KR102266287B1 - 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물 - Google Patents
벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다. 상세하게는 벌개미취 추출물은 지방분화 억제 효과 및 콜레스테롤 저하 효과를 가지며, 벌개미취 열수 추출물은 중성지방 합성 저해 효과, 지방 세포 분화 또는 축적에 결정적 역할을 하는 지방 관련 단백질인 AKT(Protein kinase B), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins α), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ), PLIN1(Perilipin 1), FABP4(Fatty Acid-Binding Protein 4), ACC1(Acetyl-CoA carboxylase 1), FAS 단백질 발현을 억제한다. 또한 지방 조직에서 지방분해 및 지방생성을 감소하는 역할을 하는 AMPK(AMP-activated protein kinase), AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가되는 효과를 가지므로 항비만 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 벌개미취 추출물을 포함하는 항비만용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 비만이란, 지방 조직이 과잉으로 몸에 축적된 상태를 말하며 건강 진단 등에서 이용되는 BMI(Body Mass Index(체격 지수), 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 것)에서 BMI가 22가 되는 체중을 표준 체중이라고 하고, 그것보다 1할 이상 많은 체중을 과체중, 2할 이상 많은 체중을 비만이라고 한다. 최근, 식생활의 구미화, 교통 기관의 발달에 의한 운동 부족 등을 이유로 비만이나 그 예비군이 증가하고 있다. 특히, 비만은 고혈압증, 당뇨병, 지방간, 동맥 경화증, 뇌경색, 고지혈증, 말초혈관 장해, 허혈성심질환의 발증과의 관련성이 높고, 이들 질환의 발증의 예방과 치료 측면에서도 비만의 예방 또는 해소가 매우 중요하게 되어왔다.
비만을 예방 또는 해소하기 위해서는, 식사 요법이나 운동 요법 등의 생활 습관의 개선이 바람직하나 용이하게 행할 수 있는 것은 아니다. 또한, 비만에 대한 치료로서는 지질 흡수 저해제, 소화 흡수 저해제 등의 약물요법도 있지만 그 사용은 중증의 비만증에 한정되어 있다.
비만을 치료하기 위한 약제로는 시상하부를 자극하여 식욕을 억제시키는 식욕억제제로 시부트라민(sibutramine), 펜터마인(phentermine), 다이에틸프로피온(diethyl-propion), 펜디메트라진(phendimetrazine), 벤즈페타민(benzphetamine), 메타페타민(methamphetamine) 등이 알려져 있으며, 췌장의 지방소화효소에 대한 저해제를 이용하여 섭취된 지방의 흡수를 억제시키는 오르리스타트(orlistat) 등도 알려져 있고, 알파-글루코시다제 저해제로 당뇨병에 사용하는 아카보스(acarbose) 등도 알려져 있다.
이러한 중에, 다채로운 작용을 가지면서도 장기간 복용시에도 부작용 등의 우려가 적은 천연물 유래 성분을 이용한 다양한 물건이 다이어트 식품 등으로서 비만의 예방이나 해소를 위해 판매되고 있고 동시에 새로운 항비만 활성을 갖는 물질의 탐색이 행하여지고 있다.
그러나, 비만은 현재까지 완치가 어려우며 불면증, 신경 불안, 두통, 혈압 상승, 위장 장애, 과민증, 담즙 분비 장애, 지용성 비타민 흡수 억제 등의 심각한 부작용이 동반되는 것으로 알려져 있다.
한편, 벌개미취(Gymnaster koraiensis)는 우리나라의 특산 다년초로서 속명으로 고려쑥부쟁이라고 불리며 국화과에 속한다. 햇볕이 잘 들고 습기가 충분한 곳에서 자라며, 특히 제주도 경기도 이남에서 재배된다. 높이는 50 ~ 60cm이며, 너비는 1.5 ~ 3cm이다. 잎은 끝이 뾰족하고 길이가 12 ~ 19cm가 되며, 너비 1.5 ~3cm로 밑 부분이 점차 좁아지며 딱딱하고 양면에 털이 거의 없으며 가장자리에 잔톱니가 있다. 여러해살이식물로 꽃은 10월에 피고 지름 4 ~ 5cm로 연한 자주색이며 가지 끝과 원줄기 끝에 달리고 총포는 반구형이며 길이는 약 13mm, 지름은 약 8mm이다. 포편은 4줄로 배열되고 외편은 길이는 4 ~ 5mm, 너비는 약 1.5mm로 긴 타원형이며, 가장자리에 털이 있다.
이러한 벌개미취 단독 추출물의 항비만 효과에 대한 연구는 보고된 바 없으므로, 본 연구자들은 벌개미취 추출물이 지방세포 분화 억제, 콜레스테롤 저하 효과 및 지방 세포 분화 또는 축적에 결정적 역할을 하는 단백질 발현 억제 효과와 지방 분해 및 지방 생성을 감소시키는 역할을 하는 단백질 발현 활성 효과가 우수하다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 벌개미취 추출물은 지방분화 억제 효과 및 콜레스테롤 저하 효과를 가진다.
또한 벌개미취 열수 추출물은 중성지방 합성 저해 효과, 지방 세포 분화 또는 축적에 결정적 역할을 하는 지방 관련 단백질인 AKT(Protein kinase B), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins α), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ), PLIN1(Perilipin 1), FABP4(Fatty Acid-Binding Protein 4), ACC1(Acetyl-CoA carboxylase 1), FAS 단백질 발현을 억제한다. 또한 지방 조직에서 지방분해 및 지방생성을 감소하는 역할을 하는 AMPK(AMP-activated protein kinase), AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가되는 효과를 가지므로 항비만 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 벌개미취 열수 추출물(A)와 벌개미취 70% 에탄올 추출물(B)의 세포독성 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 벌개미취 열수 추출물(A)와 벌개미취 70% 에탄올 추출물(B)의 지방분화 억제 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 벌개미취 열수 추출물(A)와 벌개미취 70% 에탄올 추출물(B)의 콜레스테롤 저하 활성을 나타낸 도이다.
도 4은 벌개미취 열수 추출물의 중성 지방 합성 저하 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 벌개미취 열수 추출물의 지방 관련 단백질 발현 억제 또는 증가 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 벌개미취 열수 추출물(A)와 벌개미취 70% 에탄올 추출물(B)의 지방분화 억제 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 벌개미취 열수 추출물(A)와 벌개미취 70% 에탄올 추출물(B)의 콜레스테롤 저하 활성을 나타낸 도이다.
도 4은 벌개미취 열수 추출물의 중성 지방 합성 저하 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 벌개미취 열수 추출물의 지방 관련 단백질 발현 억제 또는 증가 활성을 나타낸 도이다.
본 발명은 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 벌개미취 추출물은 물, 알코올, 유기용매 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 용매로 추출되고, 바람직하게는 열수이나 벌개미취를 효과적으로 추출하기 위한 목적을 위해서라면 이에 제한되지 않는다.
상기 벌개미취 추출물은 지방분화를 억제하고 콜레스테롤 저하 효과를 가지며, 벌개미취 열수 추출물은 지방 관련 단백질인 AKT, C/EBPα, PPARγ, PLIN1, FABP4, ACC1, FAS 단백질의 발현을 억제한다. 또한 AMPK, pAMPK 단백질 발현이 증가되는 효과를 가질 수 있다.
상기 항비만은 비만 증상을 개선하는 것으로, 상기 비만은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 체지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미한다. 비만인 경우 체지방이 체중의 25% 이상이며, 신체 비만지수(체질량지수, Body mass index: 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값)가 25 이상이면 비만으로 진단한다.
상기 체지방은 신체를 구성하는 지방조직을 의미하며 피하조직, 유선, 및 신장주위 등에 널리 분포하고, 저장지방으로 에너지에 이용되는 것 이외에 내장 보호와 체온 조절기능을 한다. 저장지방이 과잉으로 축적된 상태를 비만이라고 하며 비만에서는 합병증 예방 관점에서 체중보다 체지방의 양이 중요시 된다.
상기 "개선"은 상기 조성물을 이용하여 비만의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미하며, 상기 항비만 조성물은 간 및 혈장의 트리글리세롤 및 콜레스테롤 수준의 개선 효과가 우수하다.
상기 비만 상태에 이르면 비만 관련 대사성 질환이 동반되는데, 상기 비만 관련 대사성 질환은 뇌졸중, 고지혈증, 동맥경화, 심혈관 질환, 인슐린 항상성 또는 비알콜성 지방간 등이 있다. 따라서 간 및 혈장의 트리글리세롤 및 콜레스테롤의 수준이 개선되면 상기 대사성 질환의 개선 효과가 우수할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "유효성분으로 포함하는"은 항비만 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 비만을 유발하는 중성지방의 합성을 저해하는 것으로, 혈중 지질 농도 개선, 체중 증량 억제 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.
상기 벌개미취는 높이는 50 ~ 60cm이며, 너비는 1.5 ~ 3cm이다. 잎은 끝이 뾰족하고 길이가 12 ~ 19cm가 되며, 너비 1.5 ~3cm로 밑 부분이 점차 좁아지며 딱딱하고 양면에 털이 거의 없으며 가장자리에 잔톱니가 있다. 여러해살이식물로 꽃은 10월에 피고 지름 4 ~ 5cm로 연한 자주색이며 가지 끝과 원줄기 끝에 달리고 총포는 반구형이며 길이는 약 13mm, 지름은 약 8mm이다. 포편은 4줄로 배열되고 외편은 길이는 4 ~ 5mm, 너비는 약 1.5mm로 긴 타원형이며, 가장자리에 털이 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 제공 된다.
상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군에서 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "예방"은 병리학적 현상의 발생 빈도 또는 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 비만 증상이 상기 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.
상기 "치료"는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.
상기 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 화합물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다.
상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 약학적으로 유효한 양이 투여될 수 있으며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 상이해질 수 있으며, 적합한 총 1 일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 벌개미취 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 관련 대사성 질환 예방 또는 건강기능식품이 제공된다.
상기 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미할 수 있다.
상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의 약품 안정처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다.
상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다.
상기 건강기능식품은 대사성 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 대사성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조 및 가공될 수 있다.
구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 상기 화합물, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 상기 화합물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 상기 화합물 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 환 형태의 건강기능식품은 상기 화합물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
상기 과립형태의 건강기능식품은 상기 화합물, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
또한, 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.
이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
실시예 1. 벌개미취 추출물의 제조
벌개미취는 원예특작과학원 인삼특작부에서 재배하여 사용하였으며 상온에서 물과 70% 에탄올로 추출하여 실험에 사용하였다.
실험예 1. 전지방세포주 배양
전지방세포(3T3-L1)는 American Type Culture Collection (CL-173, ATCC, VA, USA)에서 구입하였다. 3T3-L1 세포의 생육배지로 1X penicilin/streptomycin/glutamine (P/S/G, Gibco, Canada)과 10% bovine calf serum (BCS, Gibco, Canada)가 포함된 Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM, Gibco, Canada)을 사용하였고 37℃, 5% CO₂조건하에 배양하였다.
실험예 2. 벌개미취 추출물의 세포 독성 측정
벌개미취 추출물의 세포 독성 측정을 위하여 실험예 1과 같이 배양된 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
세포독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS, Promega, WI, USA) assay를 사용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포를 96 well plate에 1×105 cell/mL로 분주하여 24시간 배양한 후 벌개미취 추출물을 25, 50, 100, 200, 300 및 400 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 후 multi plate reader (Synergy H1, Biotek, VT, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 벌개미취 열수 추출물(AKW)은 400 μg/mL 의 농도까지 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였으며, 벌개미취 70% 에탄올 추출물(AKE) 또한 100 μg/mL 의 농도까지 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
실험예 3. 벌개미취 추출물의 지방세포 분화 및 분화 억제능 측정
벌개미취 추출물의 지방세포 분화 및 분화 억제능 측정을 위하여 실험예 1과 같이 배양된 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
지방세포는 Kim 등의 방법을 사용하여 분화시켰다. 1×105 cells/mL을 12 well-plate에 세포 밀도가 100%가 될 때까지 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위한 분화유도배지는 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1 μM dexamethasone (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 μg/mL insulin (Gibco, Canada), 1X P/S/G, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Canada)이 포함된 DMEM배지를 사용하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위해 분화유도배지에서 48시간 배양한 후 insulin (10 μg/ml)이 포함된 분화유지배지로 교체하였다. 이후 48시간 간격으로 배지를 교체한 후 분화유도 상태를 확인 하였다.
분화유도과정 중에 벌개미취 추출물의 분화 억제 효능을 확인하기 위해 분화유도배지 및 분화유지배지에 추출물 0, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 μg/mL을 함께 처리하였다. 추출물을 처리하지 않고 분화 유도한 것을 대조군으로 하였으며, 비교를 위해 지방분화를 억제하는 conjugated linoleic acid (CLA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하고 분화 유도 한 것을 양성대조군으로 하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 벌개미취 열수 추출물(AKW)은 6.25 μg/mL ~ 100 μg/mL 의 모든 처리농도에서 유의적은 효과를 보여 낮은 농도에서도 우수한 지방분화 억제 활성을 나타내었으며, 벌개미취 주정분 70% 에탄올 추출물(AKE)은 25 ~ 100 μg/mL에서 농도 의존적으로 지방분화 억제 활성을 나타냄을 확인하여 지방분화 억제 활성을 가짐을 확인하였다.
실험예 4. 벌개미취 추출물의 콜레스테롤 저하 효과
벌개미취 추출물의 콜레스테롤 저하 효과 측정을 위하여 실험예 1과 같이 배양된 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
콜레스테롤 저하 실험은 Cholesterol/ Cholesteryl Ester Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 제품의 프로토콜에 따라 측정하였다. 분화 시킨 세포에 Chloroform: Isopropanol: NP-40 (7:11:0.1)을 넣어 지질을 추출하고, 원심분리기를 이용하여 상등액을 수집하였다. 상기 상등액을 50℃로 Air dry를 하고, 제품의 용매를 넣어서 37℃에서 60분 반응 시킨 후 흡광도 OD570 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 벌개미취 열수 추출물(AKW)의 경우 6.25 ~ 100 μg/mL에서 우수한 콜레스테롤 저하 효과를 나타냈으며 특히 낮은 농도인 6.25 μg/mL에서도 총 콜레스테롤 함량이 약 40 mg/dL로 벌개미취를 처리 하지 않은 대조군 대비 약 50% 억제율로 우수한 콜레스테롤 저하 효과를 가지는 것으로 나타났다.
또한 벌개미취 70% 에탄올 추출물(AKE)의 경우 25, 50, 100 μg/mL에서 우수한 콜레스테롤 저하 효과를 가지는 것으로 나타났다.
실험예 5. 벌개미취 추출물의 중성지방 합성 저해 효과
벌개미취 추출물의 중성지방 합성 저해 효과 측정을 위하여 실험예 1과 같이 배양된 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
중성지방 저하 실험은 WAKO Lab Triglyceride kit (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan)를 이용하여 제품의 프로토콜에 따라 측정하였다. 지방 분화된 세포에 extraction solvent [Hexane / isopropanol (2 : 1)]을 실온에서 30분 처리 후 상등액을 이용하여 제품의 시약을 첨가 뒤 흡광도 OD 530-550 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 벌개미취 열수 추출물(AKW)의 경우 12.5 ~ 100 μg/mL에서 우수한 중성지방 합성 저해 효과를 나타냈으며 특히 25 μg/mL에서 총 중성지방 함량이 약 0.4 nmol로 나타나 벌개미취 추출물 처리를 하지 않은 대조군 대비 약 40%의 억제율을 보여 우수한 중성지방 합성 저하 효과를 가지는 것으로 나타났다.
실험예 6. 벌개미취 추출물의 지방 관련 단백질 발현 정도 확인
벌개미취 추출물의 지방 관련 단백질 발현 정도 확인을 위하여 실험예 1과 같이 배양된 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
지방세포(3T3-L1 cell)에 벌개미취 열수 추출물(AKW)을 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL 의 농도로 처리 후 지방분화를 유도하였다. 지방분화가 된 세포에 RIPA buffer (Cell signaling, USA)로 용해한 후 얼음에서 30분간 반응시켰다. 세포 용해액을 4℃, 13,000rpm에서 20분간 원심분리하고, 상층액을 Bradford 시약(Biorad, USA)을 이용하여 단백질 정량을 하였다. 세포 용해액은 5X Lamilae buffer (iNtRON, Korea)와 혼합하여 95℃에서 5분간 가열 후 각 20μg 단백질량에 해당하는 시료를 10% SDS-PAGE에서 전기영동 하여 분리하였다. 전기영동 된 단백질은 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF; Millipore, Germany) 막에 옮겨 상온에서 30분 동안 blocking (5% skim milk in TBST) 하였다. 항체처리 후 enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection kit (Biorad, USA)로 반응하였다. 단백질 발현은 Davinci-K chemilumination (Korea)로 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 벌개미취 열수 추출물 처리를 통해 농도 의존적으로 지방 세포 분화 또는 축적에 결정적 역할을 하는 AKT, C/EBPα, PPARγ, PLIN1, FABP4, ACC1, FAS 단백질 발현 억제와 지방 조직에서 지방분해 및 지방생성을 감소하는 역할을 하는 AMPK, AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가함을 확인하였다.
Claims (10)
- 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 약학적 조성물로서,
상기 벌개미취 열수 추출물은 상온에서 물로 추출한 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 25 내지 100 μg/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 벌개미취 열수 추출물은 AMPK(AMP-activated protein kinase) 및 AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가시켜 지방 분해 및 지방 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 지방분화 억제 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 중성지방 합성 저해 효과 및 지방세포 분화 단백질 발현 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 항비만용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 벌개미취 열수 추출물은 AKT(Protein kinase B), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins α), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ), PLIN1(Perilipin 1), FABP4(Fatty Acid-Binding Protein 4), ACC1(Acetyl-CoA carboxylase 1) 및 FAS 단백질 발현을 억제하여 지방 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 항비만용 약학적 조성물. - 벌개미취 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 벌개미취 열수 추출물은 상온에서 물로 추출한 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 25 내지 100 μg/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 벌개미취 열수 추출물은 AMPK(AMP-activated protein kinase) 및 AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가시켜 지방 분해 및 지방 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 지방분화 억제 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 중성지방 합성 저해 효과 및 지방세포 분화 단백질 발현 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물. - 벌개미취 열수 추출물을 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 벌개미취 열수 추출물은 상온에서 물로 추출한 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 25 내지 100 μg/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 벌개미취 열수 추출물은 AMPK(AMP-activated protein kinase) 및 AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가시켜 지방 분해 및 지방 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 지방분화 억제 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 중성지방 합성 저해 효과 및 지방세포 분화 단백질 발현 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 비만 관련 대사성 질환은 뇌졸중, 고지혈증, 동맥경화, 심혈관 질환 및 비알코올성 지방간으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 벌개미취 열수 추출물을 포함하는 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 벌개미취 열수 추출물은 상온에서 물로 추출한 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 25 내지 100 μg/mL 농도로 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 벌개미취 열수 추출물은 AMPK(AMP-activated protein kinase) 및 AMPK의 활성화 형태인 pAMPK 단백질 발현이 증가시켜 지방 분해 및 지방 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하고,
상기 벌개미취 열수 추출물은 지방분화 억제 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 중성지방 합성 저해 효과 및 지방세포 분화 단백질 발현 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 비만 관련 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물. - in vitro 상에서 25 내지 100 μg/mL 농도의 벌개미취 열수 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 지방세포 분화 억제방법.
- in vitro 상에서 25 내지 100 μg/mL 농도의 벌개미취 열수 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, 중성지방 합성 억제방법.
- in vitro 상에서 25 내지 100 μg/mL 농도의 벌개미취 열수 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, AKT(Protein kinase B), C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding proteins α), PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ), PLIN1(Perilipin 1), FABP4(Fatty Acid-Binding Protein 4), ACC1(Acetyl-CoA carboxylase 1) 및 FAS 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 지방세포 분화 단백질의 발현을 억제시키는 방법.
- in vitro 상에서 25 내지 100 μg/mL 농도의 벌개미취 열수 추출물을 처리하는 단계를 포함하는, pAMPK 단백질의 발현을 증가시키는 방법.
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