匀浆机以20-200Hz，乳化3-10min，制备成免疫增强剂。2.病毒灭活剂的制备
同实施例1。
3.灭活病毒的制备
同实施例1。
4.灭活疫苗的制备
同实施例1。
实施例5动物免疫
试验动物：经PCR检测和ELISA检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)抗体均为阴性的35日龄仔猪用于本试验。
取试验动物按下列顺序进行免疫：
1.基础免疫：颈部肌肉注射接种灭活疫苗A，每头猪接种1ml。
2.第一次加强免疫：免疫后1个月，颈部肌肉注射接种灭活疫苗B，每头猪接种1ml。
3.第二次加强免疫：免疫后1个月，颈部肌肉注射接种灭活疫苗B，每头猪接种1ml。
4.攻毒：第二次加强免疫后3个月，每头猪滴鼻猪伪狂犬病病毒JS-2012株(Reed-Muench法计算半数致死(感染)量为107.0-8.0TCID50/m1)。攻毒后1个月后，经前腔静脉采血，分离血清即得未纯化的高免血清。
6.纯化
将收获血清按血清纯化按照EG公司IgA填料说明书进行纯化，得纯化后的高免血清。
具体地：
(1)0.45微米滤头过滤澄清，收集样品约95ml。
(2)准备纯化用缓冲液：
Buffer A：0.15M NaCl，20mM PB(磷酸氢钠和磷酸二氢钠)，pH7.0；
Buffer B：0.1M Glycine，pH3.0；
Buffer C：1M Tris-HCl，pH8.0；
(3)用Buffer A平衡柱体至基线；
(4)上样，Buffer A再平衡至基线；
(5)用Buffer B洗脱至基线，每5ml收集样本1次，直到洗脱至基线。收集后的样品中加入1/10体积Buffer C进行中和。
实验例 高免血清的检测
用于免疫的疫苗来自实施例1～4，动物免疫流程按照实施例5进行。
1.方法
1)外源病毒、抗体检测
取实施例5中第四次免疫攻毒后21d采集全血，应用相应试剂盒进行伪狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病毒、圆环病毒、口蹄抗原、抗体检测。
2)中和效价检测、中和试验
取实施例5中未纯化的高免血清和纯化后的高免血清，分别经0.22μm滤器过滤后按中华人民共和国兽药典三部(2015年版)进行中和效价检测以及中和试验。具体地：
A.将猪伪狂犬病病毒JS-A1、HB-98、HB-2000、Bartha-k61株分别稀释成每单位含200TCID50，与等量2倍系列稀释的被检测血清混合，置37℃下作用60分钟。
B.每稀释度接种6孔，单层Vero细胞
C.接种后，记录每组细胞存活数，有无细胞病变效应(CPE)。
D.按Reed-Muench法计算其半数保护量，然后计算该血清的中和效价。
2.结果
1)外源病毒抗原、抗体检测
通过该方法制备高免血清为猪瘟病毒、蓝耳病毒、圆环病毒、口蹄抗原和抗体阴性。
2)中和抗体效价
未纯化的高免血清中和抗体的效价大于等于1∶1024，纯化后的高免血清中和抗体的效价大于等于1∶2048。
3)中和试验结果
1ml未纯化的高免血清能中和106.0-6.5TCID50/头份猪伪狂犬病病毒(Bartha-k61株)、猪伪狂犬病病毒(HB-98株)、猪伪狂犬病病毒(HB-2000株)、猪伪狂犬病病毒(JS-A1株)。
1ml纯化后的高免血清能中和107.0-8.0TCID50/头份猪伪狂犬病病毒(Bartha-k61株)、猪伪狂犬病病毒(HB-98株)、猪伪狂犬病病毒(HB-2000株)、猪伪狂犬病病毒(JS-A1株)。
以上结果表明，本发明能够产生具有高免疫活性的伪狂犬病病毒血清，且具备高效价猪伪狂犬病病毒JS-A1、HB-98、HB-2000、Bartha-k61和JS-2012株的中和能力，完全能适应如今高效价伪狂犬活疫苗的检测。本发明的猪伪狂犬病病毒高免血清具有广泛的应用前景。
Claims (9)
1.一种猪伪狂犬病毒高免血清的制备方法，其特征在于：它是以猪为免疫对象，使用灭活疫苗进行一次基础免疫和两次加强免疫，再用猪伪狂犬病病毒进行一次攻毒后，采集血清，即得；
所述疫苗含有免疫增强剂；
所述免疫增强剂是由0.9％氯化钠缓冲液中加入干扰素α、干扰素β、黄芪多糖和巨噬细胞集落刺激因子配制成水相后，与吐温-60混合乳化制得；所述水相和吐温-60的体积比是(8～10)∶1；
每毫升所述水相含有0.1～100mg干扰素α、0.1～100mg干扰素β、0.1～200mg黄芪多糖和0.1～100mg巨噬细胞集落刺激因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水相中含有50mg/ml干扰素α、50mg/ml干扰素β、200mg/ml黄芪多糖和10mg/ml巨噬细胞集落刺激因子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水相和吐温-60的体积比是9∶1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭活疫苗是使用1体积份的免疫增强剂、49体积份灭活病毒和50体积份弗氏佐剂乳化混合而成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述弗氏佐剂在基础免疫时为弗氏完全佐剂，加强免疫时为弗氏不完全佐剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述猪伪狂犬病病毒为该病毒的JS-2012株、Bartha-k61株、HB-98株、HB2000和/或JS-A1株。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括血清纯化步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述血清纯化步骤为：
(1)0.45微米滤器过滤澄清，收集样品约95ml；
(2)准备纯化用缓冲液：缓冲液A、B和C；
(3)用缓冲液A平衡柱体至基线；
(4)上样，缓冲液A再平衡至基线；
(5)用缓冲液B洗脱至基线，每5ml收集样本1次，直到洗脱至基线。收集后的样品中加入1/10体积缓冲液C进行中和。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述缓冲液A含有0.15M NaCl和20mM磷酸盐，pH＝7.0；所述缓冲液B含有0.1M甘氨酸，pH＝3.0；所述缓冲液C含有1M的Tris-HCl，pH＝8.0。
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