CN109536564A - 特异性菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及特异性菌株及其应用。本发明发现绿针假单胞菌能够以阿魏酸为底物，经生物转化生成香草酸。本发明筛选得到了保藏编号为CCTCC NO:M 2016767黑曲霉，该菌种其香草酸产量超过10g/L。并且该菌种具有更高的特异性可直接利用草木原料，香草酸浓度可达0.43g/L。

Description

特异性菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及特异性菌株及其应用。

背景技术

4-羟基-3甲氧基苯甲酸(又称香草酸，香子兰酸)是一类重要天然化合物，其是中草药胡黄莲、当归中的主要功效成分，同时也广泛存在于栀子、香子兰等天然植物提取物中。香草酸具备天然抗氧化的生物活性，在医疗、保健、化妆品邻域具广泛的应用前景。在抗氧化功能药物领域，香草酸对减少与防范细胞损伤有较好的功效。例如，在经典癌症化疗药物顺铂化疗方案中，香草酸的组合应用能大幅减少化疗药物顺铂(Cisplatin，CDDP)的肾毒性及其对肾细胞抗氧化防御系统的损伤，从而缓解癌症化疗治疗过程的对身体的强毒副作用(Environmental Toxicology and Pharmacology,39(1),2015,392-404， DOI:10.1016/j.etap.2014.12.008)。另外，其抗氧化的功能也在心血管疾病领域也获得广泛的重视。实验表明经口摄入香草酸可以有效降低血糖、血压、及胰岛素水平，缓解糖尿病所引发的高血压症状(Biomedicine & Pharmaco -therapy 87(2017)640-652，https://doi.org/10.1016/j.biopha.2016.12.134)。此外，香草酸也被证实在抵御与治疗肾上腺素诱发的心肌梗死及心源中毒方面具有显著的疗效(European Journal of Pharmacology 668(2011)233-240，DOI: 10.1016/j.ejphar.2011.06.053)。在神经医学领域，香草酸被发现是一种理想的天然酚酸类疼痛舒缓药物，其可作用于ASICs离子通道及TPRV1，TRPA1， TRPM8受体，缓解与治疗疼痛(Pharmacology,Bi℃hemistry and Behavior 132 (2015)88-95，DOI:10.1016/j.pbb.2015.02.016)。同时香草酸对于改善记忆障碍和小脑运动调节缺陷方面具备良好的功能，是治疗及预防脑灌注不足及脑神经障碍的潜在理想的备选药物(Biomedicine&Pharmacotherapy 96(2017) 667-674，http://dx.doi.org/10.1016/j.biopha.2017.10.052)。

香草酸有一种令人愉悦的奶油香气，被美国香料和香精制造者协会 (FEMA)列入GRAS清单中香料(编号FEMA3988)。天然香草酸主要源于栀子(Gardenia jasminoides)提取物中，其在天然植物中以香草酸4-O-α-D- 葡萄糖苷的形式存在，通过进一步酶解及热解可获得完整功能活性的天然香草酸(Journal of Natural Products,2006,Vol.69,No.4601，DOI: 10.1021/np050447r)。在除了直接在天然食品及香精中的应用外，香草酸可以作为重要香料化合物香草醛和肉桂酸的合成前体。

除了在香料领域的应用外，香草酸在高分子材料领域也是重要的原料化合物之一，其用于高耐热聚酯材料的合成(Russian Journal of Applied Chemistry，2002,75(5),777-780,DOI:10.1023/A:1020362613234)及高性能酚醛树脂材料(US PatentApplication 20180009928)。

香草酸的现有工业生产方式为香草醛为原料通过氧化(氧化银)或碱熔(氢氧化钾)氧化获得(Patent US2419158A)，或从3，4-二甲氧基苯甲酸部分脱去甲基而得。工艺路线中香草醛在水中氧化成香草酸，需要大量水作溶剂。而香草醛在水中溶解度特小，导致生产效率低下，并且产生大量含银强碱废水，污染较大。利用生物转化方式，以更廉价可及的原料生产香草酸被认为是一种更加环境友好的生产方式。同时利用天然原料通过酶催化或者生物发酵方式生产天然化合物产品，符合欧盟(European Directive 88/388/CEE)及美国FDA(CFR-21CFR101.22)对天然香料的法律定义，在食药、有机食品等对天然度存在较高法规要求的领域中生产转化法具备极高的经济价值，成为该领域的热门研究重点。

目前，现有生物转化技术中F.Perestelo公开了一种利用灵杆菌(Serratiamarcescens)静息细胞转化香兰素生产香草酸的方法(Appl Environ Microbiol.1989Jun；55(6):1660-1662.，PMID:2669632)，其在3g/L香兰素底物浓度条件下可转化最高产量3.3g/L香草酸，但上述工艺采用成本较高的香兰素作为底物，且在底物浓度进一步提高后产量及得率均会下降，其最高产量仅有3.3g/L，无法满足实际产业化生产的产量要求。

专利申请EP1734128(B1)和专利申请CN1421523A中公开了一种两步生物转化法生产香兰素的技术方案，其中在技术方案的第一步黑曲霉菌 (Aspergillus niger)CGMCC0774利用阿魏酸为底物转化生产香草酸，后利用朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)CGMCC 1115进一步将香草酸转化为香草醛。其香草酸的产量为1～3g/L，产量较低，无法满足实际量产需要。另外，专利申请CN1824783A则公开了一种直接利用高阿魏酸及阿魏酸酯含率的米糠油皂脚为底物，采用Aspergillus niger CGMCC 0774菌体发酵转化生产香草酸及香草醛的技术方案。

Ghosh公开了一种利用桑南链霉菌Streptomyces sannanensis MTCC 6637 生物转化生产香草酸的方法，其香草酸的最高累计产量为400mg/L(J Ind MicrobiolBiotechnol.2007 34(2):131-8.,DOI:10.1007/s10295-006-0177-1)。

E.Topakas公开报道一种利用嗜热侧孢霉菌(Sporotrichum thermophile) 转化阿魏酸生产香草酸的技术，其在最优化条件下可以达到较高的香草酸产量4.798g/L，摩尔转化率为35％(Food Science and Technology,2003, 36(6):561-565，DOI:10.1016/S0023-6438(03)00060-4)。

P.Barghini公开了一种利荧光假单胞菌BF13(Pseudomonas fluorescens BF13)细胞催化阿魏酸转为香草酸的方法(Appl Microbiol Biotechnol(1998) 49:309-314，DOI:10.1007/s002530051174)，其采用含有阿魏酸或者顺式肉桂酸的培养基诱导培养荧光假单胞菌BF13，后将培养后收集获得的浓缩的细胞在30℃缓冲液中催化阿魏酸转化，其中在6g/L细胞投入量的条件下，阿魏酸底物浓度为2g/L时可以获得最高转化率95％，而当底物浓度提高至6g/L，则转化率下降至低于40％。而如果将阿魏酸(4-8g/L)直接添加至荧光假单胞菌BF13的生长培养基中，则会对菌体的生长与转化产生严重的抑制，当阿魏酸浓度超过10g/L时菌体生长会完全抑制。

Delneri公开了一种利用乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) DSM586和DSM 590细胞悬浮液转化阿魏酸为香草酸的技术方案(Bi℃him.Biophys.Acta.1995Jun 9；1244(2-3):363-7，PMID:7599157)。同时DSM 586 和DSM 590乙酸钙不动杆菌细胞还具备催化肉桂酸为对羟基苯甲酸的转化能力。

专利US 6,844,019利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida NCIMB 40988) 160小时转化28.5g/L阿魏酸生成19.05g/L香草酸。

专利US 5,866,380公开了分别利用一系列菌株进行阿魏酸转化为香草酸的转化。包括Streptomycetes setonii ATCC 25497和Aspergillus niger MIC 373 (CNCM I-1472)，其中Streptomycetes setonii ATCC 25497利用1g/L阿魏酸在 100小时间转化生产0.332g/L香草酸。而Aspergillus niger MIC 373利用5.05 g/L阿魏酸在24h内转化生产3.6g/L香草酸。

专利US9,809,832公开了一种利用地中海拟无枝菌酸菌Amycolatopsismediterranei NCIM 5008利用阿魏酸生物转化生产香草酸的技术，其中阿魏酸的添加量为1-20g/L，优选为5-12g/L，其香草酸的最高产量可达7g/L。该菌株除了转化阿魏酸为相应的香草酸外，也同时转化其他类似的芳香丙烯酸为其对应的芳香酸。例如，该菌株同时也可以转化相应的顺-肉桂酸为对羟基苯甲酸。

在已知现有技术中，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida NCIMB 40988) 具备最高的香草酸产量其产量为19.05g/L最具备产业化前景，但是恶臭假单胞菌株本身是一类人畜共患的条件致病细菌，其培养物具有腥臭味，同时会产生绿脓素，在食品健康及香精香料类产品的生产中会产生巨大的潜在风险及不利气味。地中海拟无枝菌酸菌Amycolatopsismediterranei NCIM 5008，香草酸产量可达7g/L，具备产业化前景，但是该菌株催化特异性较低，除了催化阿魏酸转化香草酸以外，同时可催化其他的苯基丙烯酸衍生物转化为相应苯基甲酸衍生物，但是由于其催化特性专一性较低，在采用草木原料直接作为转化底物时，除了香草酸外同时也会产生其它的苯基甲酸衍生物，衍生物间的分离较为困难。黑曲霉菌是食品发酵工业的常用菌种，普遍用于淀粉酶、过氧化氢酶、果胶酶、氧化酶、脂肪酶、柠檬酸、低聚果糖等30多种食品添加剂的生产，其安全性较高，菌株被列入美国FDA的GRAS安全目录下的多类产品(21CFR173.120)及中国国标(GB2760-2007)食品添加剂用安全菌株，是一种安全理想的工业微生物生产用菌。已知的现有技术已经公开了黑曲霉菌MIC 373和黑曲霉菌CGMCC 0774转化阿魏酸生产香草酸的能力，但现有已知黑曲霉菌株转化生产能力较弱，香兰草酸产量低于5g/L，使得其生产效能较低，产业化成本过高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供特异性菌株及其应用，本发明提供了利用生物发酵/转化方式生产香草酸的菌种及方法，并提供了基因改造菌株，从而产生香草醛的方法。

本发明提供了绿针假单胞菌在生物转化生成香草酸中的应用。

本发明中，所述生物转化的底物为阿魏酸。

一些实施例中，所述绿针假单胞菌为保藏编号为CCTCC NO:2018670和/ 或CCTCCNO:2018671的绿针假单胞菌。

一种香草酸的制备方法，其以阿魏酸为底物，以绿针假单胞菌进行生物转化，获得香草酸。

所述生物转化的基质采用LB液体培养基、营养肉汤培养基或其他含有碳氮源的培养基。一些是实施例中，基质采用LB液体培养基。其中，阿魏酸的浓度为5～20g/L，具体实施例中，阿魏酸的浓度为10g/L。生物转化的条件为 30℃，300rpm振荡培养18h，然后补加阿魏酸至10g/L，再30℃，300rpm振荡培养48h。

其中Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株需要48h香草酸产量达4.8 g/L，而Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株仅需24h香草酸产量既可以达到峰值。

一种低表达或不表达香草酸脱氢酶基因(Vdh基因)的绿针假单胞菌。

低表达或不表达Vdh基因绿针假单胞菌的构建方法，包括敲除绿针假单胞菌的香草酸脱氢酶基因或使绿针假单胞菌的香草酸脱氢酶基因失活。

本发明中，采用同源臂重组方式在香草酸脱氢酶基因(Vdh基因)中插入一段外源基因片段将绿针假单胞菌内源Vdh基因的失活。具体实施例中，使保藏编号为CCTCC NO:2018670或CCTCC NO:2018671的绿针假单胞菌的 Vdh基因失活。

本发明还提供了低表达或不表达Vdh基因的绿针假单胞菌在生物转化生成香草醛中的应用。

本发明还提供了一种香草醛的制备方法，其以阿魏酸为底物，以低表达或不表达Vdh基因的绿针假单胞菌进行生物转化，获得含有香草醛的培养液。

一些实施例中，所述培养液中还含有香草酸。

因此，本发明提供了一种香草酸和/或香草醛的制备方法，其以阿魏酸为底物，以低表达或不表达Vdh基因的绿针假单胞菌进行生物转化，获得含有香草醛和/或香草酸的培养液。

所述生物转化的基质采用LB液体培养基、营养肉汤培养基或其他含有碳氮源的培养基。一些实施例中，基质采用LB液体培养基。其中，阿魏酸的浓度为5～20g/L，具体实施例中，阿魏酸的浓度为10g/L。生物转化的条件为30℃，300rpm振荡培养18h，然后补加阿魏酸至10g/L，再30℃，300rpm振荡培养48h。

实验表明，在Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株在Vdh基因失活后，香草酸的产量下降至0.82g/L(10g/L阿魏酸初始底物)，同时产物中出现较多的香草醛积累。

本发明发现绿针假单胞菌能够以阿魏酸为底物，经生物转化生成香草酸。而敲除Vdh基因的绿针假单胞菌香草酸的含量下降而产生香草醛。在 Pseudomonas chlororaphisCFFSH007和Pseudomonas chlororaphis CFFSH008 的液体培养基中添加溶解的阿魏酸溶液，其可被菌体直接转换为香草酸，其香草酸生产强度超过4g/(L·day)，终产量可以超过10g/L。

本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉。

保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉菌株在生物转化生成香草酸中的应用。

本发明提供了一种香草酸的制备方法，其特征在于，以阿魏酸为底物，以保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉进行生物转化，获得香草酸。

所述生物转化体系的pH值为7.0，阿魏酸的初始浓度为20g/L～50g/L。

所述生物转化的步骤包括：(1)将保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉斜面孢子或者孢子冻存管接入液体培养基(酵母浸出粉5.0g/L，麦芽提取物10g/L葡萄糖20.0g/L，pH7.0)，在30℃，200rpm摇瓶培养24～48h，待液体培养基中生长形成大量成型的菌丝球；(2)以NaOH水溶液(1.8％w/v) 溶解阿魏酸，配制100g/L的阿魏酸水溶液；(3)将阿魏酸水溶液加入菌丝球液培养液中，使得菌丝球培养液中的阿魏酸终浓度达到5～50g/L；(4)在30℃摇床中进一步震荡培养24～72h。

或者，所述生物转化的步骤包括：(1)将保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉斜面孢子或者孢子冻存管接入液体培养基(酵母浸出粉5.0 g/L，麦芽提取物10g/L葡萄糖20.0g/L，1g/L阿魏酸，pH7.0)，在30℃， 200rpm摇瓶培养24-48h，待液体培养基中生长形成大量成型的菌丝球；(2) 将获得的菌丝球4000rpm离心1min收集至新的摇瓶中，加入PBS缓冲液(pH 7.0±1.0)重悬；(3)以NaOH水溶液(1.8％w/v)溶解阿魏酸，配制100g/L的阿魏酸水溶液(pH调整为7.0±1.0)；(4)将阿魏酸加入菌丝球重悬液中至终浓度5-50g/L，同时加入部分碳源(如葡萄糖，终浓度10g/L)，将催化反应摇瓶置于30℃摇床震荡反应24～72h。

本发明还提供了一种香草酸的制备方法，其以草木原料为底物，以保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉进行生物转化，获得香草酸。

本发明中，所述草木原料是指含有酚酸类化合物的植物原料。特别是包含阿魏酸酸酯及其他肉桂酸类酯(咖啡酸酯、肉桂酸酯、对羟基肉桂酸酯等) 的植物原料，包括米糠、麦麸和/或谷壳类。本发明中，所述草木原料为麦麸或麦麸堆料。

所述生物转化的条件为：将含有20g/L麦麸的生理盐水作为培养基，接种保藏编号为CCTCC NO:M 2016767的黑曲霉孢子悬液，30℃震荡培养7天。

或者，所述生物转化的条件为：以麦麸堆料为底物，每100g补加10mL 20g/L的葡萄糖溶液作为补充碳源，接种保藏编号为CCTCC NO:M 2016767 的黑曲霉孢子悬液，30℃、湿度85％固体发酵7天。发酵产物以乙酸乙酯超声萃取。

本发明筛选得到的黑曲霉保藏编号为CCTCC NO:M 2016767，该菌种可以在阿魏酸浓度10～20g/L浓度的培养基中生长，同时在阿魏酸浓度超过50 g/L时，菌球细胞仍然可以保持阿魏酸转化为香草酸的转化能力，其香草酸产量超过10g/L。并且该菌种具有更高的特异性，在众多肉桂酸衍生分子与类似分子中仅能将阿魏酸转化为香草酸，但无法将肉桂酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸等肉桂酸衍生分子转化为相应的苯甲酸衍生物。且可直接利用草木原料，香草酸浓度可达0.43g/L。

生物保藏说明

黑曲霉CFFSH005(Aspergillus nige CFFSH005)，于2016年12月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO:M 2016767。

绿针假单胞菌CFFSH007(Pseudomonas chlororaphis CFFSH007)，于2018 年10月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M 2018670。

绿针假单胞菌CFFSH008(Pseudomonas chlororaphis CFFSH008)，于2018 年10月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M 2018671。

附图说明

图1示绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis CFFSH007与绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis CFFSH008的发酵液(图1-a)与菌落(图1-b) 产色素情况对比图，图中左管为Pseudomonas chlororaphis CFFSH007的发酵液其中带有明显的橙色色素，而右管为突变型Pseudomonas chlororaphis CFFSH008的发酵液，其不产生橙色色素；

图2示阿魏酸到4-羟基-3甲氧基苯甲酸的菌体内代谢途径，阿魏酸经由香草醛在香草醛脱氢酶(Vdh)的作用下进一步转化为香草酸；

图3示肉桂酸类化合物转化为苯甲酸类化合物，其中R1基团可以为氢、羟基、烷基、甲氧烷基，R2基团可以为氢、羟基、烷基、甲氧烷基；

图4示麦麸作为唯一原料利用黑曲霉CFFSH005转化产生阿魏酸及香草酸情况；

图5示Pseudomonas chlororaphis CFFSH007生产香草酸发酵过程；

图6示Pseudomonas chlororaphis CFFSH008生产香草酸发酵过程；

图7示发酵48h后Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株发酵液稀释液HPLC检测图谱；

图8示发酵48h后的Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株发酵稀释液HPLC检测图谱；

图9示Vdh基因插入KAN抗性基因失活；

图10示Vdh基因失活后发酵产物中香草酸和香草醛含量。

具体实施方式

本发明提供了特异性菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的特异性菌株是能够利用生物发酵/转化方式生产天然香草酸的微生物。

其中，黑曲霉菌是一种长期广泛应用发酵菌株，具有很好的安全性，在食品、医药、发酵工业中具有很高的商业价值。

本发明提供一种黑曲霉菌株的亚型CFFSH005(Aspergillus niger CCTCCM2016767)，该菌株能够利用阿魏酸为底物，高效生物发酵/转化生产香草酸。黑曲霉菌株CFFSH005分离自上海市浦东新区南汇西瓜根系泥土。

西瓜类植物根系部分会分泌出的对羟基苯甲酸、阿魏酸等化感物质，所分离到菌株具有极强的阿魏酸耐受能力，黑曲霉菌株CFFSH005可以阿魏酸浓度10～20g/L浓度的培养基中生长，同时在阿魏酸浓度超过50g/L时，菌球细胞仍然可以保持阿魏酸转化为香草酸的转化能力，其香草酸产量超过10 g/L，具备产业化价值。该菌株无特殊营养要求，可在通用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽汁培养基、营养肉汤培养基或其他含有碳氮源的培养基中生长。

在本发明技术中，菌株Aspergillus niger CFFSH005对阿魏酸的耐受能力较强，高浓度的阿魏酸并不会影响菌株的生长，因此既可以通过在已生长菌株的培养基中添加阿魏酸溶液生物发酵获得香草酸，也可以通过在利用在不含有阿魏酸培养基中培养获得的菌体或者菌丝球，在缓冲液中催化阿魏酸，通过生物转化获得香草酸。其中采用生物发酵法的步骤包括：(1)将Aspergillus niger CFFSH005斜面孢子或者孢子冻存管接入液体培养基(酵母浸出粉5.0 g/L，麦芽提取物10g/L葡萄糖20.0g/L，pH7.0)，在30℃，200rpm摇瓶培养24-48h，待液体培养基中生长形成大量成型的菌丝球；(2)以NaOH水溶液(1.8％w/v)溶解阿魏酸，配制100g/L的阿魏酸水溶液；(3)将阿魏酸水溶液加入菌丝球液培养液中，使得菌丝球培养液中的阿魏酸终浓度达到5-50 g/L；(4)在30℃摇床中进一步震荡培养24～72h，采用HPLC取样监测培养基中阿魏酸及香草酸的浓度。采用生物转化法的具体步骤包括：(1)将Aspergillus niger CFFSH005斜面孢子或者孢子冻存管接入液体培养基(酵母浸出粉5.0g/L，麦芽提取物10g/L葡萄糖20.0g/L，1g/L阿魏酸，pH7.0)，在30℃，200rpm摇瓶培养24-48h，待液体培养基中生长形成大量成型的菌丝球；(2)将获得的菌丝球4000rpm离心1min收集至新的摇瓶中，加入PBS 缓冲液(pH 7.0±1.0)重悬；(3)以NaOH水溶液(1.8％w/v)溶解阿魏酸，配制100g/L的阿魏酸水溶液(pH调整为7.0±1.0)；(4)将阿魏酸加入菌丝球重悬液中至终浓度5-50g/L，同时加入部分碳源(如葡萄糖，终浓度10g/L)，将催化反应摇瓶置于30℃摇床震荡反应24～72h，过程中以HPLC检测香草酸及阿魏酸的浓度累计及消耗情况。

植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、木质素所组成的立体网络结构，其之间同规格羟基肉桂酸类酯键相连接，所以在植物细胞壁中存在大量的酚酸化合物。包括阿魏酸酸酯及其他肉桂酸类酯(咖啡酸酯、肉桂酸酯、对羟基肉桂酸酯等)，利用阿魏酸酯酶降解可获得系列肉桂酸类酚酸化合物。目前天然阿魏酸主要来源于对米糠、麦麸、谷壳类原料的提取，提取过程通常采取碱解、热解、酶解方式水解阿魏酸酯从而释放阿魏酸。黑曲霉Aspergillus niger CFFSH005被发现本身具备较高的产阿魏酸酯酶活性及其他纤维素酶活性，具备降解木质纤维素原料能力，因此这使得Aspergillus niger CFFSH005可以直接利用低成本且富含有阿魏酸酯的米糠、麦麸、谷壳类等草木原料及其水解、热解或机械破碎产物，利用其自身的产阿魏酸酯酶活力及降解木质纤维素类材料活性，水解阿魏酸酯系列衍生物，获得阿魏酸并进一步转化为香草酸。与Amycolatopsis mediterranei NCIM 5008菌株(专利US9,809,832)不同的是， Aspergillus niger CFFSH005具有更高的特异性，在众多肉桂酸衍生分子与类似分子中仅能将阿魏酸转化为香草酸，但无法将肉桂酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸等肉桂酸衍生分子转化为相应的苯甲酸衍生物。这使得产物中除香草酸，较少存在其它结构类似的苯甲酸类衍生物干扰，其分离纯化工艺更加简单。在本发明中直接利用米糠、麦麸、谷壳类等草木原料的直接制备香草酸的工艺包括：(1)原料预处理：采用蒸汽爆破、酸碱解、酶解、水解或机械破碎等提高草木原料可及度的预处理工序，提高原料的可及性；(2)脱毒处理，对采用酸碱解预处理方式的的原料需要中和其中的酸碱；(3)对于本身可及度已较高的草木类原料(例如，米糠油脚)，可以不进行原料预处理及脱毒； (4)将Aspergillus niger CFFSH005的孢子悬液及补充碳源、氮源及草木类原料混合后，在30℃下静态或动态培养，以HPLC检测过程中阿魏酸及香草酸的浓度累积。

本发明还提供了以绿针假单胞菌，特别是绿针假单胞菌株Pseudomonaschlororaphis subsp CFFSH007及Pseudomonas chlororaphis subsp CFFSH008，利用阿魏酸为底物高效生物发酵/转化生产香草酸的技术方案。绿针假单胞菌为一类生存于自然环境中的微生物，属于美国国家卫生研究院(NIH)归类的低害的生物安全等级1级微生物，其安全性较高，并且迄今为止未曾发现该类菌株可引发人类感染案例(Infection,Geneticsand Evolution 28(2014) 276–277)。相比于现有技术人员已知的恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌菌，绿针假单胞菌是一种更加安全及风险可控的生产菌株。

Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株为一种绿针假单胞菌橙色亚种，其可以产生橙色素，Pseudomonas chlororaphis CFFSH008为一种绿针假单胞菌突变亚种，其在生长及生产过程中几乎不产生橙色色素。两种绿针假单胞菌菌株菌分离自植物根系。Pseudomonas chlororaphis CFFSH007和 Pseudomonas chlororaphis CFFSH008无特殊营养要求，可在通用LB培养基、营养肉汤培养基或其他含有碳氮源的培养基中生长。在Pseudomonas chlororaphis CFFSH007和Pseudomonas chlororaphis CFFSH008的液体培养基中添加溶解的阿魏酸溶液，其可被菌体直接转换为香草酸，其香草酸生产强度超过4g/(L·day)，终产量可以超过10g/L。其生产香草酸的流程包括：其中采用生物发酵法的步骤包括：(1)将Aspergillus niger CFFSH005斜面孢子或者孢子冻存管接入液体培养基(酵母浸出粉5.0g/L，蛋白胨5g/L,葡萄糖 10.0g/L，pH7.0)，在30℃，200rpm摇瓶培养12-24h，待液体培养基中生长形成大量成型的菌丝球；(2)以NaOH水溶液(1.8％w/v)溶解阿魏酸，配制100g/L的阿魏酸水溶液；(3)将阿魏酸水溶液加入菌丝球液培养液中，使得菌丝球培养液中的阿魏酸终浓度达到5-50g/L；(4)在30℃摇床中进一步震荡培养24-72h，采用HPLC取样监测培养基中阿魏酸及香草酸的浓度。

黑曲霉菌与绿针假单胞菌其阿魏酸的转化过程主要将阿魏酸转化为香草醛，然后在香草醛脱氢酶(Vdh)的作用下进一步转化为香草酸。采用插入失活或基因敲除策略，使得Vdh的功能是失活后，可以阻止香草醛进一步氧化为香草酸，使得阿魏酸的代谢过程停留在香草醛，从而达到积累另一类重要的化合物产品香草醛的目的。以Aspergillus nigerCFFSH005及Pseudomonas chlororaphis CFFSH007及Pseudomonas chlororaphisCFFSH008为出发菌株，利用同源重组方式失活或敲除出发菌株的内源香草醛脱氢酶基因，从而获得具备积累香草醛能力的菌株。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1黑曲霉菌CFFSH005菌株鉴定

黑曲霉菌株CFFSH005分离自上海市浦东新区南汇西瓜根系泥土。

黑曲霉菌CFFSH007在马铃薯培养基上，菌丝生长初期无色，成熟时为深褐色至近黑色。取菌丝体染色后于显微镜镜下观察，菌丝有分隔，有黑色的球状孢子囊。根据K.B.Raper和D.I.Fennell《曲霉属》(The Genus Aspergillus， 1965)，该菌株具有典型的黑曲霉特征。黑曲霉菌CFFSH005已于2016年12 月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016767

实施例2绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis CFFSH007与绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株鉴定

两株绿针假单胞菌分离自植物根系，鉴定采用16s rDNA鉴定，通用引物委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，27F/1492R序列如下：

27F(5’→3’)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

1492R(5’→3’)：TACGGYTACCTTGTTACGACTT

取绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌落，以通用引物 27F和1492R对其16s rDNA进行菌落PCR，获得全长为1413bp DNA序列，该序列见基因序列附表序列1。利用NCBI的对序列1进行比对，结果表明Pseudomonas chlororaphisCFFSH007与Pseudomonas chlororaphis ATCC 13985该段16s rDNA相似度为100％(1413/1413)；同时与Pseudomonas chlororaphis Lzh-T5的该段16s rDNA相似度为100％(1413/1413)，与 Pseudomonas chlororaphis KY5406的16S rRNA基因相似度为99％ (1412/1413)。

取绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌落，以通用引物 27F和1492R对其16s rDNA进行菌落PCR，获得全长1413bp的DNA序列，该DNA序列详见基因序列附表序列2。利用NCBI的对序列2进行检索比对，结果表明Pseudomonaschlororaphis CFFSH008与Pseudomonas chlororaphis ATCC 13985的相似度达99％(1411/1413)，与Pseudomonas chlororaphis Lzh-T5的相似度达99％(1411/1413),与Pseudomonas chlororaphis KY5406相似度达99％(1410/1413)。同时对比Pseudomonaschlororaphis CFFSH007与Pseudomonas chlororaphis CFFSH008的16s rDNA的基因相似度为99％(1411/1413)。

实施例3产香草酸的菌株的筛选

(1)菌株的分离

取新鲜50g上海市南汇地区西瓜地根系土壤样本，以100mL无菌生理盐水分散震荡混匀，取100uL做梯度稀释，涂布于已制备好的筛分琼脂平板上，置于30℃培养箱内培养，待形成单菌落。所述的筛分琼脂平板培养基配方为： 2％(w/v)琼脂粉，5％(w/v)葡萄糖，0.5％(w/v)阿魏酸，1％酵母粉，0.3％胰蛋白胨，pH 7.0。将所形成的单菌落转接保存，并进行菌株鉴别。

(2)野生黑曲霉的香草酸转化能力鉴定

选择从土壤样本中获得10株黑曲霉菌株，取在马铃薯葡萄糖固体培养基平皿内培养7天的成熟孢子，分别接种于90mL培养马铃薯葡萄糖液体培养基(马铃薯提取物4.0g/L，葡萄糖20.0g/L)中，并于30℃置于250mL摇瓶中震荡培养36h，震荡转速300rpm，待形成稳定的菌丝球后。加入10mL 100g/L阿魏酸溶液，继续培养48h，后取发酵液，采用HPLC检测其中阿魏酸、香草酸及香草醛浓度，其检测结果如表1所列。实验结果表明10株自筛菌株大部分野生型黑曲霉菌具备转化阿魏酸为香草酸能力，但普遍转化能力及产量较低。其中编号为EB012D11黑曲霉菌株，转化能力突出，香草酸产量达到5.64g/L，远高于其它黑曲霉菌株，具有较高经济价值，因此将编号为 EB012D11d的菌株命名为黑曲霉菌株CFFSH005。

表1 10株自筛野生黑曲霉菌株及阿魏酸转化能力结果

N.D.表明未检测到该组分

实施例4黑曲霉菌CFFSH005(CFFSH005)发酵生产香草酸

将黑曲霉菌CFFSH005接种于取在马铃薯葡萄糖固体培养基斜面内于 30℃培养7天至孢子成熟，以2mL生理盐水反复冲洗制备孢子悬液。将2mL 孢子悬液全部转移至菌球培养液(酵母浸出粉5.0g/L，麦芽提取物10.0g/L葡萄糖20.0g/L，pH条件根据培养方案调整)，于30℃，300rpm条件下震荡培养24h，使得形成大量菌丝球，根据培养方案加入100g/L阿魏酸溶液使得培养基中初始阿魏酸浓度达到X g/L浓度。所述的培养方案如下：

培养方案1：培养基pH为7.0，初始阿魏酸浓度X为10g/L；

培养条件2：培养pH为5.5，初始阿魏酸浓度X为10g/L；

培养条件3：培养pH为7.0，初始阿魏酸浓度X为40g/L；

培养条件4：培养pH为7.0，初始阿魏酸浓度X为50g/L；

上述四种培养条件下其香草酸产量浓度如表2所示

表2CFFSH005产香草酸过程

实施例5黑曲霉菌CFFSH005菌丝球催化的生物物转化法生产香草酸

将黑曲霉菌CFFSH005接种于取在马铃薯葡萄糖固体培养基斜面内于 30℃培养7天至孢子成熟，以2mL生理盐水反复冲洗制备孢子悬液。将2mL 孢子悬液全部转移至菌球培养液(酵母浸出粉1.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L葡萄糖5.0g/L，pH 7.0)，于30℃，300rpm条件下震荡培养24h，形成大量菌丝球。加入取少量100g/L阿魏酸溶液作为诱导液，使得培养液中阿魏酸终浓度达到1g/L。进一步震荡培养24小时，使得阿魏酸转化代谢相关酶充分表达。

随后，将诱导后的菌丝球湿菌体收集，作为生物转化的催化剂。最后按照所制定的催化方案，进行催化反应，包括按照催化方案中菌体的投料比A (w/v，g每100mL缓冲液)将菌丝球加入缓冲液B中，同时加入适量阿魏酸溶液使得反应体系中的阿魏酸终浓度达到C(g/L)，同时加入部分葡萄糖使得葡萄糖的终浓度为D(g/L)，催化反应在温度T℃下，300rpm转速下震荡反应24-72h，同时以HPLC监测反应过程中香草酸的浓度。所述的催化方案如下：

催化方案1：菌体的投料比A为50(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为生理盐水(pH7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为10g/L，所述的葡萄糖终浓度为0g/L，所述的催化温度T为30℃；

催化方案2：菌体的投料比A为50(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为生理盐水(pH7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为10g/L，所述的葡萄糖终浓度为10g/L，所述的催化温度T为30℃；

催化方案3：菌体的投料比A为50(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为柠檬酸缓冲液(pH 5.5,离子强度1.0M)，所述的阿魏酸终浓度C为10g/L，所述的葡萄糖终浓度为10g/L，所述的催化温度T为30℃；

催化方案4：菌体的投料比A为50(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为PBS缓冲液(pH7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为20g/L，所述的葡萄糖终浓度为10g/L，所述的催化温度T为30℃；

催化方案5：菌体的投料比A为100(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为PBS缓冲液(pH 7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为20g/L，所述的葡萄糖终浓度为10g/L，所述的催化温度T为30℃；

催化方案6：菌体的投料比A为100(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为PBS缓冲液(pH 7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为20g/L，所述的葡萄糖终浓度为10g/L，所述的催化温度T为37℃；

催化方案7：菌体的投料比A为100(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为PBS缓冲液(pH 7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为20g/L，所述的葡萄糖终浓度为20g/L，所述的催化温度T为30℃；

催化方案8：菌体的投料比A为150(w/v，g/100mL)，所述的缓冲液B 为PBS缓冲液(pH 7.0)，所述的阿魏酸终浓度C为20g/L，所述的葡萄糖终浓度为10g/L，所述的催化温度T为30℃；

上述8种催化方案下，黑曲霉菌CFFSH005菌丝球催化生产香草酸产量浓度如表3所示

表3CFFSH005菌丝球催化产香草酸浓度(g/L)

实施例6黑曲霉菌CFFSH005对肉桂酸类化合物的生物转化作用

肉桂酸类酚酸化物的结构见本发明附图3所示，其中的R1基团可以是氢、羟基、烷基、甲氧烷基中的一种，R2基团可以为氢、羟基、烷基、甲氧烷基团中的任意一种。

按照实施例4中培养条件1，进行发酵转化肉桂酸化合物实验，其中实施例4中培养条件1中的终浓度10g/L阿魏酸替换为10g/L的其他肉桂酸类化合物作为反应底物。反应底物类型及其所生成的相应苯甲酸类化合物见表4 所示，反应过程见附图3。以HPLC检测各类底物及产物的浓度，结果见表4。

结果表明，黑曲霉菌CFFSH005具有极强的特异性，仅能将阿魏酸转化为相应的香草酸，而不能将其他类似的肉桂酸类化合物转化为相应的苯甲酸类化合物。除了可完全降解咖啡酸外，黑曲霉菌CFFSH005不能转化其他类型的类似的肉桂酸类化合物。这使得黑曲霉菌CFFSH005以草木原料为直接原料时可以将其中的阿魏酸专一转化为相应的香草酸，而不会产生或少量其它苯甲酸类化合物，减少了后续的分离难度。

表4以肉桂酸类化合物为底物生物转化相应

实施例7黑曲霉菌CFFSH005以草木类原料生产香草酸

将黑曲霉菌CFFSH005接种于取在马铃薯葡萄糖固体培养基斜面内于 30℃培养7天至孢子成熟，以生理盐水反复冲洗制备孢子悬液。按照所设定的不同的发酵条件，将所制备的孢子悬液接入含有草木类原料的培养基中，进行发酵测试。

所述的发酵条件如下：

发酵条件1：以麦麸作为唯一原料，将麦麸20g/L添加入生理盐水溶液作为培养基，测试菌株对阿魏酸释放能力。将制备好的孢子悬液加入培养基中， 30℃条件下震荡培养7天，利用HPLC检测阿魏酸释放及香草酸的转化情况。其发酵液HPLC检测图谱如附图4所示，黑曲霉菌CFFSH005具备降解及利用麦麸及释放其中阿魏酸的能力，同时可以将阿魏酸转化为香草酸。

发酵条件2：以100g麦麸堆料为底物，补加10mL 20g/L葡萄糖作为补充碳源，将孢子悬液接入麦麸堆料中，30℃在湿度85％的霉菌培养箱中固体发酵7天，取10个发酵后的堆料，加入10mL乙酸乙酯中超声萃取。之后利用HPLC检测萃取液中阿魏酸与香草酸的含量，结果表明阿魏酸浓度为0.82 g/L，香草酸浓度为0.43g/L。

实施例8Pseudomonas chlororaphis CFFSH007与Pseudomonas chlororaphisCFFSH008菌株的生物发酵产香草酸

本实例分别以Pseudomonas chlororaphis CFFSH007与Pseudomonaschlororaphis CFFSH008菌株为转化菌株，以10g/L阿魏酸为底物转化生产香草酸。其生产条件为，将相应的菌株接种于LB液体培养基中30℃，300rpm 条件下震荡生长18h，之后加入部分体积的100g/L阿魏酸溶液使得培养基中的阿魏酸终浓度达到10g/L。在30℃摇床中震荡培养48h，以HPLC监测期间香草酸及阿魏酸的浓度变化。以Pseudomonas chlororaphisCFFSH007为转化菌株的发酵过程见附图5所示，以Pseudomonas chlororaphis CFFSH008为转化菌株的发酵过程见附图6所示。结果表明两株菌株均具备快速的香草酸转化能力，其中Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株需要48h香草酸产量达4.8g/L，而Pseudomonaschlororaphis CFFSH008菌株仅需24h香草酸产量既可以达到峰值。发酵48h后Pseudomonaschlororaphis CFFSH007菌株发酵液稀释液HPLC检测图谱如图7所示，其中仅剩余了保留时间约为0.94min 的香草酸，而底物中的阿魏酸已经几乎完全消耗。发酵48h后的Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株发酵稀释液HPLC检测图谱如图8所示，底物中几乎仅剩香草酸。

实施例9Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株中的Vdh基因的失活

本实施采取同源臂重组方式在香草酸脱氢酶基因(Vdh)中插入一段外源基因片段将Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株中的内源Vdh基因的失活。

(1)Vdh上游同源臂克隆

设计同源引物VDHA-Ft(含有BamHI酶切位点，以下划线标注)和 VDHA-Rt(含有XbaI酶切位点，以下划线标注)，其序列分别为：

VDHA-Ft(5’→3’)：CGCGGATCCAGATACCCGATTCGAG

VDHA-Rt(5’→3’)：TGCTCTAGACTTGGTTCGCTGGTGG

以Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株基因组为模板，用VDHA-Ft 和VDHA-Rt引物PCR克隆Vdh上游同源臂基因片段VdhA，将扩增的VdhA 片段末端加T后，插入PTG19-T载体(购买自上海捷瑞生物工程有限公司，插入按说明书所述方法)获得PTG19-VdhA后测序，VdhA基因序列详见基因序列表序列3.

(2)抗性基因片段的克隆

经过抗生素敏感性测试，Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株对卡那霉素敏感，因此以卡那霉素抗性基因Kan为插入失活标记。设计含有分别含有Xba I和Sal I限制性内切酶位点上下游引物Kan-F和Kan-R，所设计引物序列如下：

Kan-F：ACGCGTCGACTCCCGCTCAGAAGA

Kan-R：TGCTCTAGACTTGCAGTGGGCTTAC

以商业化广宿主穿梭质粒PBBR1MCS-2为模板，克隆其中的卡那霉素抗性基因Kan，将该基因片段加尾连接至PTG19-T载体，对得PTG19-Kan测序。抗性基因Kan序列详见基因序列表序列4。

(3)Vdh下游同源臂克隆

设计同源引物VDHB-Ft(含有SalI酶切位点，以下划线标注)和 VDHB-Rt(含有HindIII酶切位点，以下划线标注)，其序列分别为：

VDHB-Ft(5’→3’)：ACGCGTCGACTGCTGATGACGTTGAC

VDHB-Rt(5’→3’)：CCCAAGCTTAGCGCGGAGTTCATCG

以Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株基因组为模板，用VDHA-Ft 和VDHA-Rt引物PCR克隆Vdh下游同源臂基因片段VdhB，将扩增的VdhB 片段末端加T后，插入PTG19-T载体(购买自上海捷瑞生物工程有限公司，插入按说明书所述方法)，对所获得的得PTG19-VdhB后测序，VdhB基因序列详见基因序列表序列5.

(4)Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株Vdh基因的插入失活

参照论文《gacS基因插入失活对绿针假单胞菌G-05的两种胞外次生代谢物合成的影响》中所述的方法对Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株Vdh 基因进行插入失活(DOI：10.13343/j.cnki.wsxb.2008.12.003)。其中上游同源臂片段有PTG19-VdhA质粒，由BamHI和有Xba I双酶切后胶回收获得。Kan 抗性片段由Xba I和Sal I限制性内切酶双酶切获得，下游同源臂片段由 PTG19-VdhB由HindIII和Sal I双酶切获得，双交换重组片段连接方式如附图9所示。按照论文所述方法，将上述片段构建连接于pEX18Tc自杀质粒，以E.coliSM10λpir菌株为供体菌进行结合转移(方法如论文所述)，以卡那霉素与四环素抗性平板筛选，其中在卡那霉素抗性平板上不生长，在四环霉素中生长的Pseudomonas chlororaphisCFFSH007菌落即为Vdh基因敲除菌株。

(5)Vdh基因失活后对Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株的影响

按照实施例8所述的发酵转化条件，检测Vdh后阿魏酸酸转化香草酸的能力，以HPLC检测结果表明。Vdh基因失活的Pseudomonas chlororaphis CFFSH007菌株(ΔVdh-CFFSH007)48h香草酸产量下降80％(10g/L初始阿魏酸，产量为1.02g/L)，同时产物中出现香草醛的累积。

实施例10Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株中Vdh基因的失活

引物及实验方法按照实施例9实施，其中所获得的Pseudomonas chlororaphisCFFSH008菌株中Vdh基因的上游同源片段VdhC序列见基因序列6所示，CFFSH008菌株中Vdh基因的下游同源片段VdhD序列如基因序列 7所列。

结果显示，在Pseudomonas chlororaphis CFFSH008菌株在Vdh基因失活后，香草酸的产量下降至0.82g/L(10g/L阿魏酸初始底物)，同时产物中出现较多的香草醛积累。底物中的阿魏酸被消耗殆尽(发酵产物以甲醇5倍稀释， HPLC检测结果如图10所示,其产物中已经检测到香草醛的吸收峰，同时仍然残留少量的香草酸)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 波顿(上海)生物技术有限公司

<120> 特异性菌株及其应用

<130> MP1826092

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌 CFFSH008(Pseudomonas chlororaphis CFFSH008)

<400> 1

cacatgcaag tcgagcggta gagagaagct tgcttctctt gagagcggcg gacgggtgag 60

taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg gataacgttc ggaaacggac gctaataccg 120

catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag 180

gtcggattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg 240

agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 360

tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg aggaagggta cttacctaat acgtgagtat 420

tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc taactctgtg ccagcagccg cggtaataca 480

gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag 540

ttggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatc caaaactggc gagctagagt 600

atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac 660

accagtggcg aaggcgacca cctggactga tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga 720

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgttggg 780

agccttgagc tcttagtggc gcagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc 840

gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900

aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat ccaatgaact ttccagagat 960

ggattggtgc cttcgggaac attgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020

tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg tccttagtta ccagcacgtc 1080

atggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt 1200

tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg 1260

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agctagtcta accttcggga ggacggttac cac 1413

<210> 2

<211> 1413

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌 CFFSH008(Pseudomonas chlororaphis CFFSH008)

<400> 2

cacatgcaag tcgagcggta gagagaagct tgcttctctt gagagcggcg gacgggtgag 60

taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg gataacgttc ggaaacggac gctaataccg 120

catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag 180

gtcggattag ctagttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg 240

agaggatgat cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 360

tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg aggaagggta cttacctaat atgtgtgtat 420

tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc taactctgtg ccagcagccg cggtaataca 480

gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag 540

ttggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatc caaaactggc gagctagagt 600

atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac 660

accagtggcg aaggcgacca cctggactga tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga 720

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgttggg 780

agccttgagc tcttagtggc gcagctaacg cattaagttg accgcctggg gagtacggcc 840

gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900

aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat ccaatgaact ttccagagat 960

ggattggtgc cttcgggaac attgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020

tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg tccttagtta ccagcacgtc 1080

atggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140

agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt 1200

tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg 1260

caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcga atcagaatgt cgcggtgaat 1320

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caccagaagt 1380

agctagtcta accttcggga ggacggttac cac 1413

<210> 3

<211> 340

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌 CFFSH007(Pseudomonas chlororaphis CFFSH007)

<400> 3

cgcggatcca gatacccgat tcgagccgtt gcgccagggc cagggcgcgc ccggtgtcgc 60

ggctgaagat cgccgccgac aggccgaact cggaatcgtt ggccagccgc agcagtgctt 120

cgtcgcccgc gccgcgcagc accaccgcca ccggcccgaa ggactcttcg cggtacaggc 180

gcatggcgtc ggtgacgccg tcgagcaagg tcggctgcag aatgctgccg gccaattggc 240

caccggcgac cagggtcgcg ccctgctcca gggcatcgtc gatcagcccc tggatgcgcg 300

tgccggcact ggcgtccacc agcgaaccaa gtctagagca 340

<210> 4

<211> 1027

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggtcgact cccgctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga tgcgctgcga 60

atcgggagcg gnnncgannt accgtwaagc acgaggaagc ggtcagccnc attcgccgcc 120

aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatngtc ytgatagcgg tccgccacac 180

ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc 240

aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc 300

ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg 360

acaagaccgg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 420

gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 480

tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 540

tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 600

cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga 660

caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 720

atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 780

ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc ctcatcctgt 840

ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca 900

gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc ccagctggca atttccgggt 960

tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agctatcgcc atgtaagccc actgcaagtc 1020

tagactt 1027

<210> 5

<211> 402

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌 CFFSH007(Pseudomonas chlororaphis CFFSH007)

<400> 5

ggaaagctta gcgcggagtt catcgccgcg gccggcgaga ccggggccat ggccaactgg 60

tacggcttca acgtgcaact ggcggcgaat atcctgcgcg aagccgcgtc catgaccacc 120

cagatcaatg gcgaggtcat cccctccgac gtgcccggca gcttcgccat ggccctgcgc 180

cagccgtgcg gcgtggtgct gggcatcgcg ccgtggaacg ccccggtgat cctcgccact 240

cgcgccatcg ccatgccgct ggcctgcggc aacaccgtgg tgctcaaggc gtccgagctg 300

agcccggcgg tgcatcggct gatcggccag gtgttgcagg aggccggcct cggtgacggg 360

gtggtcaacg tcatcagcag tcgactcccg ctcagaagaa ct 402

<210> 6

<211> 343

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌 CFFSH008(Pseudomonas chlororaphis CFFSH008)

<400> 6

attcgcggat ccagataccc gattcgagcc gttgcgccag ggccagggcg cgcccggtgt 60

cgcggctgaa gatcgccgcc gacaggccga actcggaatc gttggccagc cgcagcagtg 120

cttcgtcgcc cgcgccgcgc agcaccaccg ccaccggccc gaaggactct tcgcggtaca 180

ggcgcatggc gtcggtgacg ccgtcgagca aggtcggctg cagaatgctg ccggccaatt 240

ggccaccggc gaccagggtc gcgccctgct ccagggcatc gtcgatcagc ccctggatgc 300

gcgtgccggc actggcgtcc accagcgaac caagtctaga gca 343

<210> 7

<211> 398

<212> DNA

<213> 绿针假单胞菌 CFFSH008(Pseudomonas chlororaphis CFFSH008)

<400> 7

gaaagcttag cgcggagttc atcgccgcgg ccggcgagac cggggccatg gccaactggt 60

acggcttcaa cgtgcaactg gcggcgaata tcctgcgcga agccgcgtcc atgaccaccc 120

agatcaatgg cgaggtcatc ccctccgacg tgcccggcag cttcgccatg gccctgcgcc 180

agccgtgcgg cgtggtgctg ggcatcgcgc cgtggaacgc cccggtgatc ctcgccactc 240

gcgccatcgc catgccgctg gcctgcggca acaccgtggt gctcaaggcg tccgagctga 300

gcccggcggt gcatcggctg atcggccagg tgttgcagga ggccggcctc ggtgacgggg 360

tggtcaacgt catcagcagt cgactcccgc tcagaaga 398

Claims (11)

1.绿针假单胞菌和/或保藏编号为CCTCC NO:M2016767的黑曲霉菌株在生物转化生成香草酸中的应用。

2.保藏编号为CCTCC NO:M2016767的黑曲霉。

3.保藏编号为CCTCC NO:M2018670或CCTCC NO：M2018671的绿针假单胞菌。

4.一种香草酸的制备方法，其特征在于，以阿魏酸为底物，以绿针假单胞菌和/或保藏编号为CCTCC NO:M2016767的黑曲霉进行生物转化，获得香草酸。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以保藏编号为CCTCC NO:M2016767的黑曲霉为菌种，阿魏酸的初始浓度为20g/L～50g/L。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以绿针假单胞菌为菌种，所述生物转化体系中，阿魏酸的初始浓度为10g/L，转化条件为30℃，300rpm振荡培养。

7.一种香草酸的制备方法，其特征在于，以草木原料为底物，以保藏编号为CCTCC NO:M2016767的黑曲霉进行生物转化，获得香草酸。

8.低表达或不表达香草酸脱氢酶基因的黑曲霉或绿针假单胞菌。

9.权利要求8所述黑曲霉或绿针假单胞菌的构建方法，包括敲除所述黑曲霉或绿针假单胞菌香草酸脱氢酶基因或使所述黑曲霉或绿针假单胞菌的香草酸脱氢酶基因失活。

10.根据权利要求9所述的黑曲霉或绿针假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述绿针假单胞菌保藏编号为CCTCC NO:M2018670或CCTCC NO：M2018671的绿针假单胞菌。

11.一种香草醛的制备方法，其特征在于，以阿魏酸为底物，以权利要求8所述的黑曲霉或绿针假单胞菌进行生物转化，获得含有香草醛的培养液。