CN116426431A - 一种纳豆芽孢杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205，该菌株已于2022年9月5日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.25652。所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205耐高温、耐酸和抗胆盐能力强，用于食品保健领域功能全面，不仅维生素K2(MK 7)产量达到80mg/L，而且具备增强免疫、抗血栓、降胆固醇和降血脂等功效。
Description
技术领域
本发明属于食品微生物工程领域，具体涉及一种纳豆芽孢杆菌及其用于制备增强免疫等功能益生菌产品的用途。
背景技术
纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)，属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)纳豆亚种，可从纳豆制品或自然界稻谷中分离得到，是一类革兰氏阳性、好氧的芽孢杆菌。纳豆芽孢杆菌能在5～55℃生长，最适生长温度为37℃，最适pH为7.0。
现有技术公开的纳豆芽孢杆菌耐高温、耐酸和耐胆盐能力并不突出，且功能均比较单一，无法满足现代人们多场景的保健需求。如发明专利CN1177039C和发明专利CN103966116A都公开了一种具有血栓溶解性的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。
另外通过自然分筛的筛选方式很难获得高产维生素K2(MK 7)的纳豆芽孢杆菌，现有专利报道为获得更高产维生素K2的纳豆芽孢杆菌均需通过诱变筛选，限制了将菌株开发成为益生菌产品，及其在食品、药品和保健品领域的产业化应用。如CN104328064B公开了一种自主筛选的、能高产维生素K2的纳豆芽孢杆菌经紫外诱变，维生素K2产量达到60.54mg/L；CN108410775B公开的菌株为通过ARTP诱变获得，CN113755404A公开的菌株则通过亚硝基胍诱变获得。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的第一方面是提供一种耐高温、耐酸和抗胆盐能力强的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205；所述纳豆芽孢杆菌VB205是从传统发酵豆酱中分离的益生菌，已于2022年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏号CGMCC No.25652。
根据本发明实施例，在耐高温方面，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.natto)VB205在温度为80℃条件下处理7小时，存活率接近于100％；在温度为100℃条件下处理3小时，存活率仍大于80％；在温度为120℃条件下处理1小时，存活率依然有23％。
根据本发明实施例，在耐酸方面，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.natto)VB205在pH为4条件下处理2小时，存活率接近于100％；在pH为2-3条件下处理2小时，存活率均大于70％；在pH为1条件下处理2小时，存活率依然有42％。
根据本发明实施例，在抗胆盐方面，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.natto)VB205在胆盐浓度为0.03％-0.3％条件下处理3小时，存活率均达到100％。
本发明的第二方面是提供一种自主筛选的、非诱变的高产维生素K2(MK 7)纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205。
根据本发明实施例，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205发酵液维生素K2(MK 7)的产量达到80mg/L。
本发明的第三方面是提供一种增强免疫功效的纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilis subsp.natto)VB205。
根据本发明实施例，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205具有中性粒细胞减少改善功效、T细胞减少改善功效、巨噬细胞吞噬功能促进功效。
本发明的第四方面是提供一种具备降胆固醇和降血脂功效的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205。
本发明的第五方面是提供一种具备抗血栓功效的纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilis subsp.natto)VB205。
附图说明
图1：1#-40#菌株溶栓酶的酶活力检测
图2：纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205生物学形态特征
图3：VB205菌株发酵液的HPLC检测谱图
图4：VB205菌株的抗血栓功效实验结果
图5：VB205菌株的耐高温试验结果
图6：VB205菌株的耐酸试验结果
图7：VB205菌株的抗胆盐试验结果
图8：VB205菌株降胆固醇功效评价实验结果(尾部血管胆固醇荧光强度)
图9：VB205菌株降血脂功效评价实验结果(尾部血管染色强度)
图10：VB205菌株中性粒细胞减少改善功效评价实验结果(尾静脉中性粒细胞数量)
图11：VB205菌株T细胞减少改善功效评价实验结果(T细胞荧光强度)
图12：VB205菌株巨噬细胞吞噬促进功效评价实验结果(剩余荧光微球数量)
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：菌株的筛选、分离鉴定
从市售食品纳豆挑取少量溶于无菌水，80℃下水浴30min，然后进行稀释涂布，获得一系列单菌落。根据菌落形态分类，每种形态菌株单独进行传代，连续传代三次，获得稳定形态单菌落，编号为1#-40#。
酪蛋白平板法检测溶栓酶的酶活力：配制分别含1％、1.5％、2％酪蛋白的LB配方平皿，阴性对照：LB配方平皿。将所试菌株点种于上述平皿，37℃培养48-72h，观察菌落周围水解圈。根据水解圈大小来判断菌株对酪蛋白的分解能力。
由图1可以看出，4#、22#、26#和38#四株的抗血栓能力最强，而2#、14#、16#和23#四株的抗血栓能力最弱甚至无抗血栓效果。
考察4#、22#、26#和38#四菌株发酵产物维生素K2(MK 7)的产量。
4#、22#、26#和38#四株单菌落接入100mL种液，37±0.5℃下种子摇瓶培养，种子培养基为蔗糖2％，酵母浸粉FM802 1.5％；然后以3-5％接种量接入发酵摇瓶，发酵培养条件为37±0.5℃，220rpm培养96-120h，培养基为甘油10％，酵母浸粉FM802 4％，泡敌0.3％，pH7.0；发酵培养结束后，发酵液中加入2倍体积无水乙醇或95％乙醇，超声30min，离心取上清液，利用高效液相色谱法分析维生素K2的含量。HPLC检测方法如下：色谱柱为ZORBAXEclipse Plus C8(1.8μm，4.6mm×50mm)，流动相为0.05％三氟乙酸甲醇溶液，检测波长：270nm，柱温：60℃，流速：1.0mL/min，进样体积：5μL。
结果如图2所示，经计算4#、22#、26#和38#四菌株维生素K2(MK 7)的产量分别为10mg/L、80mg/L、35mg/L、28mg/L。
将22#菌株命名为VB205，具体形态描述：37℃培养18-24h，单菌落呈不规则圆形，直径3-5mm，凸起，色白，表面褶皱多，菌落中间一圈凸起，中心略凹陷(见图3)。
对VB205菌株进行了16s序列分析及全基因组测定，使用NCBI进行BLAST比对，结果表明该菌株为纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)纳豆亚种，同时全基因组序列表明，该菌株为枯草芽孢杆菌亚种纳豆芽孢杆菌中的新菌株。
表1：VB205菌株生化特征鉴定
实施例2：VB205菌株抗血栓功效评价
将VB205菌株发酵液浓缩液用标准稀释水配制成20.0mg/mL母液，备用。
随机选取年龄为受精后3天(3dpf)黑色素等位基因突变型斑马鱼(Albino)于6孔板中，每孔(实验组)15尾。水溶给予样品VB205 500μg/mL，同时设置模型对照组和正常对照组，每孔容量为3mL。28℃处理3h后，各实验组均水溶给予花生四烯酸(批号C2123090，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)建立斑马鱼血栓模型。28℃继续处理80min，处理结束取2个浓度组、模型对照组和正常对照组用邻联茴香胺(批号MKCC7501，Sigma，USA)进行染色，染色后每个实验组随机选取8尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，用NIS-Elements D3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析心脏红细胞染色强度，以该指标的统计学分析结果评价样品抗血栓功效。
从图4结果可以看出，VB205菌株具备抗血栓效果。
实施例3：VB205菌株的菌粉制备
VB205菌株的菌粉制备包含以下步骤：
1、通过固体活化培养，获得单菌落；
2、将单菌落接种于种瓶培养基：蔗糖2％，酵母浸粉FM802 1.5％，pH 7.0±0.5，(100mL培养基/500mL摇瓶)，进行液体摇瓶种子培养；
3、将摇瓶种子液接种于种罐培养基：蔗糖1％，酵母浸粉FM802 1％，泡敌0.1％，pH7.0±0.5，(50L培养基/100L种罐)，进行液体罐上种子培养；
4、将罐上种子液接种于酵罐培养基：葡萄糖0.8％，酵母浸粉FM802 0.5％，甘蔗糖蜜1％，泡敌0.3％，pH 7.0±0.5，(2000L培养基/4000L酵罐)，进行液体罐上发酵培养；
5、将发酵液固液分离，干燥获得固体菌粉10kg，含量2×1011CFU/g。VB205菌粉耐高温能力测试
以上述固体菌粉作为样本，考察VB205菌株在不同温度条件下的耐受性，具体操作如下：均匀称取上述固体菌粉5g/份，共15份，编号1至15。取编号1至5放置于设定80℃的烘箱、编号6至10放置于设定100℃的烘箱、编号11至15放置于设定120℃的烘箱。记录放置初始时间，放置1小时将1、6、11号样品取出，放置2小时将2、7、12号样品取出，放置3小时将3、8、13号样品取出，放置5小时将4、9、14号样品取出，放置7小时将5、10、15号样品取出，15个样品加放置前对照样品一同稀释涂布检测其存活率。
如图5所示：在温度为80℃条件下处理7小时，存活率接近于100％，对菌株基本无影响，在温度为100℃条件下处理3小时，存活率仍大于80％，在温度为120℃条件下处理1小时，存活率依然有23％，试验表明VB205菌株具有很好的耐高温能力。
VB205菌粉耐酸能力测试
以上述固体菌粉作为样本，考察VB205菌株在不同酸性条件下的耐受性。分别称取1g固体菌粉于pH为1、2、3、4、6.6(对照)的100mL生理盐水中，摇匀，获得约2×109CFU/mL菌液，稀释涂布，计算初始菌量。以上液体37℃，60rpm培养2小时，分别稀释涂布，计算存活率。
如图6所示：在pH为4条件下处理2小时，存活率接近于100％，对菌株基本无影响；在pH为2-3条件下处理2小时，存活率均大于70％，对菌株影响较小；在pH为1条件下处理2小时，存活率依然有42％。
VB205菌粉抗胆盐能力
以上述固体菌粉作为样本，考察VB205菌株在不同胆盐浓度下的耐受性，分别称取1g固体菌粉于胆盐浓度为0.03％、0.1％、0.2％、0.3％、0％(对照)的100mL人工肠液中，摇匀，获得约2×109CFU/mL菌液，稀释涂布，计算初始菌量。以上液体37℃，60rpm培养3小时，分别稀释涂布，计算各条件下存活率。
如图7所示：在胆盐浓度为0.03％-0.3％条件下处理3小时，存活率均达到100％，对菌株基本无影响，试验表明VB205菌株具有很好的抗胆盐能力。
实施例4：降胆固醇和降血脂功效评价
将实施例3制备的VB205菌株的菌粉用DMSO(批号20171016，国药集团化学试剂有限公司)配制成50.0mg/mL母液备用，用于测试VB205菌株的菌粉的体外活性。
随机选取野生型AB品系年龄为受精后5天(5dpf)的斑马鱼于烧杯中，每杯(实验组)30尾。水溶给予样品VB205 250μg/mL，设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为25mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高糖高脂饲料，建立斑马鱼高糖高脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)，第32h注射胆固醇探针cholesterlylBODIPYTM542/563C11(批号2291600，invitrogen，USA)，28℃处理48h，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品降胆固醇功效。
从图8可以看出，VB205菌株降胆固醇效果显著。
随机选取年龄为受精后5天(5dpf)黑色素等位基因突变Albino品系斑马鱼于烧杯中，每杯(实验组)30尾。水溶给予样品VB205 250μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为25mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高糖高脂饲料，建立斑马鱼高糖高脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)，28℃处理48h，给予油红O(Oil Red O，批号SHBN4926，Sigma，USA)进行整体脂肪染色。染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，用Image-Pro Plus软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管染色强度，以该指标的统计学分析结果评价样品降血脂功效。
从图9可以看出，VB205菌株降血脂效果显著。
实施例5：增强免疫功效评价
将实施例3制备的VB205菌株的菌粉用DMSO(批号20171016，国药集团化学试剂有限公司)配制成50.0mg/mL母液备用，用于测试菌粉的体外活性。
中性粒细胞减少改善试验：
随机选取年龄为受精后2天(2dpf)转基因中性粒细胞绿色荧光MPX品系斑马鱼，静脉注射长春瑞滨(批号190401，江苏豪森药业集团有限公司)建立斑马鱼免疫功能损伤模型。注射完后，随机分配至6孔板中，每孔(实验组)30尾斑马鱼。水溶给予样品VB205 250μg/mL，设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃继续处理24h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用Image-J图像处理软件采集数据，分析斑马鱼尾静脉中性粒细胞数量，以该指标的统计学分析结果评价样品中性粒细胞减少改善功效。
从图10结果可以看出，VB205菌株具备中性粒细胞减少改善功效。
T细胞减少改善试验：
随机选取年龄为受精后4天(4dpf)T淋巴细胞荧光斑马鱼，分别静脉注射长春瑞滨(批号190401，江苏豪森药业集团有限公司)建立斑马鱼免疫功能损伤模型。注射完后，随机分配至6孔板中，每孔(实验组)30尾斑马鱼。水溶给予样品VB205 250μg/mL，设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃继续处理24h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件采集数据，分析斑马鱼T细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品T细胞减少改善功效。
从图11结果可以看出，VB205菌株具备T细胞减少改善功效。
巨噬细胞吞噬促进试验：
随机选取年龄为受精后3天(3dpf)野生型AB品系斑马鱼，分别静脉注射长春瑞滨(批号190401，江苏豪森药业集团有限公司)和荧光微球(批号MKCB2036V，SIGMA，USA)建立斑马鱼免疫功能损伤模型，正常对照组仅静脉注射荧光微球。注射完后，随机分配至6孔板中，每孔(实验组)30尾斑马鱼。水溶给予样品VB205 250μg/mL，设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。28℃处理96h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，使用Image-J图像处理软件采集数据，分析斑马鱼体内剩余荧光颗粒的数量，以该指标的统计学分析结果评价样品巨噬细胞吞噬功能促进功效。
从图12结果可以看出，VB205菌株具备巨噬细胞吞噬功能促进功效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和控制，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
VB205菌株16s序列鉴定结果：
agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacct。
Claims (7)
1.一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205，其特征在于，该菌株已于2022年9月5日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCCNO.：25652。
2.一种纳豆芽孢杆菌VB205菌粉，其特征在于，纳豆芽孢杆菌菌粉是由权利要求1所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205发酵制得。
3.一种包含权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205或其发酵液的微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为固态菌剂或液态菌剂。
5.一种权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205或其发酵液制备得到的食品、药品或保健品。
6.一种权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205或其发酵液在制备具备增强骨健康、增强免疫、抗血栓、降胆固醇和降血脂功能的食品、药品或保健品中的应用。
7.一种权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)VB205或其发酵液在生产维生素K2的用途。
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