CN115947802A - 一种抗菌物质吉类菌素的制备及重组表达方法和医用用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌物质吉类菌素的制备及重组表达方法和医用用途，从吉林类芽孢杆菌培养上清中纯化得到一种新型细菌素类抗菌物质‑‑吉类菌素，确定了其氨基酸序列特征和编码基因，应用大肠杆菌原核表达系统获得了具有抗菌活性的重组吉类菌素。吉类菌素具有强抗菌活性，较宽抗菌谱，优良稳定性，极低细胞毒性和溶血活性，并且不产生耐药性。牛奶保鲜应用分析显示，吉类菌素能高效杀灭牛奶中的屎肠球菌，延长牛奶保存期，且不影响牛奶品质。动物抗感染实验表明，吉类菌素对小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染具有显著治疗作用。
Description
技术领域
本发明公开一种吉类菌素，为一种新型抗菌物质，尤其是提供了吉类菌素的制备及重组表达方法，同时还提供了吉类菌素在制备抗细菌感染药物中的医用用途，属于生物医药技术领域。
背景技术
耐药细菌对动物养殖和人类健康构成了巨大威胁，开发能有效抵抗耐药细菌的新型抗菌物质显然已成为迫切需要。然而正在研发的化学合成抗生素很少，而且其中大多数是当前抗生素的衍生物。因此，不断寻求新型抗菌药物已成为人们的共识。畜禽养殖中抗生素类药物作为饲料添加剂和治疗药物广为使用，但抗生素的长期不合理使用，带来严重的安全性问题如药物残留和病原菌耐药性扩散。故而寻找高效、广谱、无残留、无耐药性、低副作用的抗生素替代品，是近些年来人们一直努力的目标。抗菌蛋白或多肽具有独特的结构序列、作用机制和高效的杀菌效果，同时和传统的抗生素基本不会产生交叉耐药现象，因而是抗生素的最佳替代品。
细菌素是微生物在进化过程中产生的一类防御分子，是由特定细菌产生的蛋白质或多肽，能抑制其他微生物定植和生长。细菌素类抗菌蛋白或多肽体现出对耐药致病菌杀菌活性强，而对于益生菌杀菌活性弱的特征。细菌素的这种选择性作用，使其在纠正肠道菌群失调和拮抗致病菌方面具有良好优势。细菌素不易诱导致病菌耐药性产生，对真核细胞毒性低，易于降解和残留少。细菌素类抗菌蛋白或多肽因其独特的结构序列、作用机制和高效杀菌效果，不易产生耐药性，同时和传统抗生素基本不会产生交叉耐药，有着广阔的应用前景，成为新一代的抗生素替代品而备受青睐。乳酸乳球菌产生的乳酸链球菌素（也称乳链菌肽、Nisin）是发现早、研究清楚的细菌素，自1950年以来已作为食品防腐剂和兽药得以广泛应用。
发明内容
本发明公开的一种吉类菌素，为一种新型含SIMPL结构域蛋白，属于细菌素样抗菌物质，由吉林类芽孢杆菌产生的抗菌物质，它显示可以拮抗多种病原菌的生长，具有抗感染的医用用途。
本发明所述的一种吉类菌素，是由吉林类芽孢杆菌（中国专利CN 112574929 A中公开了从鸡肠道分离获得的芽孢杆菌属菌种）产生的抗菌物质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供的一种吉类菌素的纯化制备方法，包括如下步骤：
1、发酵上清制备：将-80℃冻存的吉林类芽孢杆菌在TSB平板划线，37℃培养至形成单菌落，然后挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养12h，然后以1%比例转接至5L TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养10 h，10000rpm离心10min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；
2、粗提液制备：将发酵上清以70%饱和度的硫酸铵进行4℃沉淀过夜，之后10000rpm离心20min，收集沉淀，以蒸馏水复溶之后用1000 Da的透析袋进行透析，直至硫酸铵被完全去除，然后冷冻干燥获得粗提物；
3、纯化：将粗提物应用凝胶过滤层析和HPLC进行纯化。将粗提物通过Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，流速1ml/min，以0.22μm滤膜过滤的无菌蒸馏水进行洗脱，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，测定抗菌活性确定目标峰；将目标峰利用C18液相色谱柱经HPLC进行进一步纯化，流动相为A，蒸馏水；B：乙腈，0-20min线性洗脱，多次重复进样后，将抗菌目标峰合并，冷冻干燥获得吉类菌素。
本发明进一步提供了吉类菌素的重组表达方法，包括以下步骤：
1、基因片段扩增：设计相应引物，扩增吉类菌素基因片段，经酶切和连接，构建表达载体pET28a，并且通过转化构建表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）；
2、诱导表达：16℃，180 rpm，LB培养基中培养，应用1 mM咪唑诱导24 h；
3、纯化：超声破碎菌体后，应用镍柱进行亲和层析纯化，分别用20 mM、100mM、500mM咪唑进行洗脱，收集500 mM咪唑洗脱部分，应用超滤除去咪唑等杂质，纯化得到重组表达吉类菌素。
本发明还公开了吉类菌素在牛奶保鲜中的应用。
本发明还公开了吉类菌素在制备治疗小鼠金黄色葡萄球菌感染药物的用途，具有对小鼠和大蜡螟幼虫金黄色葡萄球菌感染的治疗作用。
本发明的积极效果在于：提供了一种新的抗菌物质----吉类菌素，由吉林类芽孢杆菌产生，是一种新型含SIMPL结构域蛋白，可以拮抗多种病原菌的生长，特别是针对耐药菌株也体现出优异抗菌活性，具有强抗菌活性，较宽抗菌谱，优良稳定性，极低细胞毒性和溶血活性，并且不产生耐药性。牛奶保鲜应用分析显示，吉类菌素能高效杀灭牛奶中的屎肠球菌，延长牛奶保存期，且不影响牛奶品质。动物抗感染实验表明，吉类菌素对小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染具有显著治疗作用。总之，本发明提供了一种强抗菌、性质稳定、无毒的新型细菌素-吉类菌素，可开发为饲料添加剂、抗感染药物和食品保鲜剂等。
附图说明
图1为本发明吉类菌素的HPLC分析及SDS-PAGE检测；
图2为本发明吉类菌素的重组表达及抗菌活性检测；
图3为本发明吉类菌素对牛奶防腐保鲜作用分析；
图4为本发明吉类菌素对大蜡螟幼虫金黄色葡萄球菌感染的治疗作用；
图5为本发明吉类菌素对小鼠金黄色葡萄球菌感染治疗后各组织脏器荷菌分析；
图6为本发明吉类菌素对小鼠金黄色葡萄球菌感染治疗后病理组织学分析。
具体实施方式
下面由一些特定的具体实施例进一步说明本发明。应当明确，下面所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，或按照商品说明书进行。
实施例1
发酵上清制备：
将-80℃冻存的吉林类芽孢杆菌YPG26在TSB平板划线，37℃培养至形成单菌落，然后挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养12h，调节OD600=1，然后以1%比例转接至5L TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养10 h，10000rpm离心10min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；
粗提液制备：
将发酵上清以70%饱和度的硫酸铵进行4℃沉淀过夜，之后10000rpm离心20min，收集沉淀，以一定量的蒸馏水复溶，之后用1000 Da的透析袋进行透析，直至硫酸铵被完全去除，然后冷冻干燥获得粗提物；
纯化及鉴定：
将粗提物应用凝胶过滤层析和HPLC进行纯化。将粗提物通过Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，流速1ml/min，以0.22μm滤膜过滤的无菌蒸馏水进行洗脱，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，测定抗菌活性确定目标峰；将目标峰利用C18反相色谱柱进一步经HPLC进行纯化，流动相为A：蒸馏水，流动相B：乙腈，0-20min线性洗脱，多次重复进样后，将有抗菌活性的洗脱液峰合并，冷冻干燥获得吉类菌素；进一步用分析型HPLC检测纯度和用SDS-PAGE检测分子量大小，结果如图1显示，具有较高的纯度且SDS-PAGE检测在接近23kDa处有单一条带。然后将单一条带切下进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，结果显示为一种新型含SIMPL结构域蛋白，属于细菌素样抑制物质，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，由此进一步结合吉林类芽孢杆菌基因组，确定吉类菌素的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
根据鉴定的吉类菌素氨基酸序列及比对分析获得的相应编码基因，并参考相关生物信息学分析结果，设计了JC-1/2/25/37共4个引物：
表1 吉类菌素重组表达引物
以吉林类芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增吉类菌素目的基因。之后将吉类菌素各目的基因片段与表达载体pET-28a质粒，经酶切、连接、转化后，应用菌液PCR对阳性克隆进行检测，显示表达载体构建成功；
将测序正确的重组质粒转化至表达菌株（大肠杆菌BL21（DE3））中，应用菌液PCR筛选获得阳性克隆表达菌株；
应用IPTG进行诱导表达，随后应用Ni柱亲和层析进行纯化，结果如图2显示，用500mM咪唑洗脱，均得到纯的目的蛋白，表明吉类菌素表达成功。抗菌活性分析显示，重组表达获得的JC-2片段具有抗菌活性，表明吉类菌素可被重组表达成功，也证明了分析获得的编码基因是吉类菌素的编码基因。
实施例3：
吉类菌素的抗菌谱分析：应用微孔板肉汤稀释法进行吉类菌素对各种病原菌MIC进行测定。将吉类菌素用MHB培养基稀释至浓度分别为8、6、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/ml，然后分别加到无菌的96孔板中，每孔50μL。以不加抗菌物质，加50μL培养基作为对照。取各病原菌划线，挑取单菌落至3ml MHB培养基中，200rpm过夜培养，然后以1%的比例转接各菌至新的MHB培养基中，37℃，200rpm，摇晃培养至对数期；调节处于对数期的各病原指示菌浓度约为1×106CFU/ml，向每孔中加50μL（即细菌终浓度为5×105CFU/ml），混合均匀后置于37℃培养箱，孵育16~20h判断结果。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低抗菌物质浓度为MIC。
结果如下表2所示，吉类菌素可以抑制多种病原菌的生长，包括屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等。
表2 吉类菌素的抗菌活性测定
实验例1
吉类菌素在牛奶保鲜中的应用
向从当地市场购买的牛奶中接种对数生长期的屎肠球菌，使其浓度为 106 CFU/mL，然后在牛奶中加入吉类菌素，使终浓度为 25、50 和 100mg/kg。混合均匀后，所有处理组均在4℃下孵育 1 周，在孵育期间，每24小时取100μL进行10倍连续适当稀释，然后将100μL稀释液涂布于TSB 琼脂板上，并在37℃下孵育过夜，菌落计数并计算每毫升的CFU。结果如图3所示，在用50和100 mg/kg浓度的吉类菌素处理（低于500 mg/kg的中国牛奶添加量限定值）48h后，与对照相比，处理组屎肠球菌的生长被抑制，且添加吉类菌素不改变牛奶性状。吉类菌素处理1周后，与对照组相比，50mg/kg 吉类菌素处理组屎肠球菌减少3.4 log10，而100mg/kg 吉类菌素处理组减少4.27 log10，远低于中国制定的牛奶中2×106 CFU/g(mL)的检出限（GB19301-2010），并且质量浓度分别为50 mg/kg和100 mg/kg吉类菌素的抗菌效力均极显著强于100 mg/kg乳酸链球菌素，考虑到吉类菌素的分子量（23kDa）是乳酸链球菌素（3.3kDa）的7倍，相同质量浓度的吉类菌素和乳酸链球菌素，前者的摩尔浓度实际低于后者7倍，由此证明，吉类菌素在食品保鲜应用中的潜力和优势，并且吉类菌素的抗菌作用显著强于同等浓度的食品防腐保鲜剂乳酸链球菌素。添加吉类菌素不影响牛奶的基本特性包括色泽、状态、气味和pH值等。因此，吉类菌素在食品保鲜中具有良好的潜力。
实验例2
吉类菌素对小鼠和大蜡螟幼虫金黄色葡萄球菌感染的治疗作用
向大蜡螟幼虫腹腔注射1×107cfu/只金黄色葡萄球菌，构建大蜡螟幼虫金葡菌感染模型。感染1h后，用8 mg/kg、16mg/kg的吉类菌素进行治疗，观察大蜡螟幼虫的存活情况，并且检测治疗24h后的大蜡螟幼虫血淋巴金黄色葡萄球菌荷菌数。结果如图4显示，8 mg/kg、16mg/kg的吉类菌素治疗组，可显著增加大蜡螟幼虫的存活率，并且显著降低血淋巴的金黄色葡萄球菌荷菌数。这些结果证明在大蜡螟幼虫体内，吉类菌素具有良好的抗感染作用。
通过建立小鼠金葡菌呼吸道感染肺炎模型，进一步评价吉类菌素的抗感染作用。结果如图5可见，与金葡菌USA300感染组相比，吉类菌素治疗组小鼠血液、肺以及脾脏组织中的金葡菌荷菌量显著降低，而肺泡灌洗液、肝和肾组织中的金葡菌荷菌量均有降低的趋势。这些结果证明吉类菌素对小鼠金葡菌呼吸道感染同样具有良好的治疗作用。病理组织学分析如图6显示，正常肺组织结构基本完整，边缘整齐、清晰，肺泡腔内无分泌物质。金葡菌USA300感染后，小鼠肺组织呈现明显的肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，出血，且伴随大量炎性细胞浸润。而经吉类菌素治疗后，肺损伤明显改善，表现为肺泡结构部分损伤、融合，炎性细胞明显减少。病理分析结果证明，吉类菌素可以改善金葡菌呼吸道感染小鼠的肺组织损伤，具有良好的治疗作用。
由上述实施例可以看出，本发明提供了一种抗菌物质吉类菌素，并阐明了吉类菌素的纯化制备方法，同时，提供了一种吉类菌素的重组表达方法，进一步，评估了吉类菌素的牛奶保鲜和抗感染应用，但也可以看出，在本发明基础上，可以对之做出一些修改和拓展，因此，在不偏离本发明精神和原则的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种吉类菌素，其特征在于：是由吉林类芽孢杆菌产生的抗菌物质，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的吉类菌素的制备方法，包括如下步骤：
（1）发酵上清制备：
将-80℃冻存的吉林类芽孢杆菌在TSB平板划线，37℃培养至形成单菌落，然后挑取单菌落至3ml TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养12h，然后以1%比例转接至5L TSB液体培养基中，37℃、200rpm摇晃培养10 h，10000rpm离心10min，0.22μm滤器过滤得发酵上清；
（2）粗提液制备：
将发酵上清以70%饱和度的硫酸铵进行4℃沉淀过夜，之后10000rpm离心20min，收集沉淀，以蒸馏水复溶之后用1000 Da的透析袋进行透析，直至硫酸铵被完全去除，然后冷冻干燥获得粗提物；
（3）纯化：
将粗提物应用凝胶过滤层析和HPLC进行纯化；将粗提物通过Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，流速1ml/min，以0.22μm滤膜过滤的无菌蒸馏水进行洗脱，以280nm为检测波长，收集各洗脱峰，测定抗菌活性确定目标峰；进一步将目标峰利用C18液相色谱柱经HPLC进行纯化，流动相为A，蒸馏水；B：乙腈，0-20min线性洗脱，多次重复进样后，将检测具有抗菌作用的活性峰合并，冷冻干燥获得吉类菌素。
3.权利要求1所述的吉类菌素的一种重组表达方法，其特征在于步骤为：
1）基因片段扩增：
设计相应引物，扩增吉类菌素基因片段，经酶切和连接，构建表达载体pET28a，并且通过转化构建表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）；
引物如下：
JC-1 F: CTGGGATCCAATGTAGTTAATGTGGTTGGC；
R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；
JC-2 F: CTGGGATCCATGAAAATTTGGGTCAAATC；
R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACT；
JC-25 F: CTGGGATCCGGAGATCTGTTAAGCGGAGCT；
R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；
JC-37 F: CTGGGATCCGATGAAGCCGTGCAGCGCAAT；
R: CTGCTCGAGCTATTTAAGCTCATATTGTACACTC；
2）诱导表达：
16℃，180 rpm，LB培养基中培养，应用1 mM咪唑诱导24 h；
3）纯化：
应用镍柱进行亲和层析纯化，分别用20 mM、100mM、500 mM咪唑进行洗脱，收集500 mM咪唑洗脱部分，应用超滤除去咪唑等杂质，之后冷冻干燥纯化得到重组表达吉类菌素。
4.权利要求1所述的吉类菌素在制备治疗金黄色葡萄球菌感染药物的用途。
5.权利要求1所述的吉类菌素在制备治疗小鼠和大蜡螟幼虫金黄色葡萄球菌感染药物中的用途。
6.权利要求1所述的吉类菌素在食品保鲜剂中的用途。
7.权利要求1所述的吉类菌素在制备牛奶保鲜剂中的应用。
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