KR20180106987A - 락토바실러스 플란타룸 tci378 및 지방 감소 및 위장 기능 향상에 있어서 그의 용도 - Google Patents

락토바실러스 플란타룸 tci378 및 지방 감소 및 위장 기능 향상에 있어서 그의 용도 Download PDF

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Abstract

락토바실러스 플란타룸 TCI378이 제공된다. 락토바실러스 플란타룸 TCI378은 수탁번호 DSM 32451로 독일 미생물 자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)에 기탁되었다. 락토바실러스 플란타룸 TCI378을 포함하는 조성물 및/또는 그 대사산물이 또한 제공된다. 상기 조성물은 지방형성의 감소, 지방 신진대사의 향상 및 위장기능의 향상 중 적어도 하나를 위해 사용된다.

Description

락토바실러스 플란타룸 TCI378 및 지방 감소 및 위장 기능 향상에 있어서 그의 용도{LACTOBACILLUS PLANTARUM TCI378 AND ITS USES IN LOSING FAT AND IMPROVING GASTROINTESTINAL FUNCTIONS}
본 출원은 2017년 3월 20일자로 미국 특허청에 제출된 미국 가출원 제 62/473,785 호에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
본 발명은 신규 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및/또는 이의 대사 산물의 용도, 특히 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및/또는 그의 대사 산물의 지방 형성 감소, 지방 대사 개선 및/또는 위장 기능 개선에 관한 용도에 관한 것이다.
오늘날 사람들은 불규칙하게 자고 일어나며, 집에서 거의 먹지 않고 스트레스를 많이 받고 운동이 부족한 생활 방식으로 살고 있어 대사 증후군, 고혈당, 고혈압 및 고지혈증 발병률이 더욱 높아지고 있다. 상기 과정은 위장관 기능 및 신진 대사의 약화에서 시작하여 일일 섭취 열량의 축적 및 지방 형성을 유발하여 변비, 비만, 만성 질환 및 심하게 사람들의 건강을 위협하는 다른 증상 또는 질병을 유발하는 것으로 여겨진다.
정기적인 운동과 일상적인 야채 섭취가 위장 기능을 향상시키고 지방 대사를 촉진시킬 수 있지만, 바쁘거나 가정에서 드물게 먹는 사람들에게는 더 편리한 접근이 필요하다. 최근에는, 위장 기능 개선 또는 지방 대사 증진과 관련된 점점 많은 제품 (예를 들어, 야채로부터 수득된 효소)이 개발되었다. 또한 프로바이오틱스가 인기 있는 연구 대상이 되었다.
친유성 프로바이오틱스(lipophilic probiotics)에 대한 논의는 지방을 소실할 때 프로바이오틱스를 사용하는 사람들에게 희망을 가져 왔지만, 연구진은 이미 발견된 프로바이오틱스 중 어느 것도 이미 지질을 분해함으로써 생존할 수 없음을 지적했다. 사람의 위장관에서 그람-음성균은 지질을 분해함으로써 생존할 수 있지만 지나치게 많은 지질 섭취는 그람-음성균의 극적인 증식을 유발하고, 병원체의 표면에 존재하는 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS)는 인체에 염증을 유발할 수 있고, 따라서 비만, 당뇨병, 심혈관 질환, 심지어는 암을 유발할 수 있다.
사람에게 나타나는 프로바이오틱스 중 하나인 락토바실러스 (Lactobacillus)는 다양한 발효 식품의 제조에 사용될 수 있다. 락토바실러스 속의 많은 박테리아가 FDA (Food and Drug Administration)의 GRAS 과정 (일반적으로 안전하다고 인정됨)을 통해 식품 첨가물로 분류된다.
본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378을 분리하여 균주 및 그 대사 산물이 지방 형성을 감소시키고, 지방 대사를 촉진 시키며, 위장 기능을 개선 시키는데 효과적이라는 것을 발견하였다.
본 발명의 목적은 독일 미생물 및 세포배양센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)에 수탁 번호 DSM 32451로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및 그의 대사 산물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조성물의 제조에서의 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및 그의 대사 산물의 용도를 제공하는 것이다
본 발명에 따라 제공되는 조성물은 지방 형성 감소, 지방 대사 증진, 체지방 형성 차단 및 위장 기능 개선 중 적어도 하나를 위해 사용된다. 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료(feed) 조성물이다. 바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 경구 투여를 위한 형태로 제공된다. 상기 식품 조성물은 건강식품, 식이보조제(dietary supplement), 기능성 식품, 영양 보조식품 또는 특수 영양 식품이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 유효량의 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 지방 손실 및/또는 위장 기능 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 위해 구현된 상세한 기술 및 바람직한 실시예는 청구 범위에 기재된 발명의 특징을 당업자가 잘 이해할 수 있도록 첨부된 도면을 수반하는 다음의 단락에서 설명된다.
도 1 내지 4는 상이한 배지로 처리된 지방 세포의 결과를 도시하며, 이때,
도 1은 처리 및 염색된 세포를 보여주는 사진이며(화살표로 표시된 어두운 영역은 유적),
도 2는 대조군과 비교하여, 각 다른 군에서의 지질의 상대적 함량을 나타낸다 (**는 결과가 대조군의 결과와 유의한 차이가 있음을 나타내며, p <0.01; ##는 결과가 블랭크군(blank group)의 결과와 유의한 차이가 있음을 나타냄, p <0.01),
도 3은 대조군과 비교하여, 각 다른 군의 세포에서 PLIN1 유전자의 발현 정도를 나타내며(*는 결과가 대조군의 결과와 유의하게 차이가 있음을 나타내며 (p <0.05), **는 결과가 대조군의 결과와 유의하게 차이가 있음을 나타내며, p <0.01; #는 결과가 블랭크군의 결과와 유의하게 다름을 나타냄, p <0.05)
도 4는 대조군과 비교하여, 각 군의 세포에서 GLUT4 유전자의 발현 정도를 나타내며(**는 결과가 대조군의 결과와 유의하게 다르다는 것을 나타내며 p<0.01; #는 결과가 블랭크군의 결과와 유의하게 다름을 나타냄, p <0.05) 그리고, 여기서 대조군의 세포는 지방 세포 유지 배지에서 배양하였고, 블랭크군의 세포는 1 % MRS 브로스를 포함하는 지방 세포 유지 배지에서 배양하고, TCI378군의 세포는 1 % TCI378 샘플을 함유하는 지방 세포 유지 배지에서 배양함;
도 5 내지 도 9는 0일째 (즉, 락토바실러스 플란타룸 TCI378을 함유하는 캡슐을 복용하기 전) 및 14일째 (즉, 락토바실러스 플란타룸 TCI378을 함유하는 캡슐을 14일 연속 복용한 후)의 피험자의 지표를 비교함으로써 지방을 감소시키는 락토바실러스 플란타룸 TCI378의 효과를 예시한다. 이때,
도 5는 전신 지방 백분율 (whole-body fat percentage) (*는 결과가 0일째의 결과와 유의한 차이가 있음을 나타냄, p <0.05),
도 6은 몸통 지방 백분율 (trunk fat percentage)(*는 결과가 0일째의 결과와 유의한 차이가 있음을 나타냄, p <0.05),
도 7은 체중을 나타내며 (**는 결과가 0일째의 결과와 유의한 차이가 있음을 보여 주며, p <0.01),
도 8은 허리 둘레 (*는 결과가 0일째의 결과와 유의한 차이가 있음을 보여 주며, p <0.05) 및
도 9는 BMI 값 (**은 결과가 0일째의 결과와 유의한 차이가 있음을 나타내며, p <0.01);
도 10은 0일째 및 14일째의 피검자의 배변 빈도를 나타낸 것이고, 위장관 기능 개선에 대한 락토바실러스 플란타룸 TCI378의 효과를 나타낸다.
다음 단락은 본 발명의 일부 실시예를 상세히 설명할 것이다. 그러나, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서, 본 발명은 다양한 실시예들로 구체화될 수 있으며, 명세서에 설명된 실시예들에 한정되지 않아야 한다. 본 명세서에서 다르게 표시되지 않는 한, 본 발명의 명세서 (특히 청구항에서)에 인용된 표현은 단수 형태 및 복수 형태 모두를 포함하는 것으로 의도된다; 본 명세서에 인용 된 용어 "개체(subject)"은 포유류 (예 : 인간) 또는 비 포유류 (예를 들어, 닭 또는 조류)를 포함하는 동물을 지칭한다.
본 발명자들은 김치에서 신규한 균주를 분리하고, 16S rRNA 유전자 서열 분석에 의해 균주를 분석하고, 계통 발생학적 관계에 기초하여 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)으로 동정하여 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 균주로 명명 하였다. 락토바실러스 플란타룸 TCI378은 수탁 번호 DSM 32451로 독일 미생물 및 세포배양센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)에 기탁되었다. 락토바실러스 플란타룸 TCI378은 서열 번호 1의 16S rRNA 단편을 갖는다.
본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및 그 대사 산물이 지방 형성을 감소시키고, 지방 대사를 강화시키며, 위장 기능을 개선 시키는데 효과적이라는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378, 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및/또는 이의 대사 산물을 포함하는 조성물, 및 조성물의 제조에서 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및/또는 이의 대사 산물의 용도를 제공하며, 이 때, 상기 조성물은 적어도 지방 형성 감소, 지방 대사 증진, 체지방 형성 차단 위장 기능 개선 중 적어도 하나를 위해 사용된다.
본 발명에 따라 채택된 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378의 대사 산물은 성장에 적합한 환경 하에서 락토바실러스 플란타룸 TCI378을 배양함으로써 생성 될 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 플란타룸 TCI378의 대사 산물 함유액은 적절한 배지에서 락토바실러스 플란타룸 TCI378을 배양한 다음 선택적으로 박테리아를 포함한 고형물을 배지에서 제거하여 얻을 수 있다.
원하는 대사 산물을 제공하기 위해, 락토바실러스 플란타룸 TCI378의 성장 및 대사를 위해 목적하는 영양소 (예 : 효모 추출물, 단백질 및 포도당) 및 조건 (예 : pH 값)을 제공 할 수 있는 한, 임의의 적합한 배지를 선택하여 락토바실러스 플란타룸 TCI378 배양을 수행하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 락토바실러스 플란타룸TCI378의 배양 기간은, 락토바실러스 플란타룸 TCI378이 적어도 1회 이상의 대사 사이클을 완결시키는데 충분한 시간이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체 예에서, 락토바실러스 플란타룸 TCI378은 MRS 브로스에서 18 시간 동안 배양되어 균주가 대사되고 대사물을 생성하게 한다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및 그 대사 산물을 함유하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) TCI378의 대사 과정을 거친 배지를 직접 사용할 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 TCI378과 같은 고형물이 제거된, 락토바실러스 플란타룸TCI378의 대사 산물 함유액을 사용할 수 있다. 배양 후 생성된 대사 산물의 원하는 효과에 악영향을 미치지 않는 한, 임의의 적합한 절차를 사용하여 고체를 제거할 수 있다. 일반적으로, 원심 분리, 필터 여과, 침전 및 경사 분리(decantation)와 같은 물리적 접근법을 사용하여 고체를 제거할 수 있다. 선택적으로, 위의 절차를 반복하거나 조합하여 가능한 한 많이 배지에서 고형물 (세균 포함)을 제거할 수 있다.
원하는 목적에 따라, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 특별한 제한 없이 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 경구 투여에 의해 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 형태 및 목적에 따라, 적합한 담체가 선택되어 약학 조성물을 제공하는데 사용될 수 있고, 이 때, 부형제, 희석제, 보조제, 안정화제, 흡수 억제제, 붕해제(disintegrating agents), 가용화제(hydrotropic agents), 유화제, 항산화제, 접착제, 결합제, 점착 부여제(tackifiers), 분산제, 현탁제, 윤활제, 흡습제 등을 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 투약 형태로서, 본 발명에 따라 제공되는 약학적 조성물은 활성 성분 (즉, 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및 그의 대사 산물)의 원하는 효과에 악영향을 미치지 않을 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 포함 할 수 있다. 적합한 담체의 예는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 또는 그의 유사체, 셀룰로즈, 전분, 슈가 벤토나이트 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 약학적 조성물은 정제 (예: 드라제), 환제, 캡슐, 과립제, 펄비스(pulvis), 유동추출제(fluidextract), 용액, 시럽, 현탁액 또는 팅크(tincture) 등과 같은 경구 투여용 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다.
대상의 필요, 연령, 체중 및 건강 상태에 따라, 본 발명에 따라 제공되는 약학적 조성물은 하루에 한 번, 하루에 여러 번, 또는 며칠마다 한 번과 같이 다양한 빈도로 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 제공되는 약학적 조성물 중 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및/또는 이의 대사 산물의 양의 비율은 실제 적용 요건에 따라 조정될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 다른 활성 성분을 추가로 포함할 수 있거나, 약학적 조성물의 효과를 추가로 강화시키기 위해 하나 이상의 다른 활성 성분을 포함하는 의약과 조합하여 사용될 수 있으며, 다른 활성 성분이 본 발명의 활성 성분 (즉, 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및 그의 대사 산물)의 원하는 효과에 악영향을 미치지 않는 한, 제공된 제조의 적용 유연성 및 적용 적응성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 식품 조성물은 건강 식품, 식이 보조제, 기능성 식품, 영양 보충제 또는 특수 영양 식품일 수 있으며, 유제품, 고기 제품, 빵, 파스타, 쿠키, 트로키 (troche), 캡슐, 과일 주스, 차, 스포츠 음료, 영양 음료 등으로 제조 될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
대상의 필요, 나이, 체중 및 건강 상태에 따라, 본 발명에 따라 제공되는 건강 식품, 식이 보조제, 기능성 식품, 영양 보충제 및 특수 영양 식품은 다양한 빈도, 예를 들면 1회 한번, 하루에 여러 번 또는 며칠에 한 번 등으로 섭취될 수 있다. 본 발명에 따라 제공된 건강 식품, 식이 보조제, 기능성 식품, 영양 보충제 및 특수 영양 식품 중 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및/또는 그의 대사 산물의 양은 특정 개체군에 따라 바람직하게는 매일 섭취해야 하는 양으로 조절될 수 있다.
특정 인구 집단 (예: 고지혈증으로 고생하는 환자, 임산부 등)에 대한 권장 일일 투여량, 사용 기준 및 사용 조건 또는 다른 식품 제품 또는 의약품과 함께 사용하기 위한 권장 사항을, 본 발명에 따라 제공되는 건강 식품, 식이 보조제, 기능성 식품, 영양 보충제 및/또는 특수 영양 식품의 외장 패키지에 표시 할 수 있다. 따라서, 사용자는 의사, 약사 또는 관련 임원의 지시 없이 건강 식품, 식이 보조제, 기능성 식품, 영양 보충제 및/또는 특수 영양 식품을 위험없이 안전하게 복용 할 수 있다. 본 발명에 따라 제공되는 식품 조성물에서, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및 / 또는 그 대사 산물의 유형은 상기 설명과 일치한다.
선택적으로, 본 발명에 따라 제공되는 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물은 적절한 양의 첨가제를 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들어, 식품 조성물, 약학적 조성물 또는 사료 조성물의 기호성 및 시각적 인지를 향상시키기 위한 향료, 토너 또는 착색제와 같은 적절한 양의 첨가제, 및/또는 완충제, 보존제, 방부제, 항균제, 또는 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물의 안정성 및 저장성을 개선시키기 위한 항곰팡이제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 유효량의 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 지방 형성을 감소시키고, 지방 대사를 강화시키고, 체지방 형성을 막고, 및/또는 위장 기능을 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 조성물은 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및/또는 그 대사 산물을 포함한다. 락토바실러스 플란타룸 TCI378 및/또는 그 대사 산물의 유형도 위의 설명과 일치한다.
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 표시될 것이다.
실시예
[ 제조예 ]
A. Lactobacillus plantarum TCI378의 선별 및 동정
(A-1) 선별
김치의 균질액(homogenate)(김치 및 소를 포함함)을, 김치 : MRS 브로스 = 1 : 100의 부피비로 MRS 브로스와 혼합한 후, 37℃에서 18시간 동안 혐기성 배양 (즉, 산소 농도가 5% 미만)을 수행하였다. 그 후, 상기 배양된 혼합물을 MSR 아가에 스프레딩하고 상기 아가를 37℃에서 혐기 배양하여 아가에 상이한 콜로니를 형성시켰다. 그 다음, 균주의 특이성을 확인하기 위해 멸균 접종 루프를 이용하여 콜로니를 채취하고 MSR 아가에 사분면 스트리킹 법(quadrant streaking method)을 적용한 후, 상기 MSR 아가를 37℃의 혐기성 배양기에서 싱글 콜로니가 나타날 때까지 배양하였다.
(A-2) 동정
(A-1)에서 선별된 균주를 계통학적 분석하여 서열 번호 1로 표시되는 서열을 갖는 16S rRNA 단편을 갖는 균주임을 확인하였다. 서열 번호 1을 온라인 데이터베이스 NCBI(National Center for Biotechnology Information)와 비교하여, 상기 서열 번호 1은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 균주의 16S rRNA 단편에 대해 약 99%의 동일성을 갖는 것을 확인하였다. 따라서 계통 발생 확인에 따라 (A-1)에서 선택된 균주는 계통 발생학적 관계에 따라 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 균주로 동정하였으며 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378으로 명명하였다.
(A-3) 보관
(A-1)에서 수득한 고유한 균주를 MRS 브로스로 액체 배양하여 박테리아 배양액을 수득하였다. 그 후 글리세롤 : 세균 배양액 = 1 : 3의 부피비로 글리세롤을 t세균배양액에 첨가하여 혼합물을 얻은 후, 수집 튜브에 넣고 -80℃ 온도에서 보관하였다.
B. Lactobacillus plantarum TCI378 활성화 및 샘플 준비
(B-1) 활성화( Activation )
Lactobacillus plantarum TCI378을 함유하는 수집 튜브를 해동한 후, TCI378 균주를 접종 농도 1% (약 1 Х 104 CFU/mL)의 MRS 브로스에 접종하고, 다음 실험에서 사용할 TCI378 배양액을 제공하기 위해 37℃에서 18시간 동안 혐기 조건하에 배양하였다.
(B-2) 샘플 준비
(B-1)에서 얻은 TCI378 배양액을 접종 농도 1 % (약 1 Х 104 CFU/mL)의 MRS 브로스 접종하고 37℃에서 18시간 동안 혐기 조건 하에서 배양하였다. 상기 배양 후, 브로스를 5000 rpm의 속도로 5분간 원심 분리하여 박테리아 (즉, TCI378 균주)를 제거 하였다. 그리고 나서, 원심 분리된 배지의 상청액을 0.2㎛ 필터로 여과하여 박테리아를 추가로 더 제거하였다. 상기 여액을 여과하여 수집하고, TCI378 샘플 (락토바실러스 플란타룸 TCI378의 대사 산물 함유)을 수득 하였다.
C. 지방세포 배양
(C-1) 배지
(1) 전-지방세포 팽창 배지(Pre-adipocyte expansion medium) :
- 90% DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(Gibco로부터 구입);
- 10% 소 혈청 (Gibco로부터 구입); 및
- 1% 페니실린 - 스트렙토마이신 (Gibco로부터 구입).
(2) 분화 배지 :
- 90% DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(Gibco로부터 구입);
- 10% 태아 소 혈청 (FBS, Gibco로부터 구입);
- 1% 페니실린 - 스트렙토마이신 (Gibco로부터 구입);
- 1.0 ㎛ole/mL 덱사메타손 (Sigma로부터 구입);
- 0.5 mmole/mL 메틸이소부틸크산틴 (Sigma로부터 구입); 및
- 1.0 ㎍/mL 인슐린 (Sigma에서 구입).
(3) 지방세포 유지 배지(Adipocyte maintenance medium) :
- 90% DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(Gibco로부터 구입);
- 10% 태아 소 혈청 (Gibco로부터 구입);
- 1% 페니실린 - 스트렙토마이신 (Gibco로부터 구입); 및
- 1.0 ㎍/mL 인슐린 (Sigma에서 구입).
(C-2) 지방세포의 분화
24 웰 플레이트에서 각 웰에 (C-1)의 전-지방세포 팽창 배지를 주입한 후, 마우스 3T3-L1 섬유 아세포 (Food Industry Research and Development Institute로부터 구입함, BCRC 60071)를 24-웰 플레이트에 8x10 4 cells/well의 씨딩 농도로 씨딩하고 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후, 배지를 (C-1)의 분화 배지로 대체하고, 37℃에서 4일간 배양을 계속하였다. 이어서, 상기 배지를 (C-1)의 지방 세포 유지 배지로 대체하고, 37℃에서 8일 동안 배양을 계속하여 다음 실험에 사용하기 위한 지방 세포를 제공하였다.
실시예1 : Lactobacillus plantarum TCI378 및 그 대사 산물이 지방 감소에 미치는 영향
(1-1) 세포 처리
[제조예 C-2]에서 얻은 지방 세포를 3 군으로 나누어 37℃에서 48시간 동안 다음의 배지에서 각각 배양하였다 :
그룹 배지 조건
대조군 지방세포 유지 배지
블랭크군 지방세포 유지 배지 + 1% MRS 브로스
TCI378군 지방세포 유지 배지 + 1% TCI378 샘플
(1-2) 지질(오일 레드 O) 염색
(1-1)의 배양으로부터 수득한 각 군의 세포를 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 2회 세척 한 후, 10% 메탄올 1 mL를 각 군에 가하여 혼합물을 수득하고, 세포를 고정시키기 위해 실온에서 30분 동안 두었다. 이어서, 메탄올을 제거하고 상기 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 50% 이소프로판올 1 mL를 각 그룹에 1분 동안 첨가한 후 제거하였다. 마지막으로 오일 레드 O 용액을 각 그룹에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 세포의 유적(oil droplet)을 염색하였다. 상기 오일 레드 O 용액을 제거하고, 상기 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, 지방 세포의 유적을 현미경으로 관찰하여 사진을 찍었다. 결과는 도 1에 도시하였다 (화살표로 표시된 어두운 영역은 유적임).
상기에서 관찰된 유적의 관찰 및 기록이 종료된 후, 각 군의 세포를 100% 이소프로판올로 10분간 처리하여 축적된 유적을 용해시켰다. 그 후, 각 군의 세포를 510nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 군의 세포에서 지질 함량을 측정하였다. 마지막으로, 대조군의 결과를 기초로 하여 블랭크군 및 TCI378군 세포의 지질의 상대 함량을 각각 계산하였다 (즉, 대조군의 지질 함량을 1배로 설정). 결과는 도 2에 나타내었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 대조군과 비교하여, TCI378 군의 유적은 더 작았고, 블랭크군의 유적은 현저하게 변화하지 않았다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 블랭크군과 비교하여 TCI378 군의 세포 내 상대적 지질 함량은 약 15% 감소하였다. 이러한 결과는 Lactobacillus plantarum TCI378과 그 대사 산물이 지방 세포의 지질 함량을 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
(1-3) 유전자 발현 분석
단백질, 페리린핀(Perilipin)은 지방 세포의 유적을 파괴로부터 보호할 수 있는 것으로 알려져 있다. 페릴리핀의 발현 수준을 낮추면 지방 세포의 유적이 보다 쉽게 파괴되고, 이에 의해 지방 대사가 강화될 수 있다. 또한, GLUT4 유전자의 증가된 발현은 글루코스 흡수에 대한 지방 세포의 능력에 영향을 미치고, 따라서 지방산의 생성 및 비만의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 GLUT4 유전자의 발현 수준을 낮추면 지방 형성이 감소할 것이다. Lactobacillus plantarum TCI378 및 그 대사 산물이 지방 대사 강화 및/또는 지방 형성 감소에 효과가 있는지를 확인하기 위해 Lactobacillus plantarum TCI378 및 그 대사 산물이 PLIN1(즉 Perilipin발현 유전자) 및 GLUT4 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 조사하기 위해 다음 분석을 수행하였다.
(1-1)에 의해 제공된 각 군의 세포를 수확하고, RNA 정제 키트 (GeneMark로부터 구입)로 RNA 추출을 수행하였다. 그런 다음 SuperScriptTM Reverse Transcriptase 키트 (Invitrogen에서 구입)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 그 후, 상기 cDNA에 SYBR Green Master Mix (KAPA로부터 구입) 및 ABI StepOne PlusTM System을 사용하여 qPCR(quantitative polymerase chain reaction)을 행하여 각 군의 세포에서 PLIN1 및 GLUT4 유전자의 발현량을 측정하였다. TCI378 군의 PLIN1 및 GLUT4 유전자의 상대적인 발현 수준을 대조군의 결과를 기준으로 하여 (즉, 대조군의 발현 수준을 1 배로 하여) 계산하였다. 결과는 도 3 및 도 4에 도시하였다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 블랭크군과 비교하여, TCI378 군에서 PLIN1 및 GLUT4 유전자의 발현 수준이 유의하게 더 낮았다.
상기 (1-2) 및 (1-3)의 결과는 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및 이의 대사 산물이 지방 형성 감소 및 지방 대사 강화에 효과적이고, 그러므로, 지방세포에서 지질 함량을 감소시켜 체지방 형성을 막는데 사용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2: Lactobacillus plantarum TCI378이 지방 손실 및 위장 기능 향상에 미치는 영향
체지방률이 27% 이상이고 다이어트 식품이나 약물을 복용하지 않은 10명의 자원 봉사자가 모집되었다. 실험을 하기 전에 (즉, Lactobacillus plantarum TCI378을 함유한 캡슐을 복용하기 전에), 각 피험자는 불완전한 배변을 느끼는 빈도를 스스로 평가하도록 하였고( "없음", "종종", " 때때로 ", "항상"으로 구성된 그룹에서 선택된 하나), 그리고 체중, 허리 둘레, BMI값, 전신 지방 백분율 및 몸통 지방 백분율을 측정하였다. 그 다음에, 각 피험자는 하루에 한 번씩 14일 동안 연속적으로 락토바실러스 플란타룸 TCI378 (5x109 CFU/캡슐)을 함유하는 캡슐을 복용했다 (즉, 각 피험자는 캡슐을 14회 복용했다). 그 후 각 피험자는 불완전한 배변 감각의 빈도를 스스로 평가하고 체중, 허리 둘레, BMI 값, 전신 지방 백분율 및 몸통 지방 백분율을 측정하였다. 마지막으로, 10명의 피험자의 전신 지방 백분율, 몸통 지방 백분율, 체중, 허리 둘레 및 BMI 값을 평균하여 도 5 내지 도 9에 각각 나타내었다. 또한, 불완전한 배변을 느끼는 자기 평가 결과에 대해 통계 분석을 실시하여, 불완전한 배변을 느끼는 피험자의 "없음", "자주", "때때로", "항상"의 비율을, 피험자의 총 수를 "1"로 하여 각각 산출하였다. 결과는 도 10에 도시하였다.
도 5 내지 도 9에 도시된 바와 같이, 0일째 (Lactobacillus plantarum TCI378을 함유하는 캡슐을 복용하기 전)와 비교하여, 전신 지방 백분율 및 몸통 지방 백분율 모두가 14일째에(즉, Lactobacillus plantarum TCI378을 함유한 캡슐을 14일 동안 복용한 후) 현저히 감소하였다. 0일째와 비교하여, 체중, 허리 둘레 및 BMI 값 또한 14일째에 감소하였다. 또한, 도 10에 도시된 바와 같이, 피험자가 Lactobacillus plantarum TCI378을 함유한 캡슐을 14일 연속 복용한 후에 불완전한 배변 감각의 빈도가 감소되었다.
상기 결과는 피험자가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) TCI378을 함유한 캅셀을 복용한 후에 이들의 지방 축적 및 위장 기능이 모두 개선되어 체중, BMI값 및 허리 둘레가 감소됨을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따라 제공된 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) TCI378 및 그의 대사 산물은 지방 형성 감소, 지방 대사 강화, 체지방 형성 차단 및 위장 기능 개선 중 적어도 하나에 사용될 수 있다.
생물학적 물질의 기탁
기탁 기관: 독일 미생물 및 세포배양센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)
주소: Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, GERMANY
날짜: 2017/3/13
기탁된 생물학적 물질: Lactobacillus plantarum TCI378
기탁번호(Accession number): DSM32451
SEQUENCE LISTING <110> TCI Co., Ltd. <120> Lactobacillus plantarum TCI 378 and its uses in losing fat and improving gastrointestinal functions <130> <150> US 62/473,785 <151> 2017-03-20 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1076 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <223> 16S rRNA fragment <220> <221> misc_feature <222> (118)..(118) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (184)..(184) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 gctggcggcg tgctatacat gcagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca 60 tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagnag 120 cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac cgcatggtcc 180 gagnttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat 240 ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca 300 cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360 atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa 420 ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac 480 cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540 tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct 600 tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg 660 gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720 gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat 780 accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca 840 gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc 900 aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc 960 gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg 1020 ggacatggat acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttggg 1076

Claims (6)

  1. 독일 미생물 및 세포배양센터 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)에 수탁 번호 DSM 32451로 기탁된 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ) TCI378.
  2. 제 1항의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ) TCI378 및/또는 이의 대사 산물을 포함하는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 지방 형성 감소, 지방 대사 강화, 체지방 형성 차단 및 위장 기능 개선 중 적어도 하나를 위한 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물인 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 경구 투여용 약학적 조성물인 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 식품 조성물이고, 상기 식품 조성물이 건강 식품, 식이 보조제, 기능성 식품, 영양 보충제 또는 특수 영양 식품인 조성물.
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