TWI734493B - 一種產類細菌素之水生色桿菌及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種水生色桿菌菌株(Chromobacterium aquaticum)，其係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存日期為民國109年5月7日，寄存編號為BCRC 910997。本發明之水生色桿菌菌株對於多種病原菌皆具有抗菌活性，同時以該菌株作為益生菌餵食水產養殖生物，可促進營養代謝與生長表現，並提升免疫功能，降低疾病感染的死亡率。

Description

一種產類細菌素之水生色桿菌及其應用

本發明係關於一種產類細菌素之水生色桿菌(Chromobacterium aquaticum)及其應用，特別係提供一種水生色桿菌，其對於多種病原菌具有抗菌活性，並且可用於促進營養代謝、生長表現、提升免疫調節功能及增強抗病性。

由於海洋資源的浩劫以及世界人口劇增，目前捕撈漁業的漁獲量已達上限，為了滿足人類的食用需求，近年來世界各地水產養殖的重要性逐漸提高。根據聯合國糧農組織(FAO)2018年的報告顯示，水產養殖佔漁業總產量的53%，產值達2320億美元(參見非專利文獻1)。然而，為了增加產量集約化的水產養殖方式以及水質汙染，使得病原菌感染的發病率提高，疾病一旦爆發常導致大量的魚體死亡並造成龐大的經濟損失，嚴重影響產業發展，其中又以細菌性疾病最為嚴重。可列舉例如：分別由致病性親水性產氣單胞菌(Aeromonas spp.)或鏈球菌(Streptococcus spp.)以及弧菌(Vibrio spp.)感染所引起的出血性敗血病以及弧菌病，常導致淡水魚及海水魚的大量死亡。面對疾病問題，養殖戶常以抗生素或化學藥劑進行預防或治療處理，然而抗生素的濫用已導致抗藥性菌株的散佈、生態環境的 破壞，導致抗生素的效力減低並有可能導致人體安全的危害。有鑒於此，開發抗生素的替代方式為水產養殖永續發展的重要課題。

生物防治法中，使用從自然界分離之益生菌，係對環境影響較小，且可減少抗藥性菌株產生之風險，為替代抗生素預防疾病的有效策略之一。此外，對於多種病原菌皆具有拮抗能力亦為益生菌非常重要的特性之一。在水產養殖領域中，以乳酸菌與芽孢桿菌的應用最為廣泛，此乃因為此等益生菌可產生之水解酶(例如植酸酶、纖維酶、蛋白酶及木聚糖酶)可提升養分利用率，且因其長期使用於哺乳動物，故安全無虞。特別係芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)，由於此等菌株能夠產生對胃腸道的低pH值具有抵抗性的內生孢子，因此經常作為益生菌使用(參見非專利文獻2)。然而，益生菌與寄主間的交互作用被認為係物種特異性或菌株特異性，因此為了應用於多種魚類經常需要開發多種益生菌。同時，由於水產養殖生物的生存環境具有水質、酸鹼度、鹽分以及共生的微生物等複雜的環境變因，還必須考慮益生菌的環境耐受性等因素。

作為益生菌之細菌所產生的抗菌物質通稱為細菌素(bacteriocin)，細菌素會對競爭者表現出抑菌或殺菌活性，防止有害細菌在腸道表面增殖，從而在微生物族群中保持環境優勢。與其他化學合成的抗菌添加物及抗生素相比，細菌素主要為核醣體合成的蛋白質或是小分子胜肽，由於其結構及抗菌機制與抗生素不同，並不會有產生抗藥性菌株的問題。一般而言，細菌素具有溫度穩定性、對人體及環境無害、免疫調節等優點，因此可進一步應用於食品產業與臨床醫藥，作為抗生素的替代方案。在水產養殖領域，儘管已有部分研究顯示益生菌對魚類的有利效果， 然而關於產細菌素之益生菌的研究卻相當少。

色桿菌(Chromobacterium spp.)屬為革蘭氏陰性桿狀細菌，目前尚未有色桿菌屬的菌株作為水產養殖之益生菌使用之相關先前技術。

【非專利文獻】

(1) FAO, The State of World Fisheries and Aquaculture, Meeting the Sustainable Development Goals Rome, Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO, 2018.

(2) Kuebutornye, F., Abarike, E., & Lu, Y. (2019). A review on the application of Bacillus as probiotics in aquaculture. Fish & Shellfish Immunology, 87, 820-828.

本發明鑑於上述問題，目的在於提供一種可替代抗生素及化學藥劑使用之產細菌素的益生菌，同時考量使用效益及成本，期望本發明所開發之益生菌對於多種病原菌具有抗菌活性，並且具有調節免疫功能的效果，藉此優勢廣泛應用於多種病害之防治。進一步地，為追求產量提升及飼料效益，亦期望該益生菌兼具促進養殖生物營養代謝及生長表現之功效。

為達到上述目的，本發明提供以下技術手段。

在一態樣中，本發明提供一種水生色桿菌菌株，其係寄存 於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存日期為民國109年5月7日，寄存編號為BCRC 910997。

在部分實施型態中，前述水生色桿菌菌株對於親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、酵母菌(Debaryomyces hansenii)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腸道沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus；MRSA)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)及伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli)之至少一種具有抗菌活性。

在部分實施型態中，前述水生色桿菌菌株係用於提升水產養殖生物之營養代謝及/或生長表現。

在部分實施型態中，前述提升水產養殖生物之營養代謝包含促進營養代謝相關基因的表現，前述營養代謝相關基因包含由以下組成之群組的至少一種：葡萄糖激酶(glucokinase，GK)、六碳糖激酶1(hexokinase 1，HK1)、葡萄糖6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)及丙酮酸激酶L型(pyruvate kinase liver isoform，PK-L)。

在部分實施型態中，前述提升水產養殖生物之生長表現包含促進生長相關基因的表現，前述生長相關基因包含由以下組成之群組的至少一種：生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)及第一型類胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1，IFG-1)。

在部分實施型態中，前述水生色桿菌菌株係用於促進水產 養殖生物之生長相關基因的表現，前述生長相關基因包含由以下組成之群組的至少一種：生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)及第一型類胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1，IFG-1)。

在部分實施型態中，前述水生色桿菌菌株係用於提升水產養殖生物之免疫功能。在部分實施型態中，前述提升水產養殖生物之免疫功能包含促進免疫功能相關基因的表現，前述免疫功能相關基因包含由以下組成之群組的至少一種：介白素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、介白素-6(IL-6)、介白素-10(IL-10)、介白素-21(IL-21)、腫瘤壞死因子(TNF-α)及核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)。在部分實施型態中，前述提升水產養殖生物之免疫功能包含提升溶菌酶及/或補體C3b之表現量。

在部分實施型態中，前述水生色桿菌菌株係用於提升水產養殖生物對養殖病原菌感染之存活率，前述養殖病原菌包含親水性產氣單胞菌及魚型鏈球菌(Streptococcus iniae)。

在另一態樣中，本發明提供一種上述水生色桿菌菌株之用途，其特徵係其用於水產養殖生物飼料。

又在另一態樣中，本發明提供一種上述水生色桿菌菌株之用途，其特徵係其用於食品或化妝品中的天然抗菌劑。

本發明產類細菌素之水生色桿菌菌株為自行篩選，並且首先證實具有益生菌的功能。該菌株能夠分泌蛋白酶(protease)及木聚糖酶(xylanase)，改善動物腸道中養分的消化及吸收，對於提升飼料轉換率與飼 料效益具有優異之效果。同時，本發明之水生色桿菌所產之類細菌素，對於多種病原菌皆具有抗菌能力，甚至對於具有抗生素抗藥性之病原菌亦具有抗菌活性，能夠廣泛應用於不同病原菌引起之疾病，解決抗生素濫用及抗藥性問題，作為取代抗生素之抗菌物質，並且亦具有優異之溫度及酸鹼值耐受性，即使在極端環境中仍維持穩定的抗菌活性，具有實務上廣泛應用之效力。

此外，本發明之水生色桿菌作為益生菌，顯著促進水產養殖生物之營養代謝及生長表現，能夠有效降低生產成本、縮短養殖生物生長時間、提升飼料效益。同時，本發明之水生色桿菌可提升免疫調節功能，有助於抵抗疾病感染並且降低死亡率，具有產品開發上優異之潛力。

【圖1(A-B)】表示本發明之水生色桿菌JS-1的生理特性分析。(A)蛋白濃度(μg/ml)與抗菌活性(AU/μl)對應於水生色桿菌JS-1之生長曲線圖。(B)透過紙錠擴散試驗(disk diffusion assay)，本發明之水生色桿菌JS-1培養30、48、96小時後，其上清液(不含細菌)對於親水性產氣單胞菌之抗菌活性。(C)本發明之水生色桿菌JS-1培養96小時後，其上清液(不含細菌)以胰蛋白酶(trypsin)分別處理30及60分鐘後，再測定其抗菌活性；其中，對照組為未以胰蛋白酶處理之樣品。

【圖2(A-B)】表示本發明之水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質對於溫度及pH值的耐受性。(A)前述類細菌素物質在pH值2至11處理4 小時後之抗菌活性。(B)前述類細菌素物質在不同溫度下處理1小時後之抗菌活性。各組實驗數據為三次獨立試驗之平均值。

【圖3(A-B)】表示本發明之水生色桿菌JS-1對體內及體外木聚糖酶活性的影響。藉由測定波長570nm之吸光值檢測經木聚糖酶降解所釋放之低聚木糖(xylooligosaccharides，簡稱XOSs)。透過DNS法測定(A)體外及(B)體內的木聚糖酶活性。每組n=6，實驗數據以平均值±SE表示，圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(p<0.05)。

【圖4(A-D)】使用本發明之水生色桿菌JS-1餵食斑馬魚8週後，分析斑馬魚肝臟組織中營養代謝相關基因之表現量所得結果圖。其中，(A)為葡萄糖激酶(GK)基因；(B)為六碳糖激酶1(HK1)基因；(C)為葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)基因；(D)為丙酮酸激酶L型(PK-L)基因。圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(p<0.05，單因子變異數分析)。

【圖5(A-B)】使用本發明之水生色桿菌JS-1餵食斑馬魚8週後，分析斑馬魚肝臟組織中生長相關基因之表現量。其中，(A)為生長激素受體(GHR)基因；(B)為第一型類胰島素生長因子(IFG-1)基因。圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(p<0.05，單因子變異數分析)。

【圖6(A-H)】使用本發明之水生色桿菌JS-1餵食斑馬魚8週後，分析斑馬魚全身免疫功能相關基因之表現量。其中，(A)為介白素-1β(IL-1β)基因；(B)為介白素-6(IL-6)基因；(C)為介白素-10(IL-10)基因；(D)為介白素-21(IL-21)基因；(E)為腫瘤壞死因子(TNF-α)基因；(F)為核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)基因；(G)為溶菌酶(lysozyme)基因；(H)為補體 C3b基因。圖中各柱狀圖之上方英文字母表示各組間是否存在顯著差異(p<0.05，單因子變異數分析)。

【圖7(A-B)】使用本發明之水生色桿菌JS-1餵食斑馬魚8週後，感染(A)親水性產氣單胞菌與(B)魚型鏈球菌之存活率。

以下揭示本發明實施方式，其並非限制本發明必須以下述方式實施，而係為了闡釋本發明之詳細內容與實施之效果。

〔菌株篩選〕

篩選對親水性產氣單胞菌具有抗菌活性之潛力菌株

從國立屏東科技大學靜思湖採集4組湖水樣本，將各組湖水樣本以無菌水10倍序列稀釋後，分別吸取100μL稀釋後之懸浮液塗佈於TSB瓊脂平板上，並且置於28℃培養24小時。培養後，根據形態特徵從各組湖水樣本中挑選出10個不同的菌落，總計40個細菌分離株。將前述各個分離株接種於選擇性培養基(含有親水性產氣單胞菌之TSB培養基，其中親水性產氣單胞菌濃度約為1.0×10⁶CFU/mL)，並且於28℃培養4天，以篩選對親水性產氣單胞菌具有抗菌活性之潛力菌株。若在分離株之菌落周圍形成抑制圈，表示該分離株能夠產生抗菌物質，其中僅有1個分離株展現最為優異之抗菌活性，即本發明之分離株JS-1。

〔菌株鑑定〕

分離株JS-1之16S rDNA序列鑑定

生物間核醣體rDNA屬於高度保留序列，在演化過程中 16S rDNA之序列不容易產生變化，而不同物種間亦僅有些許的差異，本鑑定利用此特性分析16S rDNA序列之差異，從而了解分離株JS-1與已知菌種之間之親緣關係。以下菌株鑑定試驗係委託食品工業研究所代為鑑定分析。

聚合酶連鎖反應(PCR)擴增16S rDNA片段

首先，萃取分離株JS-1之genomic DNA，以通用引子27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)(SEQ ID NO：1)及1525R(5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’)(SEQ ID NO：2)進行聚合酶連鎖反應擴增其16S rDNA基因片段。PCR反應條件設定如下：(1)95℃，4分鐘；(2)94℃，1分鐘；(3)58℃，1分鐘；(4)72℃，95秒；(5)(2)至(4)步驟重複32個循環；(6)72℃，5分鐘。擴增後之PCR產物以1.5%凝膠電泳分析確認，其16S rDNA片段長度為1500 bp。

16S rDNA定序與序列分析

確認PCR產物為分離株JS-1之genomic DNA後，使用QIAquick PCR purification kit(QIAGEN,Hilden,Germany)純化PCR產物，接著進行DNA定序分析。所使用之定序儀機器為ABI 3730XL DNA Analyzer(Foster City,CA,USA)，待定序結果報告出來後整理定序資料，再送至National Center for Biotechnology Information(NCBI)資料庫中使用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)系統進行序列的比對，搜索與分離株最為接近之菌種。

序列比對結果顯示，分離株JS-1與Chromobacterium aquaticum之相似度為99.11%。

分離株JS-1之生化特徵鑑定

分離株JS-1之特徵分析結果顯示，該菌株為具有運動性、兼性厭氧之革蘭氏陰性桿菌，並具有觸酶(catalase)、氧化酶(oxidase)及硝酸還原酶(nitrate reductase)活性。

又根據消化酶活性分析結果顯示，本發明之分離株JS-1能夠分泌蛋白酶及木聚糖酶。

能夠分泌胞外酵素之益生菌對於提升動物的營養代謝及生長表現具有正向的效果，這是由於此等胞外酵素有利於飼料中的大分子降解為腸道內易於消化吸收的形式，從而提高飼料中營養成分的利用率。例如蛋白質分解酵素，簡稱蛋白酶，可於水解蛋白質的過程中，生成多肽或胺基酸，以方便腸道內進行消化吸收。又例如木聚糖為多聚五碳醣，屬半纖維素類物質，係飼料原料中非澱粉多醣的最主要成分，木聚糖酶可將木聚糖降解為低聚木糖和少量木糖，亦可解決木聚糖在動物消化道內不能被消化吸收，並阻礙其他營養成分的消化作用的問題。如此一來，木聚糖酶便能促進動物對飼料的消化吸收與生長，從而提高飼料轉換率，並減少糞便中多餘的殘留物，降低環境污染。

經上述鑑定後，確認分離株JS-1為一種水生色桿菌菌株，並命名為Chromobacterium aquaticum JS-1(在本說明書中，亦稱為水生色桿菌JS-1)。

【實施例】

以下，以各實施例進一步說明本發明之菌株與使用該菌株 可獲得之有利功效，惟本發明並非特別限定為此等實施例者。

實施例1：水生色桿菌JS-1之特性分析

將水生色桿菌JS-1培養於TSB液態培養基中，分別在不同生長時間點取1mL培養液以分光光度計測定吸光值OD₆₀₀，繪製生長曲線，接著前述培養液以13,600×g，4℃離心15分鐘獲得上清液(不含細菌)，測定前述上清液之蛋白質濃度及抗菌活性。前48小時為每4小時測定及抽樣1次，之後為每6小時測定及抽樣1次。

蛋白質濃度係透過Bradford試驗定量分析。抗菌活性係透過Resazurin試驗進行測定，其檢測的原理乃利用Resazurin經過粒線體中的NADH去氫酶作用後，會將原本呈深藍色的Resazurin還原成呈粉紅色的Resorufin，藉此檢測細菌或是細胞的活性。將預先培養的指標菌株E.coli稀釋為1×10⁷CFU/ml，並配置濃度為0.25mg/ml的Resazurin染劑，以利後續實驗的進行。將96孔盤分別以每3個孔做為1組樣品之三重覆，每個孔洞均加入60μL TSB培養液、10μL Resazurin染劑、10μL指標菌株以及20μL樣品，總量為100μL。前述20μL樣品，為分別依序添加0、1、2、3...至20μL的上清液，並使用TSB培養液將所有樣品補至總量為20μL。將完成的96孔盤放置於37℃中培養12小時，並觀察其顏色變化。抗菌單位以任意單位(arbitrary unit，AU)表示，經由Resazurin試驗，抑制顏色變化量最少之上清液樣品添加量定義為1 AU，並將各時間點上清液之抗菌活性以每毫升上清液含有多少AU表示。

將水生色桿菌JS-1之生長曲線、上清液之蛋白質濃度變化及其抗菌活性變化，根據抽樣時間點繪製於圖表進行分析。如圖1A所 示，水生色桿菌JS-1在培養44小時後，隨著上清液中蛋白質濃度逐漸增加，其上清液中抗菌物質之活性亦明顯上升，此結果說明上清液中蛋白質的濃度與抗菌物質呈正相關，水生色桿菌JS-1所分泌之蛋白質具有抗菌活性，同時，亦顯示本發明之水生色桿菌JS-1在穩定期中期(mid-stationary phase)才開始產生類細菌素物質。

實施例2：抗菌效果評估

透過紙錠擴散試驗，進一步分析水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質對於多種病原菌之抗菌能力。將培養水生色桿菌JS-1之TSB培養液離心後收集其上清液，以利後續實驗的進行。各種指標病原菌以濃度大約1.0×10⁶CFU/mL分別塗佈於TSB瓊脂平板上，接著將8mm紙錠放置於前述TSB瓊脂平板表面，於前述紙錠加入20μL前述上清液，並且於28℃培養24小時，最後測量紙錠周圍抑制圈的直徑評估JS-1所產生之類細菌素物質的抑菌能力。同時，為了確認前述類細菌素物質係蛋白質化合物，將180μL前述上清液與20μL胰蛋白酶混合，使前述胰蛋白酶最終濃度為1mg/mL，並於37℃反應1小時，經胰蛋白酶前處理之上清液，其抗菌活性亦透過紙錠擴散試驗進行評估，試驗方法詳如前述。

試驗結果如圖1B、圖1C及表1所示，圖1B顯示本發明之水生色桿菌JS-1在培養30、48、96小時後，所產生之類細菌素物質對於親水性產氣單胞菌之抗菌活性，JS-1在培養48及96小時後所收集之上清液樣本，在紙錠周圍有形成抑制圈，然而培養30小時之上清液樣本並未形成抑制圈，此試驗結果與圖1A之抗菌活性對應於菌株生長曲線圖的結果相符，顯示本發明之水生色桿菌JS-1係於穩定期中期後才開始產生類 細菌素物質。

又如表1所示，本發明之水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質，對於多種病原菌皆具有抗菌活性，前述病原菌包含水產養殖病原菌、食源性病原菌、臨床性病原菌及植物病原菌，前述養殖病原菌包含：親水性產氣單胞菌、無乳鏈球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌及酵母菌；前述食源性病原菌包含：金黃葡萄球菌、腸道沙門氏菌、單核細胞增生性李斯特菌；前述臨床性病原菌包含：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌；前述植物病原菌包含伯克霍爾德菌。由表1之結果可明顯得知，本發明之水生色桿菌JS-1之功能具有廣效性，甚至對於多種具有抗生素抗藥性之病原菌亦具有抗菌活性，能夠廣泛應用於不同病原菌引起之疾病，解決抗生素濫用及抗藥性問題，作為取代抗生素之抗菌物質。例如可應用於水產養殖、作物生產、食品產業與臨床醫藥上作為抗菌物質，減少水產與植物病原菌感染、食品腐敗菌污染與臨床抗藥性病原菌感染。

表1、水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質對於多種病原菌之抗菌活性

抗菌活性：+表示抑制圈直徑小於1.0公分；++表示抑制圈直徑介於1.0至1.2公分之間；+++表示抑制圈直徑大於1.2公分。上標a表示具有抗生素抗藥性之病原菌。

此外，圖1C顯示上清液經過胰蛋白酶前處理後喪失其抗菌活性，進一步證實本發明之水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質係蛋白質化合物。

實施例3：pH值耐受性評估

以下實施例測試水生色桿菌JS-1產生之類細菌素物質針對不同pH值的穩定性。將1mL水生色桿菌JS-1之上清液凍乾成粉末，接著分別回溶於1mL不同pH值的緩衝液中處理4小時，前述緩衝液分別為glycine-HCl緩衝液(pH 2.0)、citrate-phosphate緩衝液(pH 3.0~6.0)、tris(hydroxymethyl)aminomethane緩衝液(pH 8.0~9.0)以及glycine-NaOH緩衝液(pH 10.0~11.0)，其中對照組回溶於PBS緩衝液(pH 7.0)，接著透過紙錠擴散試驗測試對於親水性產氣單胞菌之抗菌活性。

實驗結果如圖2A所示，該菌株產生之類細菌素物質在pH值2.0~10.0維持穩定的抗菌活性，甚至在極度鹼性的環境下(pH 11.0)其抗菌活性僅些微下降12%(相對於對照組)，此結果顯示本發明之水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質具有優異之pH值耐受性。

實施例4：溫度之耐受性評估

以下實施例測試水生色桿菌JS-1產生之類細菌素物質在不同溫度下的穩定性。取1mL水生色桿菌JS-1之上清液分別置於30、40、50、60、70、80、90及100℃中處理1小時，其中對照組為置於4℃之上清液樣本，接著透過紙錠擴散試驗測試對於親水性產氣單胞菌之抗菌活性。

實驗結果如圖2B所示，該菌株產生之類細菌素物質在溫度40至90℃下具有穩定的抗菌活性，此外即使在100℃高溫處理下，仍保有80%的抗菌活性(相對於對照組)，顯示本發明之水生色桿菌JS-1所產生之類細菌素物質具有優異之溫度耐受性。

由上述pH值及溫度耐受性的結果顯示，本發明之水生色桿菌JS-1即使在極端環境中仍維持穩定的抗菌活性，具有實務上應用之潛力。

〔水生色桿菌JS-1作為益生菌投予斑馬魚(Danio rerio)〕

以下實施例5~9以斑馬魚為實驗動物模式，測試水生色桿菌JS-1作為益生菌餵食斑馬魚之效果。將斑馬魚(魚體身長大約4.1公分，魚體重約0.46公克)隨機分為對照組、G1實驗組及G2實驗組，每組20隻魚，並飼養於28℃、10公升的飼養槽內，各實驗結果係經三次獨立實驗獲得。其中，對照組餵食普通飼料，根據AOAC分析方法(AOAC 1997)測定，普通飼料的大致組成為39.2%的粗蛋白及8%的粗脂質。G1實驗組及G2實驗組係將水生色桿菌JS-1作為益生菌添加至普通飼料中，其含量分別為G1：10⁶CFU/g及G2：10⁷CFU/g。各組斑馬魚每日餵食兩次，飼料的餵食量約為魚體重的2%，經8週餵食後，檢測斑馬魚肝臟中 營養代謝與生長相關指標基因的表現量，以及全魚體中免疫指標基因的表現量。

實施例5：體外及體內的木聚糖酶活性試驗

體外木聚糖酶活性試驗方法如下：在15mL的離心管中加入6mL無菌水，接著加入0.5公克的普通飼料或含有水生色桿菌JS-1的飼料，置於28℃反應7天，反應後該混合物以12,000×g、4℃離心15分鐘，取上清液進行木聚糖酶活性試驗。體內木聚糖酶活性試驗方法如下：經8週餵食後，每組隨機選3隻斑馬魚在冰上犧牲解剖，將魚的腸道樣本收集在1.5mL的微量離心管內並加入1mL無菌水，離心管震盪後，以12,000×g、4℃離心15分鐘，取上清液進行木聚糖酶活性試驗。木聚糖酶活性試驗係根據二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，簡稱DNS)法，測定從木聚糖中釋放的還原醣的量。

試驗結果如圖3A及3B所示，其顯示經水生色桿菌JS-1中的木聚糖酶降解後，所釋放之低聚木糖的量，吸光值越高表示木聚糖酶活性越強。根據體外(圖3A)試驗的結果，相較於對照組的普通飼料，含有水生色桿菌JS-1的飼料中(G1及G2)低聚木糖的含量顯著增加，顯示飼料中添加水生色桿菌JS-1確實具有木聚糖酶活性，能夠將飼料原料中非澱粉多醣的最主要成分木聚糖，降解為低聚木糖等較小的分子，改善木聚糖無法被動物消化吸收的問題，提升飼料轉化率。又根據體內(圖3B)試驗的結果，斑馬魚經過8週的餵食後，相較於餵食普通飼料的對照組，在餵食含有水生色桿菌JS-1飼料的斑馬魚的腸道中(G1及G2)，低聚木糖的含量顯著提升，由於魚類的腸道中缺乏木聚糖酶，此結果顯示水生色桿菌JS-1作 為益生菌添加至飼料中，可顯著提升飼料中養分的利用率，促進動物對飼料的消化吸收以及生長表現。

〔RNA萃取〕

斑馬魚經8週餵食後，各組隨機挑選6隻斑馬魚抽取總RNA進行後續基因表現分析。

以下實施例分析斑馬魚肝臟組織以及全魚體相關指標基因的表現量。RNA萃取步驟如下：將魚隻的肝臟組織取出浸泡於含有1mL TriPure的2mL微量離心管中，而剩餘的全身以解剖剪刀剪碎後，放入含有4mL TriPure的15mL離心管中，萃取組織RNA。將組織放置於TriPure中，使用均質機加以均質，之後加入200μL Chloroform，上下輕微搖晃30秒，隨後放置於冰上5分鐘。等待組織碎塊沉澱後以12,000rpm、4℃離心15分鐘使樣品分層，離心後將透明的上清液取出，放置於新的1.7mL微量離心管中，並加入500μL的Isopropanol混合，之後在室溫下靜置10分鐘等待RNA沉澱，10分鐘後以12,000rpm、4℃離心10分鐘，使RNA離心至微量離心管底部，接著去除上清液並以75%酒精清洗RNA，再以12,000rpm離心10分鐘去除大部分酒精後，將微量離心管靜置於桌上，等待酒精完全蒸發，最後再加入20μL 0.1% DEPC水回溶RNA。

以超微量分光光度計檢測RNA濃度，檢測後使用Bio-Rad iScript^TM cDNA Synthesis Kit將RNA轉為cDNA並放置於-20℃保存。之後以表2所列各指標基因之對應引子，進行即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)檢測營養代謝、生長以及免疫相關基因的表現量。以EF-1α基因的表現量作為內部校正組(internal control)，各基因之相對表現量表示為平均值± 標準誤差(SE)。

表2、各指標基因之對應引子序列

實施例6：水生色桿菌JS-1提升營養代謝之效果

如圖4所示，斑馬魚經8週餵食後分析其肝臟組織中營養代謝相關指標基因之表現量，相較於餵食普通飼料的對照組，在G1及G2實驗組中葡萄糖激酶(GK)基因及六碳糖激酶1(HK1)基因表現量顯著增加(圖4A及圖4B)。即使在G1實驗組中葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)基因及丙酮酸激酶L型(PK-L)基因表現量相較於對照組並無顯著差異，然而隨著水生色桿菌JS-1之餵食濃度(G2實驗組)增加，此等基因之表現量亦顯著上升(圖4C及圖4D)。

肝臟在調控碳水化合物、脂肪及蛋白質的代謝中扮演重要角色，其中葡萄糖激酶(GK)、六碳糖激酶1(HK1)及丙酮酸激酶L型(PK-L)為限速酶，參與糖解作用最初以及最終步驟。葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)主要存在於肝臟中，能夠在糖質新生中水解葡萄糖-6-磷酸，並產生游離的葡萄糖。本發明之水生色桿菌JS-1顯著增加此等基因之表現量，說明該菌株具有促進營養代謝的效果。

由此實驗結果顯示，餵食含有本發明之水生色桿菌JS-1的飼料，可顯著增加GK基因、HK1基因、G6Pase基因及PK-L基因之表現，顯示可有效提升飼料中養分的能量轉換率並促進營養代謝。

實施例7：水生色桿菌JS-1提升生長表現之效果

如圖5所示，斑馬魚經8週餵食後分析其肝臟組織中生長相關指標基因之表現量，相較於餵食普通飼料的對照組，生長激素受體(GHR)基因之表現量雖然在G1實驗組中並無顯著提升，然而隨著水生色桿菌JS-1餵食濃度的增加，在G2實驗組的斑馬魚中，GHR基因之表現量顯著上升(圖5A)。同時，在G1及G2實驗組中，第一型類胰島素生長因 子(IFG-1)基因之表現量皆顯著增加(圖5B)。

在內分泌機制中，前述GHR基因及IFG-1基因的表現對於體細胞的生長至關重要，肝臟的生長激素受體與腦下垂體前葉的生長激素結合後，觸發第一型類胰島素生長因子釋放進入循環系統，並刺激細胞增殖。

由此實驗結果顯示，餵食含有本發明之水生色桿菌JS-1的飼料，可顯著增加GHR基因及IFG-1基因的表現，顯示該菌株具有刺激細胞增生並且提升生長表現的功效。

實施例8：水生色桿菌JS-1提升免疫功能

如圖6所示，斑馬魚經8週餵食後分析全魚體免疫指標基因之表現量，相較於餵食普通飼料的對照組，在G1及G2實驗組中介白素-6(IL-6)基因、介白素-10(IL-10)基因及介白素-21(IL-21)基因的表現量顯著上升(圖6B-6D)。儘管介白素-1β(IL-1β)基因的表現量在對照組與G1實驗組間並無顯著差異，然而隨著水生色桿菌JS-1餵食濃度的增加，在G2實驗組的斑馬魚中IL-1β基因表現量亦顯著上升(圖6A)。相較於對照組，在G1及G2實驗組的斑馬魚中，腫瘤壞死因子(TNF-α)基因及核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κB)基因的表現量顯著增加，此外在G1及G2實驗組間，TNF-α基因及NF-κB基因的表現量亦具有顯著差異，此結果顯示增加水生色桿菌JS-1的餵食量確實明顯促進此等基因的表現(圖6E-6F)。在對照組及G1實驗組間溶菌酶的表現量並無差異，然而G2實驗組的斑馬魚中溶菌酶的表現顯著增加(圖6G)。另外，相較於對照組，補體C3b的表現量在G1及G2實驗組的斑馬魚中顯著增加(圖6H)。

頭腎在硬骨魚的免疫系統中扮演關鍵角色，當病原菌入侵時，該器官能夠藉由調控免疫細胞產生細胞激素而調節免疫反應。由免疫細胞(例如淋巴細胞、巨噬細胞、單核球)所分泌的細胞激素，能夠驅動先天免疫反應及發炎反應因而抵禦病原菌感染。IL-1β、IL-6及TNF-α是前期表現的促發炎細胞激素(pro-inflammatory cytokines)，此等細胞激素能夠協助宿主針對病原菌的入侵立即做出反應，並且藉由在吞噬作用中誘導一連串的反應從而活化免疫細胞啟動殺菌功能。轉錄因子NF-κB是促發炎訊號傳遞中的關鍵因子，其能夠誘導細胞激素基因的表現並且調節先天免疫功能。可列舉例如：在草魚(Ctenopharyngodon idella)中發現TNF-α參與了NF-κB的訊號傳遞，藉此調控頭腎白血球中TNF-α及IL-1β的表現，顯示在硬骨魚的免疫系統中TNF-α及NF-κB重要的關聯性；此外，從比目魚IL-6啟動子中發現，p65 NF-κB次單元調控IL-6轉錄，顯示NF-κB訊號傳遞參與IL-6的表現。IL-10為抗發炎細胞激素，在病原菌感染後可防止過度的發炎反應，藉此避免對寄主的傷害。在魚類中，IL-21細胞激素為細胞免疫反應中關鍵的調控因子，在活化B細胞、T細胞及自然殺手細胞中發揮重要功能。

溶菌酶為一種水解酵素，能夠水解細胞壁肽聚醣成分中的N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，NAM)與N-乙醯葡糖胺(N-acetyl-D-glucosamine，NAG)之間的β-1,4糖苷鍵，藉此破壞細胞壁使細菌死亡。溶菌酶除了具有殺菌活性外，溶菌酶亦透過釋放降解的細菌產物，藉此調節宿主的免疫系統抵抗病原菌感染，具體而言，降解的細菌產物會形成配體與模式識別受體(pattern recognition receptor)結合，並活化寄主的補體系統 及吞噬作用。因此，溶菌酶的表現量被認為是魚類先天免疫系統中的重要指標。補體系統由一系列補體蛋白所組成，為免疫系統的一部分，補體系統藉由活化吞噬細胞並增強抗體攻擊病原體細胞膜的能力以清除入侵的病原體。C3轉化酶扮演活化補體系統的關鍵角色，當C3轉化酶將C3轉化為C3b，C3b係充當調理素的重要補體分子，是一種可以與抗原表面結合並介導調理素作用殺死病原體的成分。

此等免疫指標基因的表現量在G1及G2實驗組的斑馬魚中顯著上升，此實驗結果顯示本發明之水生色桿菌JS-1作為益生菌添加至飼料中能夠明顯提升水產養殖動物之免疫調節功能。

實施例9：水生色桿菌JS-1提升疾病抵抗能力

由上述實驗結果已證實本發明之水生色桿菌具有提升免疫功能的效果，接著測試斑馬魚在餵食水生色桿菌後的疾病抵禦能力是否進一步得到提升。斑馬魚經8週餵食後，以下實施例測試魚體感染養殖病原菌後的存活率，詳細步驟如下：分別將親水性產氣單胞菌及魚型鏈球菌培養於TSB培養液內，置於28℃培養24小時之後，以6,100×g、4℃離心15分鐘收集細菌細胞，並且以不同體積的無菌水回溶調整菌液濃度。分別將各個序列劑量(10⁵、10⁶、10⁷及10⁸CFU/fish)的親水性產氣單胞菌或魚型鏈球菌，經由腹腔注射(i.p.)接種至10隻斑馬魚體內，檢測並得到魚體感染7天後的半致死劑量(LD₅₀)。斑馬魚以不同飼料餵食8週後，各組(對照組、G1及G2實驗組)隨機挑選15隻斑馬魚透過腹腔注射施打體積20μL且為半致死劑量的親水性產氣單胞菌或魚型鏈球菌菌液，前述菌液的半致死劑量分別為親水性產氣單胞菌1.0×10⁶CFU/fish以及魚型鏈球菌1.0×10⁵ CFU/fish，其中餵食普通飼料的對照組中進一步注射PBS的組別作為陰性對照組，每組進行三次獨立試驗分析，每天觀察魚體上病原菌的病徵並將死亡的魚從飼養槽內移除，在感染7天後記錄各組的累積存活率。

實驗結果如圖7所示，餵食普通飼料並且注射PBS的組別，在感染後的前7天存活率維持100%。然而，餵食8週普通飼料並且有注射菌液的對照組，在分別感染親水性產氣單胞菌後的前4天及感染魚型鏈球菌後的前5天內，斑馬魚的存活率大幅下降，之後的存活率維持穩定，並分別保持在28.8±7.69%及17.7±3.85%直到感染後的第7天。值得注意的是，相較於餵食普通飼料的組別，分別餵食含有10⁶及10⁷CFU/g水生色桿菌JS-1飼料的組別(G1及G2實驗組)，受到病原菌感染後之存活率顯著提升。如圖7A所示，在感染親水性產氣單胞菌的7天後，G1及G2實驗組斑馬魚的存活率分別為49.9±3.88%及53.3±7.69%；如圖7B所示，在感染魚型鏈球菌的7天後，G1及G2實驗組斑馬魚的存活率分別為42.2±3.85%及44.4±3.85%。同時，在G1及G2實驗組間斑馬魚感染後的存活率並無差異，顯示10⁶CFU/g的劑量已足以讓魚體具有疾病抵抗力。

以上實施例5~9的結果顯示，水生色桿菌JS-1作為益生菌添加至飼料中，能夠調節水產養殖動物的免疫功能，並且提升疾病感染的抵抗力，降低養殖生物的死亡率。

【產業利用可能性】

本發明之水生色桿菌JS-1可開發作為益生菌，添加至飼料 中餵食水產養殖生物，能夠有效提升免疫功能並且抵抗疾病感染，降低養殖生物死亡率，同時本發明之水生色桿菌JS-1可有效降低生產成本、縮短養殖生物生長時間、提升飼料轉換率，兼具促進營養代謝及生長表現的功效。

另一方面，培養水生色桿菌JS-1之培養液含有細菌素，亦可將含細菌素之培養液添加於水產飼料中餵食水產養殖生物，可抵抗疾病感染與降低養殖生物死亡率。進一步地，純化之細菌素為抗菌蛋白，可添加於食品或化妝品中，應用作為天然抗菌劑，提升產品之保存時間。更進一步地，純化之細菌素抗菌蛋白對於已含有抗藥性之MRSA致病菌株具有抗菌功能，醫藥產業上可以開發作為替代抗生素治療抗藥性致病菌感染之蛋白藥物。

上述所使用的用語及說明，係用以說明本發明的實施形態，但本發明並非限定於此。只要係不脫離本發明申請專利範圍，具備本發明之技術特徵而有修飾變化者，亦包含在本專利所保護範圍內。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】：台灣新竹食品工 業發產研究所、民國109年5月7日、BCRC 910997

<110> 國立屏東科技大學

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Claims (2)

1. 一種水生色桿菌菌株(Chromobacterium aquaticum)，其特徵係該水生色桿菌菌株係用於提升水產養殖生物之營養代謝及/或生長表現；且該水生色桿菌菌株係寄存於台灣新竹食品工業發產研究所，寄存日期為民國109年5月7日，寄存編號為BCRC 910997。
2. 如申請專利範圍第1項所記載之水生色桿菌菌株，其中，前述提升水產養殖生物之營養代謝包含促進營養代謝相關基因的表現，前述營養代謝相關基因包含由以下組成之群組的至少一種：葡萄糖激酶(glucokinase，GK)、六碳糖激酶1(hexokinase 1，HK1)、葡萄糖6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)及丙酮酸激酶L型(pyruvate kinase liver isoform，PK-L)；前述提升水產養殖生物之生長表現包含促進生長相關基因的表現，前述生長相關基因包含由以下組成之群組的至少一種：生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)及第一型類胰島素生長因子(insulin-like growth factor-1，IFG-1)。

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