CN112899329A - 一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法 - Google Patents

一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，属于生物蛋白制备技术领域。以结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177和/或CMCC93020为菌种，经扩增、灭活、盐析沉降、除菌过滤、检验、稀释及分装，得到结核菌素纯蛋白衍生物成品。解决现有技术中菌种对操作人员、环境危害大，对生产条件要求高等缺陷（P3生产车间），最终得到一种可用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的筛选、卡介苗接种后机体免疫反应的监测及流行病学监测使用的蛋白。

Description

一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法
技术领域
本发明涉及一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，尤其涉及一种以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra中结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177或/和CMCC93020生产结核菌素纯蛋白衍生物的方法，属于生物蛋白制备技术领域。
背景技术
结核病是一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，其中，结核分枝杆菌是结核病的致病菌。2019年全球结核病死亡人数140万，结核病依然是全球头号传染病杀手。据WTO发布的2020全球结核病年度报告：2019年全球结核病发病人数估计1000万左右(890-1100万)；其中，印度264万，占26％；印尼84.6万，占8.5％；中国83.3万，占8.4％。中国结核病人数世界排名第三，还是结核病高负担国家。
我国肺结核患病人数多，据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示：全国15岁以上人口活动性肺结核患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万，菌阳肺结核患病率为119/10万。据此，估算全国15岁以上人口现患的活动性肺结核、涂阳和菌阳患者数分别为499万、72万和129万；乡村肺结核患病率均明显高于城镇，西部地区活动性、涂阳和菌阳肺结核患病率均明显高于中部和东部地区。据官方统计，我国结核菌携带者约5.5亿，活动性非结核患者约500万。
因此，结核病的前期筛查和诊断成为结核病预防中最重要的一环。目前，市售的结核病诊断试剂主要为北京祥瑞生物制品有限公司生产的结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，以及，该公司于2019年01月11日公开了一种公开号为CN109182167A，名称为“一种高效价结核菌素皮试诊断试剂(PPD)生产工艺”的专利文献，其中，具体公开：包括菌培、灭活和沉降；菌培具体工艺为：工作种子菌种首先培养发育为干皱成团呈浅黄色的菌苔，菌苔镜检状态为短粗杆菌，微弯曲两端圆；然后再进行2代培养至多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时传代进行3代培养，3代培养至形成多皱微黄的菌膜后进行4代培养8-10周。该发明提供的一种富集ESAT-6和CFP10两种抗原的高效价PPD的生产工艺，通过该发明所述工艺制备的PPD效价高，且其中ESAT-6和CFP10含量高。但是，该产品菌种为结核分枝杆菌强毒株CMCC93009(H37Rv)，为二类病原微生物，对生产操作人员身体健康威胁很大，安全防护等级高，对环境潜在威胁大，如出现安全事故，将会是一场局部生态灾难。
随着科学技术的发展，安全要求的提高，此菌种前期申报的生产条件已经不能满足GMP的生产要求。而安全要求低、对生产操作人员威胁小、对环境影响小，用于制造结核菌素纯蛋白衍生物的菌种选择是本行业的发展趋势。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中结核菌素纯蛋白衍生物生产工艺的不足(主要是原料菌种缺陷)，而将结核分枝杆菌弱毒株(H37Ra)应用于制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法中，以及，根据该菌种提出了相匹配的制备方法，以解决现有技术中菌种对操作人员、环境危害大，对生产条件要求高等缺陷(P3生产车间)，最终得到一种可用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的筛选、卡介苗接种后机体免疫反应的监测及流行病学监测使用的蛋白。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，包括：
以结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177(H37Ra)或/和结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020(H37Ra)为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；
将菌液盐析沉降、酸变性沉降、脱盐超滤及除菌过滤，得到蛋白原液；
将蛋白原液检验、稀释及分装，得到结核菌素纯蛋白衍生物成品。
优选的，在所述扩增中，先进行全植物源固体培养基扩增，再进行半固体培养基扩增。其中，在全植物源固体培养基扩增中，制备大批量的菌体，实现大规模化生产，为后续批量化成品做准备；而在半固体培养基扩增中，便于收集菌体的代谢蛋白，一方面衔接全植物源固体培养基扩增中形成的大批量菌体，另一方面适应于后续蛋白原液以及成品的制备；
此外，全植物源固体培养基比动物源固体培养基(比如：动物源罗氏鸡蛋培养基)安全性高；而较传统液体培养基而言，采用半固体培养基，蛋白产量高(对于半固体培养基，30-60mg/100mL菌液；而对于传统液体培养基，＜10mg/100mL菌液)、培养时间短(对于半固体培养基，4-6周；而对于传统液体培养基，为8-10周)、操作简单(对于半固体培养基，菌液直接接种于土豆块上；而对于传统液体培养基，菌膜传代，细菌属于幼龄，传代时间点要求严格，且菌膜易下沉等)、传代次数少及变异风险低(传统液体培养基中的菌膜传代要多传2代以上)。
优选的，所述全植物源固体培养基为苏通土豆汤固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL、土豆汤940mL及琼脂粉20g；其中，优选苏通土豆汤固体培养基传代扩增接菌量不低于2.5mg/支，优选培养时间不低于3周；
所述半固体培养基为土豆苏通半固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL。分装500mL三角瓶，180mL瓶，每瓶放土豆块。
优选的，在所述盐析沉降中，灭活后的菌液先采用硫酸铵盐析沉降，再进行三氯乙酸酸变性沉降，保证成品中蛋白纯度可达到0.04mg以内(以每1mg结核菌素纯蛋白衍生物中含多糖与核酸的总量计)；反之，成品中蛋白纯度只达到0.09mg以内(以每1mg结核菌素纯蛋白衍生物中含多糖与核酸的总量计，《中国药典》现行版要求0.1mg以内)；
其中，硫酸铵盐析沉降1-3次，硫酸铵盐析沉降终饱和度为40-80％，硫酸铵盐析沉降1-4h，保证蛋白盐析沉降效率和质量；
三氯乙酸酸变性沉降3-5次，三氯乙酸酸变性沉降的浓度为2-4％，三氯乙酸酸变性沉降1-4h，保证蛋白酸变性沉降效率和质量。
优选的，在所述酸变性沉降中，采用三氯乙酸湿法洗菌液中杂质多糖。
优选的，在所述脱盐超滤中，采用截留分子量为3-50KD的超滤设备脱盐，脱除在沉降中引入的硫酸铵和三氯乙酸残留物，提高成品中蛋白纯度。
优选的，在所述除菌过滤中，采用孔径为0.2μm的除菌过滤设备，该精度的除菌过滤设备的进一步限定，有效提高成品中蛋白纯度。
优选的，所述结核菌素纯蛋白衍生物成品分装采用西林瓶和预灌封方式。
优选的，在所述稀释中，采用pH7.2-7.4、0.01mol/L的PBS溶液，PBS溶液包括0.0005％聚山梨酯-80。在传统的稀释过程中，采用了含3.0g/L苯酚和0.0005％聚山梨酯-80的的PBS溶液，其中，苯酚为三类致癌物，其增加了安全风险。
在本技术方案中，所制备的结核菌素纯蛋白衍生物为多组分复合蛋白，每1mg结核菌素纯蛋白衍生物中含多糖与核酸的总量小于0.05mg。利用结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177、结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020和卡介菌致敏的豚鼠，其引起的迟发性超敏反应24h和48h的结果均为阳性。因此，本结核菌素纯蛋白衍生物可用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的筛选、卡介苗接种后机体免疫反应的监测及流行病学监测。
在1928年F.Seibert首次提得PPD，1944年在美国以此种方法制备的PPD被WHO定为哺乳类国际标准结核菌素。1955年，WHO与联合国国际儿童基金会(ΜNICEF)委托丹麦血清研究所生产了一大批PPD产品，定名为PPD-RT23，是全球使用最为广泛的PPD产品。此产品使用的菌种是结核病患者的临床分离株，即H37Rv。
中国的结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)于1989年由中国药品生物制品检定所研制成功，菌种采用CMCC93009(H37Rv)，沿袭了世界卫生组织的传统做法。到目前为止，尚未发现有单位或个人以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra为菌种，用于制造结核菌素纯蛋白衍生物的研究。但随着GMP要求的提升，高致病性、高风险的病原微生物的生产要求越来越高，生产成本大幅提升，甚至到被迫停产的处境。低致病性、低风险的病原微生物成为行业趋势。
根据GMP的要求，“二类病原微生物”需要BSL-3防护等级，此防护等级建造成本高，运行和维护费用昂贵；目前国内只有唯一一家新冠疫苗是BSL-3防护等级。而“三类病原微生物”需要BSL-2防护等级，属于生物制药常规要求，建造、运行及维护成本不高。
此外，菌种全植物源固体培养基扩增和半固体培养基扩增的操作在生物安全柜内，但大部分遗漏出的菌体由通风系统带出生产场所，且生物安全柜内培养物需移至培养箱培养及其它带菌废物需要移至灭菌柜灭菌；这些操作不可避免会将部分菌体带至生产环境中，对操作人员的安全造成一定的威胁。而“三类病原微生物”对操作人员威胁比较小，而“二类病原微生物”对操作人员威胁大；生产场所的菌体通过通风系统经高效过滤器截留菌体后排出环境，但是高效过滤器一旦出现意外事故或管理不善，菌体将会泄露至自然环境，造成局部生态灾难。
在本技术方案中，结核菌素纯蛋白衍生物为结核病的前期筛查和诊断重要检测试剂。结核菌素纯蛋白衍生物是以结核分枝杆菌为菌种，通过固体培养基扩增，再通过半固体培养基扩增收集菌液内细菌代谢蛋白，经纯化后得到。
在结核菌素的生产工艺中，于1809年科赫以5％的甘油牛肉汤为培养基，经6-8周37℃培养后，加温100℃约1小时灭菌，然后进行过滤，再将滤液加热80℃蒸发，浓缩至原来体积的十分之一制成的；1932年F.Seibert用Long氏综合培养基培养，用三氯醋酸沉淀制成实验制品，称纯结核蛋白；1934年使用的纯结核菌素是用Dorset培养基培养6-8周，经100℃三小时杀死，每公斤加122毫升甘油，热浴蒸发浓缩至1/5，加石碳酸防腐，在冷室过滤，再用火棉胶膜超滤，10％三氯醋酸沉淀，去杂质，经无水乙醚脱水得晶体状纯结核蛋白。因其中可能仍有变性蛋白，故称为纯蛋白衍生物；1980年中国药品生物制品检定所，以结核分枝杆菌TB-H37Rv(CMCC93009)为菌种，使用罗氏鸡蛋培养基、苏通培养基、改良苏通培养基，经盐析纯化后得到了结核菌素纯蛋白衍生物；
上述中，结核菌素纯蛋白衍生物培养用培养基配方中都含有鸡蛋或者牛肉汤，即动物源培养基，而动物源物料其成分复杂，批检差异大，可能会引起不可预测的药品不良反应；受禽流感、疯牛病等传染病的影响也很大。罗氏鸡蛋培养基无法终端灭菌，为了降低培养基在配制过程中污染的几率，在配制过程中添加了孔雀石绿抑菌剂，孔雀石绿对人体具有潜在的致癌、致畸、致突变作用。
其中，对于苏通土豆汤固体培养基中土豆汤的制备方法：土豆削皮称重1000g，切成约10g的丁，饮用水清洗干净后放置锅内，加注射用水1000mL，煮沸腾后，小火煮30min，2层绸布趁热过滤，收集滤液，注射用水补足940mL；
其中，对于苏通土豆汤固体培养基的制备方法：按配方要求称取谷氨酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸、硫酸镁和柠檬酸铁铵，用土豆汤完全溶解；取甘油混合均匀，氨水调pH值至7.2-7.4；加琼脂粉，沸水浴至完全溶解，混合均匀。分装20mL小试管，9mL/支；硅胶塞封口后，置于温度121℃、时间20min高温灭菌后，摆放斜面，过夜凝固而成。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1)在本发明中，提供一种以结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177或/和CMCC93020为菌种、制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法，对操作人员、环境危害低，以及最生产车间安全等级要求低，生产成本低；
2)在本发明中，全生产均采用了植物源培养基，不受动物传染病的影响(如：罗氏鸡蛋培养基使用新鲜鸡蛋为细菌的主要营养源，但在禽流感或者鸡瘟发生时，鸡蛋来源不可控，极大的影响了菌种的扩增，以及后续产品质量和生产效率)，降低了安全风险，以及，提高了生产效率和产品质量。本发明中涉及的培养基配方成分简单，批间差异较小；本发明中涉及的培养基为终端灭菌，无需预培养，培养基无污染风险，效率高、即配即用；本发明所涉及的培养基配方中所有化学药品均是FDA、PMDA使用频率较高的生物用辅料，是经过时间验证对人体无危害的，而传统的罗氏鸡蛋培养基因其非终端灭菌，必须添加孔雀石绿抑菌剂，而此抑菌剂具有潜在的致癌、致畸及致突变缺陷，因此，本制备方法中涉及的培养基有效保证了结核菌素纯蛋白衍生物生产的安全性和稳定性；
3)在本发明中，通过菌液盐析沉降、除菌过滤等条件的控制，缩短结核菌素纯蛋白衍生物制备时间，且将具体的制备时间控制在5d内，间接的降低了制备过程的染菌风险；
4)在本发明中，在以蛋白原液制备成品的工序中，成品配方取消了三类致癌物(比如：苯酚防腐剂)，降低了安全风险；
5)在本发明中，结核菌素纯蛋白衍生物成品包装采用西林瓶和预灌封，降低了后处理中的安全风险。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在下述实施例中，涉及的结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177，来源于美国菌种收藏中心收藏；涉及的结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020，来源于中国医学细菌保藏管理中心。
在下述实施例中，涉及的培养基包括：
苏通培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL；
苏通土豆汤固体(斜面)培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL、土豆汤940mL及琼脂粉20g；
土豆苏通半固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL；分装500mL三角瓶，180mL瓶，每瓶放土豆块(其中，对于土豆块，采用专用工具切成端面25*25mm的方体)。
实施例1
一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，包括如下步骤：
A.种子批复苏
确认结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177菌种管外观无破损，开启种子批，苏通培养基将菌种稀释，混合均匀；采用苏通土豆汤固体斜面培养基，以接菌量0.5-5mg/支，铺满整个培养基斜面；在温度为36-38℃的条件下培养3-4周，得种子批复苏培养物；
B.种子批扩增
取种子批复苏培养物，加苏通培养基，洗脱，研磨，以离心力为15000g离心5min，离心弃上清，称重，计算菌液浓度；加苏通培养基，将菌液稀释；采用苏通土豆汤固体斜面培养基，以接菌量不低于0.5mg/支，铺满整个培养基斜面；在温度为36-38℃的条件下培养3-4周，得种子批扩增培养物；
C.菌液培养
取种子批扩增培养物，加苏通培养基，洗脱，研磨，以离心力为15000g离心5min，离心弃上清，称重，计算菌液浓度；加苏通培养基，将菌液稀释；采用土豆苏通半固体培养基，以接菌量不低于50mg/瓶，菌液铺满土豆面；在温度为36-38℃的条件下培养4-8周，得土豆苏通半固体培养物；
D.菌液高压灭菌
取土豆苏通半固体培养物，置于温度为121℃的条件下，高压灭菌20min；
E.菌液收集
取高压灭菌后的菌液，过滤脱除大部分菌体(比如：双层绸布)；以离心力为10000g离心10min，收集上清；
F.硫酸铵盐析沉降两次
取离心后的菌液，加入固体硫酸铵，完全溶解至终饱和度为40-80％，静置沉降2-24h，以离心力为10000g离心30min，收集沉淀；以pH7.3、浓度10mmol/L的PBS溶液溶解沉淀，以离心力为10000g离心30min，收集上清；
再重复上述操作1次，得粗蛋白液；
G.三氯乙酸酸变性沉降3-6次
取经硫酸铵沉降后的粗蛋白液，加入浓度为40％的三氯乙酸溶液，至粗蛋白液中三氯乙酸终浓度为2-4％，静置沉降1-4h，以离心力为5000g离心5min，收集沉淀；以pH8.4、浓度10mmol/L的PBS溶液溶解沉淀，离心力为5000g离心5min，收集上清；
再重复上述操作2-5次；
取经上述三氯乙酸沉降的粗蛋白液，加入浓度为40％的三氯乙酸溶液，至粗蛋白液中三氯乙酸终浓度为2-4％，静置沉降1-4h，以离心力为5000g离心5min，收集沉淀；以pH8.4、浓度10mmol/L的PBS溶液溶解沉淀，加1M氢氧化钠溶液调溶液pH值至8.0；以离心力为5000g离心5min，收集上清；
H.超滤脱盐
取经三氯乙酸沉降后的粗蛋白液，不低于4倍脱盐超滤浓缩，重复浓缩不低于5次；
I.除菌过滤
取脱盐后的粗蛋白液，以孔径0.2μm的滤芯除菌过滤，收集滤液，即得结核菌素纯蛋白衍生物原液；
G.半成品配制
根据原液标化的结果(50000IU/mg蛋白)，用pH7.3、浓度10mmol/L的PBS将原液稀释至活性50IU/mL；
K.成品分装
将半成品分装至2mL西林瓶中，1.1mL/瓶(10人份)，0.5mL预灌封，0.2mL/支(1人份)。
实施例2
一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，包括如下步骤：
A.种子批复苏
确认结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020菌种管外观无破损，开启种子批，苏通培养基将菌种稀释至浓度为10mg/mL，混合均匀；采用苏通土豆汤固体斜面培养基，以接菌量2.5mg/支，铺满整个培养基斜面；在温度为38℃的条件下培养3周，得种子批复苏培养物；
B.种子批扩增
取种子批复苏培养物，加苏通培养基，洗脱，研磨，以离心力为15000g离心5min，离心弃上清，称重，计算菌液浓度；加苏通培养基，将菌液稀释至100mg/mL；采用苏通土豆汤固体斜面培养基，以接菌量25mg/支，铺满整个培养基斜面；在温度为38℃的条件下培养3周，得种子批扩增培养物；
C.菌液培养
取种子批扩增培养物，加苏通培养基，洗脱，研磨，以离心力为15000g离心5min，离心弃上清，称重，计算菌液浓度；加苏通培养基，将菌液稀释至150mg/mL；采用土豆苏通半固体培养基，以接菌量150mg/瓶，菌液铺满土豆面；在温度为38℃的条件下培养4周，得土豆苏通半固体培养物；
D.菌液高压灭菌
取土豆苏通半固体培养物，置于温度为121℃的条件下，高压灭菌20min；
E.菌液收集
取高压灭菌后的菌液，过滤脱除大部分菌体(比如：双层绸布)；以离心力为10000g离心10min，收集上清；
F.硫酸铵盐析沉降两次
取离心后的菌液，加入固体硫酸铵，完全溶解至终饱和度为40％，静置沉降2-4h，以离心力为10000g离心30min，收集沉淀；以pH7.3、浓度10mmol/L的PBS溶液溶解沉淀，以离心力为10000g离心30min，收集上清；
再重复上述操作1次，得粗蛋白液；
G.三氯乙酸酸变性沉降四次
取经硫酸铵沉降后的粗蛋白液，加入浓度为40％的三氯乙酸溶液，至粗蛋白液中三氯乙酸终浓度为3-4％，静置沉降1-2h，以离心力为5000g离心5min，收集沉淀；以pH8.4、浓度10mmol/L的PBS溶液溶解沉淀，离心力为5000g离心5min，收集上清；
再重复上述操作2次；
取经上述三氯乙酸沉降的粗蛋白液，加入浓度为40％的三氯乙酸溶液，至粗蛋白液中三氯乙酸终浓度为3-4％，静置沉降1-2h，以离心力为5000g离心5min，收集沉淀；以pH8.4、浓度10mmol/L的PBS溶液溶解沉淀，加1M氢氧化钠溶液调溶液pH值至8.0；以离心力为5000g离心5min，收集上清；
H.超滤脱盐
取经三氯乙酸沉降后的粗蛋白液，4倍脱盐超滤浓缩，重复浓缩7次；
I.除菌过滤
取脱盐后的粗蛋白液，以规格2.5英寸、孔径0.2μm的滤芯除菌过滤，收集滤液，即得结核菌素纯蛋白衍生物原液；
G.半成品配制
根据原液标化的结果(50000IU/mg蛋白)，用pH7.3、浓度10mmol/L的PBS将原液稀释至活性50IU/mL；
K.成品分装
将半成品分装至2mL西林瓶中，1.1mL/瓶(10人份)，0.5mL预灌封，0.2mL/支(1人份)。
实施例3
基于实施例1，本实施例就生产过程中的控制条件进行讨论，以对本技术方案作进一步的说明。
(1)苏通土豆汤固体斜面培养基扩增接菌量
设置接菌量0.5mg/支、1mg/支、2.5mg/支和5mg/支，在相同培养条件下，所得结果如下表1所示，并得知：随着接菌量的增加，菌体产量在增加；具体接菌量可根据生产规模、传代次数及扩增质量决定；
表1
接菌量 菌体产量(mg)
0.5mg/支 118
1mg/支 168
2.5mg/支 235
5mg/支 365
(2)苏通土豆汤固体斜面培养基扩增培养时间
设置培养时间3周和4周，在相同培养条件下，所得结果如下表2所示，并得知：随着培养时间的增加，菌体产量在增加；具体培养时间可根据生产情况及扩增质量决定；
表2
培养时间 菌体产量(mg)
3周 473
4周 492
(3)土豆苏通半固体培养基接菌量
设置接菌量50mg/瓶、100mg/瓶和150mg/瓶，在相同培养条件下，所得结果如下表3所示，并得知：随着接菌量的增加，蛋白产量在增加；具体接菌量可根据生产规模、传代次数及扩增质量决定；
表3
接菌量 蛋白产量(mg)
50mg/瓶 34.41
100mg/瓶 35.15
150mg/瓶 38.53
(4)苏通土豆汤固体斜面培养基扩增培养时间
设置培养时间4周、6周和8周，在相同培养条件下，所得结果如下表4所示，并得知：随着培养时间的增加，蛋白产量在增加；具体培养时间可根据生产情况及扩增质量决定；
表4
培养时间 蛋白产量(mg)
4周 31.00
6周 40.07
8周 52.83
(5)硫酸铵盐析沉降时间
设置硫酸铵盐析沉降时间分别为2h、4h、6h、12h、18h和24h，所得结果如下表5所示，并得知：在不同沉降时间限定下，收集的沉降重量差异不大，可根据实际生产情况选择沉降时间；
表5
沉降时间 不溶物重量(mg)
2h 29.4
4h 28.1
6h 29.9
12h 31.2
18h 30.7
24h 29.2
(6)硫酸铵盐析沉降终饱和度
设置硫酸铵盐析沉降终饱和度分别为40％、60％及80％，所得结果如下表6所示，并得知：随着硫酸铵盐析沉降终饱和度的增加，蛋白收率增高，纯度下降，但均满足《中国药典》的要求；
表6
Figure BDA0002929970330000101
Figure BDA0002929970330000111
(7)硫酸铵盐析沉降次数
设置硫酸铵盐析沉降次数分别为1次、2次和3次，所得结果如下表7所示，并得知：随着硫酸铵盐析沉降次数的增加，蛋白收率在下降，蛋白纯度在增加，但均满足《中国药典》的要求；
表7
沉降次数 1次 2次 3次
蛋白活性 符合要求 符合要求 符合要求
蛋白纯度 91％ 92％ 94％
mg/100mL菌液 59.655 58.621 55.517
(8)三氯乙酸盐析沉降时间
设置三氯乙酸盐析沉降时间分别为1h、2h、3h及4h，所得结果如下表8所示，并得知：在不同沉降时间限定下，收集的沉降重量差异不大，可根据实际生产情况选择沉降时间；
表8
沉降时间 不溶物重量(mg)
1h 27.5
2h 27.6
3h 28.9
4h 28.1
(9)三氯乙酸盐析沉降浓度
设置三氯乙酸盐析沉降浓度分别为2％、3％及4％，所得结果如下表9所示，并得知：随着三氯乙酸盐析沉降浓度的增加，蛋白收率提高，蛋白纯度差异不大，但均满足《中国药典》的要求；
表9
三氯乙酸浓度 2％ 3％ 4％
蛋白活性 符合要求 符合要求 符合要求
蛋白纯度 91％ 92％ 92％
mg/100mL菌液 51.707 52.352 56.725
(10)三氯乙酸盐析沉降次数
设置三氯乙酸盐析沉降次数分别为3次、4次、5次及6次，所得结果如下表10所示，并得知：随着三氯乙酸盐析沉降次数的增加，蛋白收率在降低，蛋白纯度有一定程度的下降，但均满足《中国药典》的要求；
表10
洗多糖次数 3次 4次 5次 6次
蛋白活性 符合要求 符合要求 符合要求 符合要求
蛋白纯度 92％ 93％ 91％ 91％
mg/100mL菌液 58.345 56.794 54.007 52.265
(11)超滤截留分子量
设置超滤截留分子量3KD、10KD、30KD和50KD，所得结果如下表11所示，并得知：随着超滤截留分子量的增加，蛋白损失率在增加，蛋白纯度差别不大，但均满足《中国药典》的要求。
表11
超滤截留分子量 3KD 10KD 30KD 50KD
蛋白活性 符合要求 符合要求 符合要求 符合要求
蛋白纯度 94％ 93％ 93％ 94％
蛋白损失率 5％ 11％ 30％ 51％
实施例4
基于实施例1-2，本实施例对所得结核菌素纯蛋白衍生物进行检测，以对本技术方案作进一步的说明。
一、结核菌素纯蛋白衍生物原液外观
微黄色至棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。
二、原液纯度
蛋白检测：按照《中国药典》现行版(通则0731第二法)检测蛋白含量；
多糖检测：按照《中国药典》现行版(结核菌素纯蛋白衍生物篇)检测多糖含量；
核酸检测：按照《中国药典》现行版(通则0401)检测核酸含量；
所得结果如下表12所示，得知：每1mg结核菌素纯蛋白衍生物中含多糖与核酸的总量不高于0.1mg。
表12结核菌素纯蛋白衍生物原液纯度检测结果
Figure BDA0002929970330000131
三、原液效价
按照《中国药典》现行版(结核菌素纯蛋白衍生物篇)测定原液效价，结果如下表13-14所示，得知：50000IU/1mg蛋白质。
表13结核菌素纯蛋白衍生物原液效价检测结果(ATCC25177)
Figure BDA0002929970330000132
表14结核菌素纯蛋白衍生物原液效价检测结果(CMCC93020)
Figure BDA0002929970330000133
Figure BDA0002929970330000141
四、无菌检查
按照《中国药典》现行版(通则1101)无菌检查，得知：原液无菌。
五、无分支杆菌试验
量取1.0mL本品原液，分别接种于10支罗氏鸡蛋培养，于37℃培养4周，均无分支杆菌生长。
六、致敏效应试验
试验组与对照组分别选用体重300-400g未做过任何试验的豚鼠各3只，试验组每只豚鼠皮内注射0.1mL含500IU本品，共3次，每次间隔5天；且在第3次注射后15天，试验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.1mL含500IU本品，连续观察3天，得知：两组动物反应无明显区别。
综上所述，所得结果如表15-16所示：
表15结核菌素纯蛋白衍生物原液质量检测结果
Figure BDA0002929970330000142
Figure BDA0002929970330000151
表16结核菌素纯蛋白衍生物成品检测结果
Figure BDA0002929970330000152
Figure BDA0002929970330000161
实施例5
基于实施例1，本实施例讨论结核菌素纯蛋白衍生物对结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
S1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
S2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
S3：致敏源
取结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177致敏源(50mg/mL)115℃灭菌20min，与等体积弗氏不完全佐剂混合并充分乳化(25mg/mL)。
S4：致敏
腹股沟两侧各注射0.1mL致敏源菌液(25mg/mL)，致敏后五周可进行皮肤试验。
S5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物中检院国家标准品(50IU/mL)0.2mL、市售品(北京祥瑞，50IU/mL)0.2mL和本品(50IU/mL)0.2mL，分别记录24h、48h各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知：本品和国家标准品、市售品诱导迟发型超敏反应基本完全一致。
综上所述，所得结果如下表17所示：
表17结核菌素纯蛋白衍生物对结核分枝杆菌弱毒株致敏动物实验结果
Figure BDA0002929970330000162
Figure BDA0002929970330000171
实施例6
基于实施例1，本实施例讨论结核菌素纯蛋白衍生物对卡介菌D2PB302致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
Y1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
Y2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
Y3：致敏源
取卡介菌D2PB302致敏源(10mg/mL)，用0.9％NaCl溶液将卡介菌菌液稀释至5mg/mL。
Y4：致敏
腹股沟两侧各注射0.5mL致敏源菌液(5mg/mL)，致敏后五周可进行皮肤试验。
Y5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物中检院国家标准品(50IU/mL)0.2mL、市售品(北京祥瑞，50IU/mL)0.2mL和本品(50IU/ml)0.2mL，分别记录24h、48h各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知：本品比国家标准品、市售品诱导迟发型超敏反应灵敏度更高一些。
综上所述，所得结果如下表18所示：
表18结核菌素纯蛋白衍生物对卡介菌D2PB302致敏动物实验结果
Figure BDA0002929970330000172
Figure BDA0002929970330000181

Claims (9)

1.一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，包括：以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；
将菌液盐析沉降、酸变性沉降、脱盐超滤及除菌过滤，得到蛋白原液；
将蛋白原液检验、稀释及分装，得到结核菌素纯蛋白衍生物成品。
2.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra中的结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177或/和结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020为菌种。
3.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述扩增中，先在全植物源固体培养基中进行扩增，再在半固体培养基中进行扩增。
4.根据权利要求3所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，所述全植物源固体培养基为苏通土豆汤固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL、土豆汤940mL及琼脂粉20g；
所述半固体培养基为土豆苏通半固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL；
分装500mL三角瓶，180mL瓶，每瓶放土豆块。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述沉降中，灭活后的菌液先采用硫酸铵盐析沉降，再进行三氯乙酸酸变性沉降；
其中，硫酸铵盐析沉降1-3次，硫酸铵盐析沉降终饱和度为40-80%，硫酸铵盐析沉降2-24h；
三氯乙酸酸变性沉降3-5次，三氯乙酸酸变性沉降浓度为2-4%，三氯乙酸酸变性沉降1-4 h。
6.根据权利要求5所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述三氯乙酸酸变性沉降中，采用三氯乙酸湿法洗菌液中杂质多糖。
7.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述脱盐超滤中，采用截留分子量为3-50KD的超滤设备。
8.根据权利要求1或7所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述除菌过滤中，采用孔径为0.2μm的除菌过滤设备。
9.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述稀释中，采用pH7.2-7.4、0.01mol/L 的PBS溶液，PBS溶液包括0.0005%的聚山梨酯-80。
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