CN111574625A - 抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法和应用 - Google Patents

抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：将鸡滑液囊支原体菌株复苏后，增殖培养三代后，充分灭活，离心取沉淀，获得鸡滑液囊支原体抗原。将鸡滑液囊支原体抗原溶液与白油佐剂混合乳化，对每只母鸡进行基础免疫，注射0.5ml；在基础免疫后,进行两次加强免疫，免疫方法和剂量与基础免疫相同。第一次加强免疫后开始收集免疫鸡蛋，将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集卵黄，纯化后获得特异性卵黄抗体。通过上述方法制备得到的抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体，能够有效预防和治疗鸡滑液囊支原体疾病。易于大规模生产，成本低廉，得到的产品是一种安全的抗鸡滑液囊支原体疾病的制剂。

Description

抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法和应用。
背景技术
鸡滑液囊支原体疾病是一种由鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)引起的禽类的一种急性或慢性传染病。以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为特征，由此得名滑液囊支原体。MS主要感染商品蛋鸡、肉鸡和种鸡，鸡只感染后会导致明显的跛行、生长发育迟缓及胴体降级。20世纪50年代美国首次报道了MS感染，随后在澳大利亚、亚洲、非洲、南美洲相继报导了该病的发生。MS感染还会引起家禽亚临床呼吸道症状、关节炎、滑膜炎、气囊炎、生殖道炎和鸡蛋尖端综合征，给全球肉鸡行业造成了巨大的经济损失。除了气囊炎和关节炎外，该病蛋壳尖畸形和滑膜感染引起的减蛋综合征在全世界范围内造成了巨大的经济损失。我国MS的感染和流行是从南方的黄羽肉鸡开始，经过检测发现是MS，后来蛋鸡和白羽肉鸡也相继出现MS感染。临床表现出腿病、呼吸道症状、死淘率高、生产性能降低、屠宰废弃率高。该病直接导致中国家禽养殖场养殖损失上百万只鸡，而且本病一旦与其他疾病发生继发感染会。引起更高的死淘率甚至难以防控的局面，流行病学调查显示近些年来该病的发病率呈逐渐上升趋势。
MS主要通过接触进行传播，而且一旦感染终身带菌，目前尚无有效的治疗手段，抗生素治疗可以显著降低MS的感染水平，挽回疾病带来的损失，但无法根除MS，一旦停药感染可能会立即加重，而过量用药不仅会使动物产生依赖性，还会增加MS的耐药性并造成药物残留问题，所以药物治疗在生产上的使用越来越受到限制。预防接种是控制支原体感染的一个长期解决方案，遗憾的是目前只有澳大利亚有经突变选育的一种弱毒苗，该疫苗免疫效果已经得到研究证实，但由于该疫苗是活苗，与支原体清除计划产生冲突，在很多国家被禁用，国内尚无商品化的支原体疫苗上市。近年来卵黄抗体(lgY)作为抗生素的替代品，由于其无残留、无毒副作用、绿色安全的特点引起了人们的广泛关注。卵黄抗体是鸡被外来抗原刺激后，所产生的特异性抗体聚集在卵黄内，通过相应技术对卵黄抗体进行提取，制成卵黄抗体制剂。家禽免疫系统的特性决定小剂量的抗原便可发挥作用，因此可以用少量抗原在较长时间获得大量高滴度特异性抗体。一个母鸡每年大约能产280枚鸡蛋，每个卵黄里面含有100～150mg IgY，因此每只鸡每年能够产生40g特异性卵黄抗体，具有很大的生产潜力。因此，与其他哺乳动物制备多克隆抗体相比，特异性IgY制备有着经济、易操作、产量大等优点。
随着研究的深入，国内外学者发现利用卵黄抗体可以预防和治疗畜禽的各种疾病，如IBD、ND以及鸭病毒性肝炎等，而且取得了良好的效果。所以应用卵黄抗体替代抗生素治疗MS疾病是切实可行的，因此研制抗MS的特异性卵黄抗体，对于鸡滑液囊支原体疾病的防治具有重要意义。
发明内容
本申请的目的之一在于提供一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法；
本申请的目的之二在于提供一种由上述制备方法制备得到的抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体；
本申请的目的之三在于提供一种利用上述抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体的应用。
本申请的目的是通过以下技术方案实现的：
一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法，包括以下步骤：
将鸡滑液囊支原体菌株复苏后，按10％比例在液体培养基上增值培养三代后，测定培养基上的菌体浓度，当菌体浓度达到109ccu/ml以上时，用0.4％的甲醛充分灭活，离心取沉淀，获得鸡滑液囊支原体抗原；
选取20周龄产蛋母鸡，将鸡滑液囊支原体抗原经3次洗涤后，用PBS缓冲液稀释，得到鸡滑液囊支原体抗原溶液，将鸡滑液囊支原体抗原溶液与白油佐剂按照体积比1:1混合乳化，首次基础免疫采用皮下多点注射免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；在基础免疫后的第4周进行第一次加强免疫，在基础免疫后的第6周进行第二次加强免疫，免疫方法和剂量与所述基础免疫相同；第一次加强免疫后开始收集免疫鸡蛋，存放于4℃；
将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集卵黄，纯化后获得特异性卵黄抗体。
所述液体培养基采用改良Frey氏液体培养基。
一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体。
一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体在预防和治疗鸡滑液囊支原体疾病上的应用。
由以上技术方案可知，本申请提供了一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法及其应用。通过上述方法制备得到的抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体具有较强特异性，能够有效预防和治疗鸡滑液囊支原体疾病。无毒副作用，本发明所述的方法易于大规模生产，成本低廉，工艺简单，得到的产品是一种非常安全有效的抗鸡滑液囊支原体疾病的制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为BSA标准曲线图；
图2为感染后鸡的体温变化图；
图3为阳性对照组的关节、胸部龙骨、肝脏及脾脏的剖检图；
图4为阴性对照组的关节、胸部龙骨、肝脏及脾脏的剖检图；
图5为实验组的关节、胸部龙骨、肝脏及脾脏的剖检图；
图6为阳性对照组、阴性对照组和实验组的肝脏，肺脏及气管的显微结构图。
具体实施方式
实施例1：鸡滑液囊支原体抗原的制备
一、材料与方法
1.1菌株和实验动物
鸡滑液囊支原体菌株来自宁夏大学农学院临床兽医实验室；20周龄海蓝褐雏鸡10只，由宁夏晓鸣禽业有限公司提供。
1.2培养基和试剂
改良Frey氏培养基，购自北京中海生物科技有限公司；Marcol-52白油佐剂，购自南京天邦生物科技有限公司；普通营养琼脂培养基和鲜血琼脂培养基；均购自青岛海博生物科技有限公司。
1.3鸡滑液囊支原体菌体浓度的测定
菌株复苏后，按10％的接种量接种于改良Frey氏液体培养基，于37℃恒温震荡培养。期间每隔5h采用颜色变化单位法(CCU)测定菌体浓度，要求达到109ccu/ml以上。传代培养至少传3代，每代培养2～3d。最后取2ml进行固体培养和PCR鉴定，保证所培养的菌液无任何杂菌污染方可。
1.4鸡滑液囊支原体抗原的制备
将达到指定菌浓度的菌液按10％的比例扩大培养，37℃振荡培养4～5d，然后在菌液中加入终浓度为0.4％的甲醛，置于37℃的CO2培养箱中灭活2～3d，期间每隔几小时摇动培养基使其充分灭活。收集灭活后的液体培养物，4℃离心(10000rpm)30min，弃去上清液，收集沉淀，沉淀用适量的PBS(磷酸盐缓冲液)重悬菌液，重复上述步骤，离心、弃上清液。洗涤3次后用适量的PBS(磷酸盐缓冲液)悬浮为鸡滑液囊支原体抗原悬液。抗原悬浮液进行灭活检验，检测合格后置于-20℃保存备用。
1.5鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备及检测
将制备好的鸡滑液囊支原体抗原悬液利用核酸蛋白分析仪测定菌体蛋白含量，并稀释成合适的浓度，然后加入等体积白油佐剂边加边振荡使其充分混匀，再用超声波破碎仪使其完全乳化，制成油包水型油乳疫苗。
将制备好的疫苗进行无菌检测、稳定性试验和安全性试验。
二、实施效果
在改良Frey氏液体培养基中生长3～5d，培养基颜色略微变为橙黄色，澄清透明；在固体培养基中生长3～5d，可形成针尖状大小且具有明显中心脐的透明小菌落，显微镜下呈油煎蛋状，菌体姬姆萨染色呈蓝色或蓝紫色。
抗原悬液灭活检验：取抗原悬液接种于改良Frey氏固体培养基并置于37℃、5％浓度CO2培养3～5d，观察未见鸡滑液囊支原体典型“煎蛋样”菌落，表明灭活完全。
疫苗无菌检验：将疫苗分别接种普通营养琼脂培养基和鲜血琼脂培养基，在37℃、5％CO2培养3～5d，观察均无杂菌生长。
疫苗稳定性试验：取疫苗10ml置于离心管，1000rpm/min离心5min，未见将疫苗析出水相；将疫苗置于4℃，观察放置后的1d、3d、7d、30d，均未出现分层现象。说明所制备的疫苗稳定性好。
疫苗安全性试验：雏鸡每只肌注0.2mL，观察其精神状态良好、采食正常，注射部位均正常，未见化脓及红肿现象。证明疫苗安全可靠。
疫苗抗原的最终浓度：白油佐剂混合的疫苗为0.8mg/ml。
实施例2：抗鸡滑液囊支原体特异性卵黄抗体的制备
一、材料与方法
1.1主要试剂与仪器
鸡滑液囊支原体菌株，由宁夏大学临床兽医实验室分离并保存；Marcol-52白油佐剂，购自南京天邦生物科技有限公司；无水硫酸钠(分析纯)；羫丙基甲基纤维素邻苯二甲酸(HPMCP)；鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒(编号为CK118)，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；兔抗鸡IgY，蛋白marker均购自Pierce公司；改良Frey氏培养基，购自北京中海生物科技有限公司；
1.2实验动物和免疫
实验动物：20周龄海蓝褐产蛋鸡30只(非鸡滑液囊支原体感染)，由宁夏晓鸣禽业有限公司提供。
选取MS抗体检测结果为阴性的蛋鸡30只，随机分为2组，每组15只，分别为实验组(P1)和阴性对照组(P0)，对照组单独饲养。规律产蛋后进行基础免疫，采用胸腹部肌肉注射，剂量为P1组0.05mg；P0组注射1.0mL生理盐水。加强免疫时间分别在首免后第4周和第6周进行，注射剂量与首次免疫相同。
1.3血清和鸡蛋的收集
基础免疫前一周开始，每间隔一周采血一次并分离血清，编号并保存于-20℃冰箱备用；收集首免后的鸡蛋，并按周编号保存于4℃冰箱中备用。
1.4血清抗体水平的监测
按照鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒说明书对血清MS抗体进行检测。
1.5卵黄抗体的分离与粗提
采用水稀释法对IgY进行分离，鸡蛋首先采用0.1％的新洁尔灭浸泡30min，再利用75％酒精擦拭蛋壳，然后在无菌操作箱内打开鸡蛋，用卵黄分离器分离卵黄，然后用10mL无菌注射器针头挑破卵黄膜吸取卵黄液。每10mL卵黄液中加入70mL无菌水，再加入0.25％的羟丙基邻苯二甲酸并充分搅拌均匀。将稀释后的卵黄抗体置于-20℃冰箱中进行冷冻，然后室温融解，反复冻融三次后经10000g，4℃离心30min，取其上清液，上清液即为水溶性卵黄抗体。采用硫酸钠二次盐析法进行粗提，具体步骤为：向水溶性卵黄抗体中加入19％的硫酸钠，室温充分搅拌均匀，10000g，4℃离心30min，取沉淀，用PBS悬浮至原体积的1/2。再次加入14％的硫酸钠，重复上述步骤即得到粗提后的IgY。
1.6IgY的提纯
首先用透析袋对IgY进行透析，将粗提后的IgY溶液装入透析袋中，将透析袋置入PBS(PH7.8)缓冲液中。4℃条件下，每2h更换一次缓冲液。每更换一次透析液用1％BaCl2检测一次，无白色沉淀析出即表示透析完成。采用截留分子量为20kD的密理博超滤离心管，对透析后的lgY溶液进行超滤4000g，20min，收集过滤器上方的溶质，将溶质用PBS重新悬浮至原体积；再用截留分子量为100kD的超滤器进行超滤，收集离心管下方的超滤液。将超滤后的lgY溶液利用0.22μm的一次性过滤器过滤除菌，分装后保存于-20℃冰箱中备用。
1.7卵黄抗体效价的检测
按照鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒说明书对提纯后的抗鸡滑液囊支原体特异性IgY进行效价的检测。
1.8BCA法测定IgY浓度
采用Pierce BCA Protein Assay Kit试剂盒测定纯化后IgY的蛋白浓度。
二、实施结果
以标准蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示，在0-2000μg/mL范围内，标准曲线回归方程为y＝0.0009x+0.0352，R2＝0.9998，结果符合朗伯比尔定律，表明线性良好，可用于提纯后IgY蛋白含量的测定。将待测样品稀释至合适浓度，测定方法同标准曲线，读取待测样品在562nm处的吸光值，再根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度7.12mg/m，最高效价达到了1：125000。
实施例3：抗鸡滑液囊支原体特异性卵黄抗体注射液应用效果评价
一、试验步骤与方法
1.鸡滑液囊支原体病理模型的建立
1.1攻击用菌悬液的制备
用改良Frey氏培养基，复苏和培养鸡滑液囊支原体菌株，传三代后进行扩大培养，待菌液浓度达到106CCU/mL时停止培养，10000r/min离心25min，弃上清取沉淀，用PBS缓冲液洗涤三次后重悬为原体积作为攻击用菌悬液。
1.2试验动物的分组与攻毒
选取50只5周龄滑液囊支原体抗体检测为阴性的健康雏鸡作为试验动物，分为3组，实验组(30只)和阴性对照组(10只)和阳性对照组(10只)。实验组和阳性对照组通过滴鼻(0.3mL)、滴眼(0.2mL)的方式进行接种，每天接种一次，连续接种三天。阴性对照组接种同等剂量的无菌生理盐水。阴性对照组单独隔离饲养，避免MS感染。
1.3感染后体温的监测
攻毒后连续15d观察鸡的临床症状并记录直肠温度，判断是否发病的标准为：抗体检测为阳性、病鸡出现跛行的同时伴有鸡冠苍白、排绿色稀便及罗音三个症状中的任何一个症状即可判断为发病。
2鸡滑液囊支原体病的治疗试验
实验组和阳性对照组出现MS感染典型症状时开始特异性卵黄抗体注射液的治疗试验。实验组分为三个剂量组，低剂量组，中剂量组和高剂量组，每组10只。选取抗体效价达105以上的卵黄抗体进行治疗试验，胸腹部肌肉注射，高、中、低剂量组(P1,P2,P3)注射剂量分别为0.5、1.0、1.5mL。每间隔一天注射一次，共注射3次。对照组按同样的方式注射隔离盐水。
2.1治疗后鸡滑液囊支原体的鉴定
剖检的同时无菌操作取咽拭子和关节液，用改良Frey氏固体培养基进行鸡滑液囊支原体分离培养试验。
2.2病理剖检与石蜡切片的制作
感染后28d，取血清和咽拭子，每组选取5只鸡进行剖检，记录剖检病变，并取组织固定于10％福尔马林溶液，固定7d后，进行病理切片的制作。
二结果与分析
1感染后雏鸡体温变化
参见图2，经鸡滑液囊支原体Q5-2菌株强毒攻击后，阴性对照组(P1)体温一直维持在39.9～42.0℃之间，在鸡的正常体温范围内。实验组和阳性对照组在攻毒后第一天开始迅速上升，并始终保持在43℃左右，最高体温分别为44.14℃和43.42℃。体温均高于正常值且与阴性对照组差异显著(P<0.05)。
2鸡剖检病变及病理组织学观察
参见图3，PC组剖检发现跗关节剖开后有浓稠黄色粘性渗出物，龙骨突处粘液囊肿大，有脓性渗出物，周围组织呈干酪样附着，肝脏淤血肿大、脾脏肿大。参见图4，NC组鸡跗关节正常，无粘性渗出物，龙骨突正常，肝脾为正常大小，未见异常(见图5)。实验组(P1、P2、P3组)中，P1组中有个别鸡龙骨突粘液囊肿大，有脓性渗出物，喉头气管有出血现象，P2、P3组未见明显异常。NC组肝索排列正常，肝细胞未见异常；PC组肝索排列紊乱，中央静脉及静脉窦中充满红细胞，肝细胞肿胀变形，细胞质成玻璃样变性，间质伴有淋巴细胞浸润，肺泡壁毛细血管扩张充盈，出血，肺泡间隔断裂。实验组肝索排列正常，间质中伴有少量炎性细胞浸润，肝细胞未见明显异常，气管固有层出血，纤毛脱落，不完整，鳞状上皮化生。实验组，肝脏，肺脏，气管未见明显异常(见图6，其中A1 B1 C1为NC组，A2 B2 C2为PC组，A3 B3 C3为实验组)。
3鸡滑液囊支原体分离培养试验
治疗结束后采集各组鸡咽拭子进行鸡滑液囊支原体分离培养试验，结果见表1,与PC组相比，三个剂量组咽拭子分离为阳性的动物数量明显减少，说明该注射液对感染动物的排毒也有一定的抑制作用，其中低剂量组效果最好。
表1鸡滑液囊支原体分离培养
Figure BDA0002496419400000071
综上所述，利用本发明所获得的鸡滑液囊支原体卵黄抗体注射液对发病鸡治疗后，与PC组相比剖检和病理切片观察发现，发病鸡的症状得到了明显改善，治疗后咽拭子MS分离培养结果表明，三个剂量组咽拭子和关节液分离为阳性的动物数量明显减少，说明该注射剂对感染动物的排毒也起到一定的抑制作用。说明，本发明的鸡滑液囊支原体卵黄抗体对于鸡滑液囊支原体病原的预防具有良好的效果，且该卵黄抗体相比抗生素有着成本低、无毒、无害、无残留、无污染且使用方便等突出优点，建议注射剂量为1.5mL/只。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

Claims (4)

1.一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鸡滑液囊支原体菌株复苏后，按10％比例在液体培养基上增值培养三代后，测定培养基上的菌体浓度，当菌体浓度达到109ccu/ml以上时，用0.4％的甲醛充分灭活，离心取沉淀，获得鸡滑液囊支原体抗原；
选取20周龄产蛋母鸡，将鸡滑液囊支原体抗原经3次洗涤后，用PBS缓冲液稀释，得到鸡滑液囊支原体抗原溶液，将鸡滑液囊支原体抗原溶液与白油佐剂按照体积比1:1混合乳化，首次基础免疫采用皮下多点注射免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；在基础免疫后的第4周进行第一次加强免疫，在基础免疫后的第6周进行第二次加强免疫，免疫方法和剂量与所述基础免疫相同；第一次加强免疫后开始收集免疫鸡蛋，存放于4℃；
将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集卵黄，纯化后获得特异性卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的一种抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体制备方法，其特征在于，所述液体培养基采用改良Frey氏液体培养基。
3.一种根据权利要求1所述的制备方法制备得到的抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体。
4.根据权利要求3所述的抗鸡滑液囊支原体疾病的特异性卵黄抗体在预防和治疗鸡滑液囊支原体疾病上的应用。
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