TWI460269B - A myristic yeast strain, a composition containing the strain and the use of the strain - Google Patents
A myristic yeast strain, a composition containing the strain and the use of the strain Download PDFInfo
- Publication number
- TWI460269B TWI460269B TW101146069A TW101146069A TWI460269B TW I460269 B TWI460269 B TW I460269B TW 101146069 A TW101146069 A TW 101146069A TW 101146069 A TW101146069 A TW 101146069A TW I460269 B TWI460269 B TW I460269B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- shrimp
- strain
- group
- bicuspidate
- feeding
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本發明係與微生物菌株有關，特別是指一種梅奇酵母菌株、含有該菌株之組合物以及該菌株之用途。
免疫刺激物(immunostimulants)的發展最初源於人類癌症的治療研究。一些免疫刺激物被發現可活化巨噬細胞、T細胞、B細胞及天然殺手細胞，因而導致體內癌細胞的死亡。在水產養殖上，免疫刺激物皆曾使用於魚類及甲殼類動物，能藉由提高非專一性免疫反應增加疾病的抵抗能力，可有效控制疾病的發生，這類物質大多屬於多醣類，例如乙型葡聚糖(β-glucan)、褐藻多醣(laminarin)、基丁質(chitin)、甘露聚醣(mannan oligosaccharide；MOS)及脂多醣(lipopolysaccharide；LPS)等。研究指出褐藻多醣會增加哺乳動物抗病能力，且與腸道菌相的改變有很大的關係。也有研究指出，有些免疫刺激物具有刺激腸道微生物的改變，例如透過刺激腸道中益生菌的生長以提升動物的抗病能力。
益生菌是指能促進腸道微生物平衡之生物體或物質。晚近對於益生菌的新觀念是包括活菌體、死菌體、菌體萃取物，甚至是微生物代謝物都能稱之為益生菌。目前用來作為益生菌的生物除了細菌外，尚有徽菌、酵母菌、微藻等，通常乳酸菌以及桿菌屬(Bacillus
spp.)為主要的益生
菌，前人研究發現，乳酸菌會成為健康的魚和哺乳動物的腸道菌相之主要組成。
益生菌在水產養殖的應用方面，研究指出，以胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum
)餵食點帶石斑魚(Epinephelus coioides)後，可提升免疫力及抵抗鏈球菌屬(Streptococcus
sp.)的能力(Son et al.,2009.Dietary administration of the probiotic,Lactobacillus plantarum,enhanced the growth,innate immune responses,and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides.Fish & Shellfish Immunology 26：691-698.)；而在蝦類，以乳酸菌屬(Lactobacillus spp.
)當作益生菌餵食草蝦後能抵抗病原菌哈維氏弧菌(Vibrio harveyi
)(Phianphak et al.,1999.Probiotic use of Lactobacillus spp.for black tiger shrimp.Penaeus monodon.Journal of Scientific Research Chulalonkorn University 24,41-51.)；餵食百得酸小球菌(Pediococcus acidilactici
)可提升藍蝦(Litopenaeus stylirostris
)免疫力及抵抗病原菌黑美人弧菌(Vibrio nigripulchritudo
)，提高蝦子存活率(Castex et al.,2010.Effect of probiotic Pediococcus acidilactici on antioxidant defences and oxidative stress of Litopenaeus stylirostris under Vibrio nigripulchritudo challenge.Fish & Shellfish Immunology XXX：1-10.)。
另外，台灣公開第201119588號、第201136527號以及第201136529號專利則揭露有將分離自白麴、水蜜桃、
李子、陸生動物飼料、醃漬食品等來源的納豆菌、酵母菌和乳酸益生菌作為水產生物的飼料添加物。
以上所揭露的菌株並非分離自水產生物，亦非養殖環境，若將這些菌株長期使用在水產養殖，極可能無法穩定且持續一定的存活，而須頻繁添加於養殖環境中，除經濟效益不佳之外，對於環境生態也可能造成不可預期的衝擊。
本發明之主要目的在於提供一種適用於水產養殖環境中，且具有益生菌特性的微生物菌株，以及含有該菌株之組合物及該菌株之用途。
為達成前述目的，本發明提供一種梅奇酵母菌株(Metschnikowia bicuspidate
)RS550，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920081。
本發明另提供一種梅奇酵母菌株(Metschnikowia bicuspidate
)LL58，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920082。
於本發明之一實施例中，前述菌株係分離自淡水長腳大蝦(Macrobrachium rosenbergii
)。
本發明另提供一種梅奇酵母菌株(Metschnikowia bicuspidate
)RS550，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920081；以及梅奇酵母菌株LL58，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920082，於水產養殖、作為益生菌以及增加蝦子免疫力之
用途。
本發明另提供一種組合物，包含有一飼料；以及至少一種微生物菌株，其中該微生物菌株係選自如請求項第1項或第3項所述之菌株中之一種或兩種。
前述菌株能在養殖環境中穩定且持續一定的存活，並且將該菌株與飼料混合後餵食，能夠有效增加水產生物的免疫力，可作為益生菌，應用在水產養殖方面。
有關本發明之詳細構造、特點、組裝方式或使用方式，將於後續之詳細說明中予以描述。然而，在本發明領域中具有通常知識者應能瞭解，該等詳細說明以及實施本發明所列舉之特定實施例，僅用於說明本發明，並非用以限制本發明之專利申請範圍。
以下將藉由所列舉之實施例以及實驗例，配合隨附之圖式，詳細說明本發明之技術內容及特徵。
1.褐藻多醣餵食淡水長腳大蝦
將褐藻多醣溶於已滅菌處理的0.01 M的磷酸緩衝液(Phosphate buffered saline；PBS)並調整濃度為300 μg/mL。取馴養三天的淡水長腳大蝦(Macrobrachium rosenbergii
)，分為處理組和控制組，處理組餵食褐藻多醣溶液100 μL，控制組則餵食PBS溶液。
2.蝦子肝胰臟中微生物的分離與培養
將蝦子犧牲後，取出完整的肝胰臟及腸道，泡入20 mL無菌0.85% NaCl中，用研缽將溶液中的大組織磨碎，再以2000 rpm、4℃、10 min離心後取上清液，以無菌抽氣過濾瓶及5.0 μm的濾紙過濾溶液。以無菌之0.85% NaCl調整濾液至25 mL，再濃縮後進行培養實驗。
將菌液稀釋至適當濃度，以塗抹法將菌液均勻塗抹至大豆分解蛋白質乾酪素瓊脂(Tryptic soy agar；TSA)平板中，於28℃下培養隔夜或更久，先於每一組隨機挑出50個單一菌落，再於每個處理組中挑30個單一菌落。
3.菌株DNA的萃取
於每一組隨機挑選30個菌落，以大豆分解蛋白質乾酪素培養基(Tryptic soy broth；TSB)培養成菌液，取1.5 mL的菌液至離心管中，以14000 rpm離心5分鐘後去除上清液，再以567 μL的TE buffer將沈澱物懸浮後，加入20 μL溶菌酶(lysozyme)於37℃水浴槽中作用2小時，之後加入3 μL的蛋白脢溶液(proteinase solution)和30 μL的10% SDS溶液，混合均勻後置於37℃水浴槽中作用1小時以上直到溶液澄清為止。
之後加入100 μL的5M NaCl溶液，混合均勻後再加入80 μL的CTAB-NaCl溶液，此溶液必須先以65℃預熱。混合均勻後置於65℃水浴槽中15分鐘，加入700 μL的chloroform-IAA溶液，充分混合後以14000 rpm離心10分鐘，再取上清液600 μL，加入RNase 3 μL，置於37℃水
浴槽中作用30分鐘。加入600 μL的dichloromethene，充分混合後以14000 rpm離心10分鐘，再取上清液500 μL，之後加入350 μL的2-propanol，均勻混合後，在室溫作用15分鐘，以14000 rpm離心10分鐘，將上清液去除，加入冷凍的75%酒精0.5 mL沖洗沉澱，以14000 rpm離心10分鐘，將上清液去除風乾後，加入30 μL的無菌水慢慢震動溶解，放入55℃水浴槽中10分鐘。
4. 16S及18S rDNA的增幅與瓊脂膠體電泳分析
以16S rDNA引子對8F/1510R(SEQ ID NO：1,2)以及18S rDNA引子對18SF/18SR(SEQ ID NO：2,3)進行聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)增幅16S以及18S rDNA，條件如下：10×PCR buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，10 μM引子對0.5 μL，樣本DNA 2 μL，Tag DNA polymerase 0.25 μL，取無菌水補體積至25 μL於PCR小管中。以聚合酶鏈鎖反應器進行PCR反應，反應條件：經94℃作用5分鐘，接著以94℃作用1分鐘，51.5℃作用1分30秒，72℃作用1分鐘進行30個循環，最後以72℃作用10分鐘，4℃下停止反應。
PCR產物取5 μL經2%瓊脂(agarose)置於水平式電泳槽，加入0.5×的TAE緩衝溶液，以100V進行電泳反應30分鐘，並以溴化乙錠(ethidium bromide；EtBr)染色，分子量標定以100~3000 bp作為對照，電泳膠體以膠體成像系統照相。
5. 16S及18S rDNA的序列分析
將PCR後之結果產物委託陽明大學定序中心定序，將所得核酸序列結果與美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)的資料庫進行比對，找出序列最接近的已知菌種。
6.餵食褐藻多醣前後蝦子肝胰臟中微生物的組成
將控制組和處理組蝦子肝胰臟內細菌組成的16S rDNA及18S rDNA進行鑑定和分析的結果分別整理如表一與表二。
如表一所示，第0天是蝦子未經任何處理的空白組，其中肝胰臟內細菌的組成如下：G+為Lactococcus garvieae
、Enterococcus sp.
、Cellulomonas sp.
、Oerskovia sp.
及Agromyces italicus
，G-為Escherichia coli
及Thermus scotoductus
。餵食PBS第3天後，蝦子肝胰臟之菌種如下：G+為Cellulomonas sp.
、A.italicus
、O.turbata
及Brevibacterium sp.
，G-為E.coli
、Enterobacter aerogenes
、Citrobacter sp.
、Flavobacterium sp.
、Aeromonas hydrophila
及T.scotoductus
。第5天後，蝦子肝胰臟之菌種如下：G+為L.garvieae
、Agromyces sp.
、Microbacterium sp.
及O.turbata
.；G-為E.coli
及A.hydrophila
；第10天，蝦子肝胰臟之菌種如下：G+為E.faecalis
、O.turbata
、A.italicus Microbacterium sp.
及L.garvieae
；G-主要是E.coli
，分離率為66.7%(20/30)，另外還有A.hydrophila
和C.freundii
。上述結果顯示，空白組的蝦子肝胰臟內原本就帶有致病相關的病原菌，包括L.garvieae
、A.hydrophila
和C.freundii
等。
如表二所示，餵食褐藻多醣後第3天，蝦子肝胰臟之菌種如下：酵母菌Metschnikowia bicuspidate
；G+只有L.garvieae
；G-為Pantoea sp.
、Enterobacter sp
.、C. freundii
、E.coli
、Shewanella sp.
及；第5天，蝦子肝胰臟之菌種如下：酵母菌M.bicuspidate
；沒有G+菌株；G-分別為E.coli
、Acinetobacter baumannii
、Cupriavidus sp.
、Uncultured Geobacter sp.
及T.scotoductus
；第10天，蝦子肝胰臟之菌種如下：G+分別為L.garvieae
、A.italicus
、Cellulomonas sp.
及Oerskovia sp.
，G-分別為Pantoea sp
.、Enterobacter sp.
及Klebsiella sp.
；第15天，蝦子肝胰臟之菌種如下：酵母菌M.bicuspidate
；G+只有L.garvieae
，G-分別為A.hydrophila
、Pseudomonas saccharophila
、E.aerogenes
及C.freundii
。
上述結果比較處理組及控制組蝦子肝胰臟內菌相如表三所示，餵食褐藻多醣後，除第5天外，第3天和第10天在蝦子肝胰臟內雖然仍有病原菌L.garvieae
出現，但分離率下降；另外，除餵食後第3天有測定G-病原菌C.freundii
，其他時間都未發現G-病原菌A.hydrophila
和C.freundii
。此外，酵母菌M.bicuspidate
在餵食褐藻多醣後出現，且在第5天的分離率最高，達23.3%(7/30)。
將由上述分離到的所有M.bicuspidate
分離株進行19種醣類代謝分析，可分成兩群，兩群之間的醣類代謝相同比率為95%；再以18S rDNA序列比對，希望選出代謝和可能的生理功能差異較大的菌株進行後續益生菌的評估。結果發現所有分離株中的LL58及RS550兩菌株，醣類代謝相同比率為95%，但與前人發表之梅奇酵母菌屬(Metschnikowia
spp.)測試結果比較，不盡相同(表四)；此外，18S rDNA序列比對後在所有分離株之間的相似度(99.5~100%)，兩菌株的相似度結果為99%，差異較大。
根據上述結果選取LL58及RS550兩菌株(第一圖)進行以下益生菌的評估。
1.M.bicuspidate
LL58及RS550之毒性測試
將出現於褐藻多醣處理後之蝦子肝胰臟內的兩株分離株M.bicuspidate
LL58及RS550與來自哺乳動物且被確認是益生菌株的Lactobacillus plantarum
ATCC10012作為對照，將高劑量菌數以注射方式進行三菌株對蝦子的毒性測試。
分別將L.plantarum
ATCC10012、M.bicuspidate
LL58及RS550接種至腦心浸出物培養基(Brain heart infusion broth；BHIB,Difco)及TSB(Difco)，置於培養箱中(FIRSTEK SCIENTIFIC,S300R)以28℃，130 rpm震盪培養至對數期晚期(late log phase)。取15 mL菌液，以5000 rpm，4℃下離心10分鐘，以PBS(pH=7.56,420±5m Osm/kg)重新懸浮菌液，並將菌液調整濃度至1×109
CFU/mL，以1 mL針筒(25G)抽取菌液，於蝦子腹腔第一節處注射100 μL菌液，每12、24、48、72小時計數蝦子死亡數。死亡率計算公式如下：死亡率(%)=(實驗組死亡隻數-非專一死亡數)/(總數-非專一死亡數)×100%。12小時內死亡者被認定為非專一性死亡。
結果如以下表五所示，作為對照的L.plantarum
對蝦子的致死率為87%，而分別來自蝦子的M.bicuspidate
LL58及RS550的致死率為12%和22%。
2.M. bicuspidate
LL58及RS550之胞外液與致病菌共同培養
分別將三株細菌L.plantarum
、M.bicuspidate
LL58及RS550的胞外液與三株致病菌共同培養以觀察抑菌效果。將L.plantarum
、M.bicuspidate
LL58及RS550接種至MRS培養基(Oxoid)、BHIB(Difco)及TSB(Difco)，置於培養箱中以28℃，130 rpm震盪培養至不同生長時期。取40 mL菌液，以5000 rpm，4℃下離心10分鐘，取上清液40 mL，以磷酸緩衝液(Phosphate buffer；PB,pH=7.0)在4℃下進行透析18至24小時，接著以冷凍乾燥機(Labconco)濃縮上清液，以0.85% NaCl回溶，進行
抑菌測試。
將分離自蝦子肝胰臟的致病菌L.garvieae
S99及兩株來自菌種中心的致病菌Aeromonas hydrophila
及A.veronii
ATCC 9071接種至BHIB(Difco)及TSB(Difco)，置於培養箱中以28℃，130 rpm震盪培養。取適量菌液，以5000 rpm，4℃下離心10分鐘，以0.85% NaCl清洗兩次後，以低營養培養基(Poor-nutrient broth；PB)回溶，並調整菌液至OD600
為0.01，將實驗分為三組，於96孔盤中，空白組加入90 μL PB培養基及10 μL空白培養基，控制組加入90 μL菌液及10 μL空白培養基，實驗組加入90 μL菌液及10 μL各待測細菌之上清液，於28℃下培養12小時，期間每一小時以酵素連結免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)讀值儀測一次吸光值。所得到之吸光值，以控制組為基準，選取細菌於不同生長時期的時間點觀察各待測細菌之抑菌情況。
結果如第二圖至第四圖所示，三株菌株在對數期(log phase)、對數期晚期(late log phase)及穩定期(stationary phase)的胞外液皆具有抑菌作用，L.plantarum
和來自蝦子的M.bicuspidate
LL58之三個生長期的胞外液同樣皆可抑制致病菌A.hydrophila
及A.veronii
生長，前者於對數期晚期的胞外液效果最佳，抑制濃度為0.88 mg/mL，後者則是以穩定期的效果最佳，抑制濃度為3.03 mg/mL；另一株蝦子分離株M.bicuspidate
RS550對三株致病菌L.garvieae
及兩株Aeromonas
菌株的生長皆有抑制作用，以
對數期晚期的胞外液效果最佳，抑制濃度為0.076 mg/mL。
3.致病菌之胞外酵素與M.bicuspidate
LL58及RS550共同培養
將三株致病菌於不同生長時期的胞外液與兩株益生菌共同培養，以觀察抑菌效果。依照前述方法，分別將L.garvieae
S99、A.hydrophila
及A.veronii
ATCC 9071分離出胞外液後，將M.bicuspidate
LL58及RS550置於96孔盤中，於28℃下培養16小時後，以ELISA讀值儀讀取其吸光值，觀察各待測細菌之抑菌情況。
結果如第五圖與第六圖所示，M.bicuspidate
LL58皆不會被三株致病菌抑制生長，而M.bicuspidate
RS550會被L.garvieae
任一時期的胞外液抑制生長。
4.餵食M.bicuspidate
LL58及RS550後蝦子的酚氧化酵素活性變化
將M.bicuspidate
LL58和RS550(106
CFU/mL)連續餵食淡水長腳大蝦5天後，抽取蝦子的血淋巴液(hemolymph)，以3200 rpm於4℃，離心5分鐘(泛用型高速冷凍離心機，HERMLE，Z326K)後，收集上清液，即血漿樣本；血球沈澱則加入200 μL之PBS(0.01 M)緩衝液以懸浮細胞，再以12,000 rpm於4℃，離心30分鐘使細胞破裂後取上清液，即為血球細胞萃取液(hemocyte lysate supernatant；HLS)。
酚氧化酵素(phenoloxidase；PO)活性的測定以L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine；Sigma,D9628)為
受質。取50 μL HLS置於96孔微量盤中，每孔分別加入50 μL濃度為1 mg/mL之胰蛋白脢(trypsin,Sigma)或10 mM PBS，於37℃催化15分鐘後立即加入200 μL新鮮配製的1.6 mg/mL L-DOPA/10 mM PBS為受質，以ELISA讀值儀於波長490 mm下測吸光值，取前五分鐘內，每分鐘單位內OD490
，變化的最大數值代表PO於單位時間內最大活性變化量，單位時間內OD490
變化0.001為1U，PO活性則以△U/△t/mg表示。
實驗中，樣本未加入胰蛋白脢處理所測得之PO活性為樣本(血漿或血球內)自然活化的PO含量，以POS
表示；血漿中POS
數值可以代表血球的釋顆粒後於血漿中PO活性，數值越大，表示活性越強。加入胰蛋白脢處理的樣本(血漿或血球內)所測得之PO活性可被視為樣本內原含有的proPO總量，以POT
表示；血漿中的POT
數值也可以代表血球的釋顆粒作用，血球內的POT
數值則代表proPO生成量。
測定結果如第七圖所示，M.bicuspidate
RS550餵食組蝦子血漿中POS
(0.0633 U/min/mg)和POT
(1.5733 U/min/mg)均與餵食PBS的控制組(0.0667 U/min/mg及3.4533 U/min/mg)無差異，至於血球內POS
及POT
(1.0353 U/min/mg及1.5900 U/min/mg)則高於控制組(0.0700 U/min/mg及0.5567 U/min/mg)；M.bicuspidate
LL58餵食組蝦子的血球內POS
及POT
和血漿POT
(0.0667 U/min/mg、0.5667 U/min/mg及1.6000 U/min/mg)與控制
組(0.0700 U/min/mg、0.5567 U/min/mg及3.4533 U/min/mg)無差異，而血漿POS
(0.1800 U/min/mg)則高於控制組(0.0667 U/min/mg)；當M.bicuspidate
LL58及RS550混合餵食組蝦子後，血漿中的POS
(0.0933 U/min/mg)和POT
(2.5600 U/min/mg)均與餵食PBS的控制組(0.0667 U/min/mg及3.4533 U/min/mg)無差異，至於血球內POS
及POT
(3.5233 U/min/mg及4.9467 U/min/mg)則高於控制組(0.0700 U/min/mg及0.5567 U/min/mg)。
比較實驗組與控制組蝦子的PO活性活化比如表六所示，可以發現M.bicuspidate
RS550餵食組蝦子的血漿及血球內活化比(0.0402及0.6511)皆高於控制組(0.0193及0.1257)；而M.bicuspidate
LL58餵食組的血球內活化比(0.1177)和控制組(0.1257)無差異，但血漿活化比(0.1125)高於控制組(0.0193)；混合兩株益生菌餵食組蝦子的血漿及血球內活化比(0.0364及0.7123)皆高於控制組(0.0193及0.1257)。
由於proPO活化系統是在釋出血球進入血漿中才開始影響並增強其他防禦活性。由PO活性比結果可以發現，以M.bicuspidate
RS550餵食5天的蝦子血漿POS
及POT
和控制組無差異，但是血球內之POT
卻明顯高出控制組，此結果顯示餵食M.bicuspidate
RS550可適當提升蝦子的免疫力，推測當感染發生時，RS550餵食之蝦子血球能釋出較多且較高活性的proPO活化系統；至於M.bicuspidate
LL58餵食組，其血漿POS
高於控制組，表示此時蝦子的免疫力已受激活至一定的程度；而混合餵食組的血球內POT
明顯高出控制組，且高於M.bicuspidate
RS550餵食組，顯示混合M.bicuspidate
RS550與LL58餵食蝦子更能達到提昇免疫力的作用。
總結，餵食兩株益生菌M.bicuspidate
RS550與LL58能提高血漿與血球內的proPO活化系統活性，由於血球內的表現比血漿明顯，推測餵食兩株益生菌可以適度的增強蝦子免疫力，但應該不會造成蝦子過度的發炎現象。
5.餵食M.bicuspidate
LL58及RS550後蝦子的易感性測試
分別將兩株益生菌M.bicuspidate
LL58及RS550接種至BHIB(Difco)及TSB(Difco)，置於培養箱中以28℃，
130 rpm震盪培養至對數期晚期。取適量菌液，以5000 rpm，4℃下離心10分鐘，以PBS(pH=7.56，420±5m Osm/kg)重新懸浮菌液，並將菌液調整至濃度至1×107
CFU/mL。使用1 mL空針筒接上細軟管，以軟管接觸蝦口器，先讓蝦的口器吸住管子，注入菌液100 μL，連續餵食五天。
致病菌L.garvieae
接種至BHIB(Difco)，置於28℃培養箱中，130 rpm震盪培養至對數期晚期。取適量菌液，以5000 rpm，4℃下離心10分鐘，以PBS(pH=7.56，420±5m Osm/kg)重新懸浮菌液，並將菌液調整至濃度至5×109
CFU/mL，於蝦子腹腔第一節處注射100 μL菌液，每12、24、48、72小時計數蝦子死亡數。依照前述死亡率計算公式，換算得到專一性死亡率。
實驗共分為八組，每組的實驗用蝦子為40尾。控制組皆餵食PBS，一組以PBS注射，另一組以致病菌L.garvieae
注射，實驗組兩組餵食益生菌M.bicuspidate
LL58，一組以PBS注射，另一組以致病菌L.garvieae
注射，另兩組餵食M.bicuspidate
RS550，一組以PBS注射，另一組以致病菌L.garvieae
注射，最後兩組餵食M.bicuspidate
LL58及RS550各50 μL的混合菌液，一組以PBS注射，另一組以致病菌L.garvieae
注射。
結果如表七所示，PBS餵食組感染後皆死亡(死亡率100%)，而M.bicuspidate
RS550餵食組及M.bicuspidate
LL58餵食組蝦子死亡率分別為29%及27%，混合M.bicuspidate
RS550與LL58餵食組蝦子死亡率為0%。
由上述易感性實驗結果可知，M.bicuspidate
RS550餵食組的蝦子存活率和M.bicuspidate
LL58餵食組相同，顯示兩分離株對蝦子增進抵抗力的效果相當，然混合兩株分離株餵食組蝦子後並無死亡，表示有最好的增進效果。
整理上述實驗結果如表八所示，褐藻多醣餵食蝦子後出現的M.bicuspidate
RS550和LL58兩分離株經由益生菌特性分析發現，兩分離株對致病菌的抑制作用和對蝦子無(或弱)毒性及降低易感性(增進抵抗力)的特性，可以作為蝦子的益生菌，應用於水產養殖上。
1.飼料的製作
將空白飼料(由屏東科技大學鄭文騰教授提供)分別與PBS、褐藻酸(Alginic W201502，Sigma)、M.bicuspidate
LL58菌液、RS550菌液或兩菌株混合液，以1：1的重量體積比例(W/V)混和後，以3 mL空針筒去除針頭將飼料擠出，風乾30分鐘，再將飼料切成約3 mm的大小，如第八圖所示。將10顆飼料溶於10 mL的0.85% NaCl中，作10倍連續稀釋，之後取稀釋倍數為103
、104
、105
各100 μL推平板，28℃培養17小時後，計數平板上的菌落數乘以稀釋倍數，回推平均每顆飼料所含菌數。
將空白飼料粉加入褐藻酸製作成的飼料，投入池水後測試溶解時間，結果顯示添加褐藻酸液的飼料顆粒在水中經過約15分鐘後才開始散開，未添加的對照組於5分鐘即散開。其後實驗所用的飼料都有添加褐藻酸，確保蝦子能夠吃到完整的飼料。將大小約3 mm混合益生菌的飼料餵
食蝦子時，於15分鐘內飼料能順利被蝦子尋獲並食用。
為確實掌握蝦子每次口服的活菌數，測得每顆飼料平均含菌數為104
CFU/mL。將飼料保存於4℃後，連續5天測得每顆飼料中的菌數都能維持在104
CFU/mL(表九)。
2.餵食飼料後蝦子的易感性測試
將致病菌L.garvieae
接種至TSB(Difco)，置於28℃培養箱中，以130 rpm震盪培養到後對數期。取適量菌液，以6000 rpm，4℃下離心10分鐘，再以PBS(pH=7.56，420±5m Osm/kg)重新懸浮菌液，並將菌液調整濃度至1×109
CFU/mL備用。
製作分別含有褐藻酸、LL58、RS550以及混合LL58與RS550的實驗組飼料，控制組飼料則未包裹任何物質。連續餵食蝦子5日，第6日口服感染致病菌L.gariveae
的菌液(109
CFU/mL)，使用1 mL空針筒接上細軟管，吸取菌液，再將軟管接觸蝦子口器，當蝦的咬住軟管後再注入菌液100 μL，每12、24、48、72小時觀察蝦子死亡數，依照前述公式換算得到專一性死亡率。此易感性實驗共進
行兩次，結果分別如表十與表十一所示。
第一次易感性實驗的死亡率為：控制組50%、褐藻酸組25%、LL58組11.5%、RS550組12.5%、混合組11.1%。第二次易感性實驗的死亡率為：控制組46.7%、褐藻酸組23.1%、LL58組11.1%、RS550組11.8%、混合組11.8%。
由兩次餵食的實驗結果可知，不論是單獨餵食M. bicuspidate
LL58、RS550或者是混合兩分離株餵食，均可有效降低易感性以及死亡率
3.餵食飼料後蝦子的酚氧化酵素活性測試
酚氧化酵素活性測試方法如實驗二所述。於連續餵食含益生菌飼料5日後，在進行致病菌感染實驗前及感染後第2天抽取蝦子血淋巴液，分別測定血球細胞內和血漿的POT
，每組實驗用蝦為10尾。結果如第九圖所示，連續餵食含益生菌飼料5日後褐藻酸組、LL58組、RS550組和混合組蝦子血漿的POT
活性分別為83.76、113.85、115.22及64.49 U/min/mg，四組蝦子的之POT
皆高於控制組的29.6 U/min/mg。各組蝦子的血球內POT
結果發現，除了LL58組(69.05 U/min/mg)低於控制組(77.46 U/min/mg)外，其他三組皆高於控制組，分別是RS550組胞內POT
為21.19 U/min/mg、褐藻酸組為117.1 U/min/mg、以及混合組的87.4 U/min/mg。
將含益生菌LL58、RS550、兩株菌混合、褐藻酸及對照組之飼料連續餵食蝦子5日後，進行蝦子的易感性實驗，並於感染2日後測POT
的結果如第十圖所示。控制組血漿中POT
為67 U/min/mg，血球內為91.89 U/min/mg；LL58血漿為74.8 U/min/mg，血球內為92.25 U/min/mg；RS550血漿121.96 U/min/mg，血球內141.09 U/min/mg；褐藻酸組血漿62.35 U/min/mg，血球內77.48 U/min/mg，兩株益生菌混合組的血漿內為89.57 U/min/mg，血球內為37.96 U/min/mg。
當蝦子受到L.garvieae
感染後，餵食組血球細胞釋顆粒作用高於控制組，且血球內也能持續生成proPO，維持高於或與控制組相當的合成量。由結果可推測，餵食分離株確實能提升蝦子的免疫力。
4.餵食飼料後蝦子的穀胱甘肽過氧化酶活性測試
穀胱甘肽過氧化酶(Glutathione peroxidase；GPx)活性測定係以市售的檢測套組(Glutathione peroxidase assay kit,Fortress Diagnostics)測定蝦子血漿中GPx活性，血漿萃取液的萃取方法如先前實驗所述。
連續餵食飼料5日後的蝦血球內GPx活性測試結果如第十一圖所示，褐藻酸組、LL58組及RS550組皆與控制組無明顯差異，唯混合組的GPx活性為6776.71 U/cells，高於控制組。感染兩日後測得的GPx活性，除了混合組活性4837.23 U/cells仍高於控制組外，其他四組GPx活性依然與控制組無差異。與感染兩日後測得GPx活性相比，感染後4日測得的每一組活性皆降低。由結果可推測，餵食益生菌也能提升蝦子的抗氧化力。
在此必須說明者為，以上所為之詳細描述，僅係為了說明本發明之技術內容及特徵而提供之一實施方式，凡在本發明領域中具有一般通常知識之人，在瞭解本發明之技術內容及特徵之後，於不違背本發明之精神下，所為之種種簡單之修飾、替換或構件之減省，皆應屬於以下所揭示之申請專利範圍之內。
第一圖為對數生長晚期之M.bicuspidate
LL58和M.bicuspidate
RS550的掃描式電子顯微鏡照片。
第二圖為L.plantarum
胞外液對三株致病菌生長的抑制作用實驗結果。
第三圖為M.bicuspidate
LL58胞外液對三株致病菌生長的抑制作用實驗結果。
第四圖為M.bicuspidate
RS550胞外液對三株致病菌生長的抑制作用實驗結果。
第五圖為三株致病菌胞外液對M.bicuspidate
LL58生長的抑制作用實驗結果。
第六圖為三株致病菌胞外液對M.bicuspidate
RS550生長的抑制作用實驗結果。
第七圖為餵食益生菌後之淡水長腳大蝦血漿及血球內酚氧化酵素活性POS
和POT
測試結果。
第八圖為製備包裹活菌後的飼料顆粒
第九圖為各組連續餵食不同飼料五天後之淡水長腳大蝦血漿及血球內總酚氧化酵素活性POT
測定結果。
第十圖為以Lacotoccus garvieae
進行易感性實驗後兩天餵食不同飼料的淡水長腳大蝦之血漿及血球內總酚氧化酵素活性POT
測定結果。
第十一圖為以Lacotoccus garvieae
進行易感性實驗後2天與4天餵食不同飼料的淡水長腳大蝦之血球內穀胱甘肽過氧化酶活性測定結果。
<110> 東吳大學
<120> 梅奇酵母菌株、含有該菌株之組合物及其用途
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
Claims (10)
- 一種梅奇酵母菌株(Metschnikowia bicuspidate )RS550，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920081。
- 如請求項第1項所述之菌株，該菌株係分離自淡水長腳大蝦(Macrobrachium rosenbergii )。
- 一種梅奇酵母菌株(Metschnikowia bicuspidate )LL58，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920082。
- 如請求項第3項所述之菌株，該菌株係分離自淡水長腳大蝦(Macrobrachium rosenbergii )。
- 一種如請求項第1項或第3項所述之菌株，其於水產養殖之用途。
- 一種如請求項第1項或第3項所述之菌株，其作為益生菌之用途。
- 一種如請求項第1項或第3項所述之菌株，其於增加蝦子免疫力之用途。
- 一種組合物，包含有：一飼料；以及至少一種微生物菌株，其中該微生物菌株係選自如請求項第1項或第3項所述之菌株中之一種或兩種。
- 如請求項第8項所述之組合物，更包含有一褐藻酸。
- 如請求項第8項所述之組合物，其中該組合物中的菌數為104 ~105 CFU/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101146069A TWI460269B (zh) | 2012-12-07 | 2012-12-07 | A myristic yeast strain, a composition containing the strain and the use of the strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW101146069A TWI460269B (zh) | 2012-12-07 | 2012-12-07 | A myristic yeast strain, a composition containing the strain and the use of the strain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201422812A TW201422812A (zh) | 2014-06-16 |
| TWI460269B true TWI460269B (zh) | 2014-11-11 |
Family
ID=51393814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW101146069A TWI460269B (zh) | 2012-12-07 | 2012-12-07 | A myristic yeast strain, a composition containing the strain and the use of the strain |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI460269B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL2021015B1 (en) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | Biobest Group Nv | Beneficial metschnikowiaceae yeast cells, fragments thereof, or substances produced thereby for animals |
| CN112501039B (zh) * | 2020-11-11 | 2024-02-02 | 大连海洋大学 | 二尖梅奇酵母菌及处理高盐废水的方法 |
-
2012
- 2012-12-07 TW TW101146069A patent/TWI460269B/zh active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 彭怡瑄，" 餵食褐藻多醣前後淡水長腳大蝦肝胰臟內可培養細菌的變化及益生菌的分離和定性"， 東吳大學 微生物學系，2012年07月18日 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW201422812A (zh) | 2014-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zuo et al. | Screening of intestinal probiotics and the effects of feeding probiotics on the growth, immune, digestive enzyme activity and intestinal flora of Litopenaeus vannamei | |
| Kavitha et al. | Evaluation of probiotic potential of Bacillus spp. isolated from the digestive tract of freshwater fish Labeo calbasu (Hamilton, 1822) | |
| Ringø et al. | Probiotics, lactic acid bacteria and bacilli: interesting supplementation for aquaculture | |
| Chen et al. | Dietary administration of probiotic Paenibacillus ehimensis NPUST1 with bacteriocin-like activity improves growth performance and immunity against Aeromonas hydrophila and Streptococcus iniae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) | |
| Hao et al. | Effects of dietary administration of Shewanella haliotis D4, Bacillus cereus D7 and Aeromonas bivalvium D15, single or combined, on the growth, innate immunity and disease resistance of shrimp, Litopenaeus vannamei | |
| Maeda et al. | Isolation of lactic acid bacteria from kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) intestine and assessment of immunomodulatory role of a selected strain as probiotic | |
| Wu et al. | Enhancement of the immune response and protection against Vibrio parahaemolyticus by indigenous probiotic Bacillus strains in mud crab (Scylla paramamosain) | |
| Chi et al. | Effects of three strains of intestinal autochthonous bacteria and their extracellular products on the immune response and disease resistance of common carp, Cyprinus carpio | |
| Mohapatra et al. | Aquaculture and stress management: a review of probiotic intervention | |
| Jiang et al. | Effects of dietary supplementation of probiotic Shewanella colwelliana WA64, Shewanella olleyana WA65 on the innate immunity and disease resistance of abalone, Haliotis discus hannai Ino | |
| Yang et al. | Effects of dietary Bacillus cereus G19, B. cereus BC-01, and Paracoccus marcusii DB11 supplementation on the growth, immune response, and expression of immune-related genes in coelomocytes and intestine of the sea cucumber (Apostichopus japonicus Selenka) | |
| Yang et al. | Lactic acid bacteria, Enterococcus faecalis Y17 and Pediococcus pentosaceus G11, improved growth performance, and immunity of mud crab (Scylla paramamosain) | |
| Merrifield et al. | The current status and future focus of probiotic and prebiotic applications for salmonids | |
| Nimrat et al. | Enhancement of growth performance, digestive enzyme activities and disease resistance in black tiger shrimp (Penaeus monodon) postlarvae by potential probiotics | |
| Farzanfar | The use of probiotics in shrimp aquaculture | |
| Gong et al. | A new isolate of Pediococcus pentosaceus (SL001) with antibacterial activity against fish pathogens and potency in facilitating the immunity and growth performance of grass carps | |
| Abumourad et al. | Evaluation of Lactobacillus plantarum as a probiotic in aquaculture: emphasis on growth performance and innate immunity | |
| Guo et al. | Selection of probiotic bacteria for use in shrimp larviculture | |
| Karthik et al. | Effectiveness of Lactobacillus sp (AMET1506) as Probiotic against Vibriosis in Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei Shrimp Aquaculture | |
| Meidong et al. | Isolation and selection of lactic acid bacteria from Thai indigenous fermented foods for use as probiotics in tilapia fish Oreochromis niloticus | |
| Ma et al. | Effects of tussah immunoreactive substances on growth, immunity, disease resistance against Vibrio splendidus and gut microbiota profile of Apostichopus japonicus | |
| Castex et al. | Probiotic applications in crustaceans | |
| Purivirojkul | Application of probiotic bacteria for controlling pathogenic bacteria in fairy shrimp Branchinella thailandensis culture | |
| EP2668260A1 (en) | Method of modifying bacteria | |
| Wang et al. | Effects of supplementing intestinal autochthonous bacteria in plant-based diets on growth, nutrient digestibility, and gut health of bullfrogs (Lithobates catesbeianus) |