CN102796710A - 无致病性的重组减毒狂犬病毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无致病性的重组减毒狂犬病毒株及其构建方法和应用，属于生物疫苗领域，本发明的方法是将狂犬病固定毒经逆向遗传学克隆产生重组的狂犬病毒，其中狂犬病毒糖蛋白上决定免疫原性或致病性的位点的氨基酸333(Arg333→Gln)和164(Asp164→Ser)位点经过定点突变，使其致病性降低，回复毒力返阻风险率降低，更优选的，是将该突变的糖蛋白基因双拷贝化，实验结果证明，由本发明方法制备得到的重组狂犬病毒株可用于制备低廉、适于口服或注射的狂犬病疫苗。

Description

无致病性的重组减毒狂犬病毒株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一株无致病性的重组减毒狂犬病毒株，还涉及该病毒株的构建方法和应用，本发明利用逆向分子生物技术设计重组活疫苗，在细胞基质中增殖，经冷冻干燥可制备高效的狂犬病疫苗。本发明属于生物疫苗领域。

背景技术

狂犬病病毒属于弹状病毒科，是一种不分阶段RNA病毒，其基因组编码五种蛋白:RNA依赖的RNA酶（L），核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、外膜蛋白（G）。

狂犬病通过动物咬伤或抓伤传播，沿外围神经至神经中枢引起细胞功能损伤和感染动物的死亡，可逃避免疫识别。

机体抗狂犬病毒的免疫主要是狂犬病病毒糖蛋白诱导产生的中和抗体和CD₄ ⁺、CD₈ ⁺细胞免疫。机体内在的防御机制在狂犬病免疫应答也重要作用，包括活疫苗L、N和P蛋白引起的保护性免疫。

抗病毒免疫与致病性相关，与病毒糖蛋白表达水平相关，尽管糖蛋白表达水平与免疫增效的关系不甚清楚，但糖蛋白基因保留了非嗜神经性基因片段和高效复制的基因片段，使重组活病毒具有更高效的安全性和免疫原性，与传统活疫苗相比，用该重组病毒生产的疫苗具有安全、高效、低廉、方便使用的特点。

发明内容

本发明利用逆向遗传学技术，对国内外的减毒活疫苗株进行定向突变，降低了减毒疫苗株的致病性，提高了病毒在细胞基质中的复制水平，因而增强了免疫原性和病毒基因的稳定性。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，本发明提供了一种制备无致病性的重组减毒狂犬病毒的方法，其特征在于将狂犬病毒基因组中的糖蛋白基因进行以下位点的突变：Arg333→Gln，Asp164→Ser。即将狂犬病毒基因组中的糖蛋白基因中的第333位的Arg突变为Gln，将位于第164位的Asp突变为Ser。

在本发明所述的方法中，优选的，是使所述的重组减毒狂犬病毒基因组中包含两个拷贝的含有以下位点突变的糖蛋白基因：Arg333→Gln，Asp164→Ser。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的重组减毒狂犬病毒糖蛋白基因来自狂犬病毒CTN-1株、aG株、SAD株、EAR株、Flurg-LEP株、Flurg-HEP株或PM株。

无致病狂犬病病毒的G基因上的333位以及164位的位点突变导致G蛋白基因稳定，不易返祖。

其次，本发明提供了由以上任一所述的方法制备得到的无致病性的重组减毒狂犬病毒。

按照本发明所述的方法制备得到了一株无致病性的重组减毒狂犬病毒，该病毒在免疫缺陷的动物中传一代或多代无致病性；本发明的一株无致病性的重组减毒狂犬病毒，含有双拷贝的G基因，且G基因中存在以下位点的突变：Arg333→Gln，Asp164→Ser，该病毒株命名为CTN-GAGA，分类命名为重组减毒狂犬病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6209，保藏日期为2012年6月14日。

再次，本发明还提供了所述的重组狂犬病毒在制备预防由狂犬病毒引起的疾病药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物可包括注射制剂和口服制剂。

本发明的药物可口服，也可注射，口服制剂包括加饵料，注射制剂可通过包括肌肉、脑内、皮下腹腔进行注射。

最后，本发明还提供了一种疫苗组合物，其特征在于含有以上任一所述的重组狂犬病毒。

优选的，所述的疫苗为冻干疫苗，其还包括药学上可接受的赋形剂或载体。

优选的，所述的疫苗可用于包括狗、猫、狼、狐狸或松鼠等在内的动物的免疫。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明具体实施例所涉及的材料来源：

病毒株：狂犬病毒CTN1株、CVS-11株购买自中国生物制品检定所。

实施例1狂犬病毒全长cDNA克隆

质粒pSDI-1包含CTN-1株基因组3′和5′末端（CTN1-200和11750-11200）插在T7RNA聚合酶和Delta肝炎病毒抗原核酶序列之间。为了获得5′末端基因序列，首先用引物5′-ACGTTAACAA-3′、引物5′-AATTCCTGCAGTAACGACTCACTATAGGG-3′PCR扩增插入酶切位点（EcoRI）,产物进行EcoRI/SmaI酶切并插入到质粒PX8dT，该质粒的是PBluescrpitⅡ的衍生质粒，BssHII-Cla Ⅰ片段被删除。PSDI-1的MunI-BgI片段被CTN1株的MunI-Bg/Ⅱ克隆PZAD1-9（40-482nt）、Sph Ⅰ-AatⅡ克隆、PSCTN(4041-4273nt)、PSCTN AatⅡ-Bg/Ⅱ克隆（11475-11759）取代产生克隆PSD1-1170，通过在482-4041nt4273-11472nt插入AatⅡ，XhoI限制性酶切位点构建含有狂犬病毒全长cDNA克隆的重组表达载体pCTN-1。

实施例2高度减毒表达2拷贝相同糖蛋白基因的重组狂犬病毒的构建

采用PCR方法进行狂犬病毒G基因Arg333→Gln（相应密码子由AGA突变为CAG）,Asp164→Ser164（相应密码子由GAU突变为AGU）的突变，

1、含有双拷贝的G基因的载体的构建

引物5′-CGATGTATACGTACGAAGATGTTCCTCAGCTCTCCTG-3′(B siWI位点)，引物5′-CTTATCAGCTAGCTAGCTAGCTAGTTACAGTCTGTCTCACCCCCA-3′(NheI位点)，模板为PCTN-1，产物用NheI和BsiWI限制内切酶切，克隆形成PCTN-G，二次克隆形成PCTN-G-G，双拷贝的G基因可测序。

PCR的条件：94℃预变性1分钟，变性30s，45℃退火60s，72℃延伸120s，35次循环。

2、含有双拷贝的G基因的载体的定点突变

模板p CTN-G，

引物1:

5′-AGGAATTCCCCGGGAAGATGGTTCCTGAGGCTCTCCTATTTGTA-3′

引物2:

5′-ACGCTCTAGAGCCCTTAATTAACGTTAACAGTCTGGTCTCACCCCA 3′,

G基因中插入EcoRI和XbaI位点，PCR产物酶切连接到pBlue-ScriptⅡK（+）形成克隆pAG。

用QuickChange XL定点试剂盒进行突变，

引物3：

5′-GTCTTGTGACATTTTTACCAAGAGTAGAGGGAAGAGAGC-3′,

引物4：

5′-GCTCTCTTCCCTCACTCTTGGTAAAAATGTCACAAGAC-3′

引物5：

5′-GATGTCTTGTGACATTTTTACCTCCAGTAGAGGGAAGAGAGCATC-3′

引物6：

5′-GATGCTCTCTTCCCTCTACTGGAGGTAAAAATGTCACAAGACATC-3′

突变后产物质粒用XamI和PacI酶切连接后得到含有突变位点的双拷贝G基因的重组狂犬病毒载体pCTN-GAGA以及含有突变位点的单拷贝G基因的重组狂犬病毒载体pCTN-GA。

实施例3转染

BHK-21或BSR细胞用3.2cm直径的固体培养皿培养过夜，培养基MEM+10%小牛血清。细胞80%铺满，按0.5MOI接种痘病毒天然毒株，感染1小时后，用不含小牛血清的细胞培养液洗涤3次，洗涤细胞并继续培养。用5.0μg含有突变位点的重组狂犬病毒载体pCTNGA-GA或pCTNGA、pCTN-P、pCTN-N、pCTN-L、pCTN-G质粒按磷酸钙转染试剂盒说明转染培养，37℃培养4天后，上清移到BHK-21细胞在37℃培养4天。

实施例4重组病毒G基因分析

BHK-21细胞培养的重组病毒CTN-GAGA,用PBS  洗涤，再用RNeasyMiniKitCQiagen按说明操作提取重组病毒RNA。用Superscript One StepRT-PCR kit（Invitrogen），引物1:5′-AACATGTTATGGTGCCATTAAACCGCT-3′和引物2:5′-GGGTGTTAGTTTTTTTCATGGACTTGG-3′进行RT-PCR，PCR产物测序。测序结果与预期相符，所述的重组病毒CTN-GAGA中含有双拷贝的G基因，且G基因中存在以下位点的突变：Arg333→Gln（相应密码子由AGA突变为CAG）,Asp164→Ser164（相应密码子由GAU突变为AGU）。

该重组病毒CTN-GAGA株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6209，保藏日期为2012年6月14日。

实施例5重组狂犬病毒对新生小鼠的致病性

新生小鼠15只脑部注射5μl PBS含10⁴个感染性病毒颗粒，感染3天后，用乙醚麻醉取脑按4倍体积加入PBS研磨离心，上清存于-80℃以确定病毒滴度。

成年小鼠10只乙醚麻醉，脑腔注射10μlPBS含10⁵个感染性病毒颗粒，观察30天是否有临床症状，结果如表1所示。

表1.重组狂犬病病毒对成年鼠的致病性

实施例6重组减毒狂犬病毒的生产

重组减毒狂犬病毒的静止培养：

a采用细胞工厂培养BHK-21或BSR细胞或Vero细胞或原代地鼠细胞，3天长成单层后按照MOI 0.001-0.1接种重组减毒狂犬病毒病毒CTN-GAGA，37℃孵化1小时后，加入培养液（MEM0.2%牛血清蛋白）在34℃培养3-5天。

b采用生物反应器生产，4-5×10⁸的BHK-21或BSR细胞或Vero细胞或原代地鼠细胞加入生物反应器，用MEM含10%小牛白清液采用批模式培养3-4天，以0.2L/min充入CO₂,溶氧37～38%，移去细胞生长液，加入无血清培养基和4M谷胺酰胺，34℃培养5天。接种2.5×10⁸TCID₅₀的重组狂犬病毒CTN-GAGA，37℃1小时后，加入维持液（MEM含0.2%牛血清的蛋白），PH6.8，温度34℃,溶氧37-38%条件下培养4-6天。

生物反应器和细胞工厂生产的狂犬病病毒滴度测定结果如表2所示。

表2生物反应器和细胞工厂生产的狂犬病病毒滴度

实施例7重组减毒狂犬病毒的热稳定性实验

三个批次的重组减毒狂犬病毒CTN-GAGA分别在4℃、5℃、37℃放置1、7、14、21天，测定病毒滴度，结果表明重组病毒在4℃可保存二周滴度不下降，25℃一周后下降1个对数值，二周后下降2个对数值，37℃存放一周下降2个对数值，2周后无感染性测出。

实施例8重组减毒狂犬病毒CTN-GAGA口服免疫家犬

购买30只比格犬，不限年龄、性别，单独饲养，隔离观察30天，按国家动物保健福利进行实验，每只随机分组，试验组每组6-7只犬，12只作为对照，分组见表3。

试验组犬口服重组减毒狂犬病毒，对照组口服1ml灭菌的PBS（0.01M，pH7.5），见表4，家犬免疫后每周取血，低速离心获得血清，采用快速荧光灶抑制试验确定犬的狂犬病毒中和抗体，中和抗体阳性是中和50FFD50/0.1mlCVS-11攻击毒的抗体稀释度倒数，抗体4倍增长作为免疫有效，与国际标准品比较转换成几何平均滴度（GMT），免疫5周后所有犬只用巴比妥按0.5mg/kg肌肉注射麻醉，后腿肌肉注射0.5ml狂犬病街毒，街毒攻击后每天观察任何临床症状，如昏睡、急躁、焦虑、瘫痪、面部神经缺陷等，如发现犬只有上述症状，立即麻醉处死取头贮存于-80℃超低温水箱，以备检测脑内病毒，存活犬只攻击后至少观察3月。

表3试验用的疫苗和分组

表4犬口服重组狂犬病疫苗的中和抗体以及狂犬病攻毒后的存活情况

实施例9重组狂犬病毒的基因稳定性

重组减毒狂犬病毒CTN-GAGA分别在小鼠家犬传至10代，传代的家犬4只，小鼠6只，小鼠每代观察2周，家犬每代观察2个月，试验完成后分别取脑内配成10%的脑悬液-80℃贮存。

设计RT-PCR引物，测定小鼠第1、第5和第10代，家犬第1、第10代的脑悬液，测定的序列包括5到11950碱基，RT-PCR产物克隆至质粒PCR2.0并转至大肠杆菌DH5α中进行测序分析。结果如表5、表6所示。

表5小鼠传代第1和第10代基因组序列的差异

表6家犬传代第1代和第10代基因组序列的差异

结果表明，本发明的重组狂犬病毒稳定性高，在动物体内连续传代10代后其表达的氨基酸序列无变化。

Claims (9)

1.一种制备无致病性的重组减毒狂犬病毒的方法，其特征在于将狂犬病毒基因组中的糖蛋白基因进行以下位点的突变：Arg333→Gln，Asp164→Ser。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的狂犬病毒基因组中包含两个拷贝的含有以下位点突变的糖蛋白基因：Arg333→Gln，Asp164→Ser。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的狂犬病毒糖蛋白基因来自狂犬病毒CTN-1株、aG株、SAD株、EAR株、Flurg-LEP株、Flurg-HEP株或PM株。

4.由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的无致病性的重组减毒狂犬病毒。

5.如权利要求4所述的重组减毒狂犬病毒，命名为CTN-GAGA，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6209，保藏日期为2012年6月14日。

6.权利要求4或5所述的重组减毒狂犬病毒在制备预防由狂犬病毒引起的疾病药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的药物包括注射制剂和口服制剂。

8.一种疫苗组合物，其特征在于含有权利要求4或5所述的重组减毒狂犬病毒。

9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于所述的疫苗组合物为冻干疫苗，其还包括药学上可接受的赋形剂或载体。