CN116179389A - 一株植物乳植杆菌及其在亚麻木酚素生物转化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株植物乳植杆菌及其在亚麻木酚素生物转化中的应用，属于食品微生物技术领域。该菌名称为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5，保藏编号为GDMCC No：61973。该植物乳植杆菌FCC5来源于传统发酵豆制品、体外实验显示胃肠液中存活率高，安全无溶血性，在食品中应用前景良好；还具有使亚麻木酚素SDG脱糖苷、脱甲基、脱羟基的转化功能，获得SDG代谢混合物，从而提高SDG的生物利用度。该FCC5的全细胞催化转化SDG的转化效率高，反应体系简单，全细胞转化产物是木酚素和活益生菌混合物具有活益生菌和木酚素双重功效，且组成安全简单可直接添加到食品中。

Description

一株植物乳植杆菌及其在亚麻木酚素生物转化中的应用
技术领域
本发明属于食品微生物技术领域，涉及一株植物乳植杆菌，特别涉及一株植物乳植杆菌及其在亚麻木酚素生物转化中的应用。
背景技术
亚麻籽是一种重要的油料种籽，世界范围内年产量约为200万吨，含油量可达40～50％，亚麻籽榨取油脂后的饼粕含有亚麻籽大部分的营养成分，一般被用作动物饲料，未进行很好地开发利用，造成极大的浪费。
木酚素是存在于亚麻籽种皮中的一种生理活性物质。结构与人体雌激素十分相似，被认为是一种植物雌激素。植物中含量最多的木酚素是开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)和罗汉松脂酚(matairesinol，MAT)。研究表明，许多谷物中都含有木酚素，但亚麻籽中含量最高。木酚素在亚麻籽中的含量约为1％～4％(W/W)，比在其它食物的含量高出75～800倍。
亚麻木酚素因在预防结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和更年期综合症等疾病中发挥作用而越来越受到关注。然而亚麻木酚素不能直接被人体吸收，需经人体内肠道菌群脱糖苷、脱甲基、脱羟基等多步转化为多个中间代谢产物最终转化成哺乳动物木酚素肠二醇(enterodiol，END)和肠内脂(enterolactone，ENL)才能被人体吸收进入血液发挥生理功能，其转化结果图见图1(文献来源：Mol.Nutr.Food Res.2016,60,1590–1601)。因而其生物利用度受人体肠道菌群健康状态和差异的影响。
采用微生物或者酶法体外转化SDG是提高SDG生物利用度的一种有效方式。现有报道转化SDG的微生物多来自人体粪便，大多不能直接应用于食品，有的需要严格的厌氧培养条件，多数报道单个菌株只能实现脱糖苷、脱甲基或者脱羟基中的一步转化如从SDG到SMG，SECO。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株植物乳植杆菌。该菌株是一株从自然发酵豆腐中筛选的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5应用于SDG生物转化、该菌株发酵SDG可实现脱糖苷、脱甲基、脱羟基等多步转化。
本发明的另一目的在于提供上述植物乳植杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株植物乳植杆菌，菌株命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)FCC5，是从自然发酵豆腐生胚中筛选得到。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：61973，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年10月8日。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5，具有以下特征：菌落圆形，在MRS平板上为乳白色，边缘整齐，不透明，细胞显微形态为短杆状，为革兰氏阳性菌，无芽孢。经16SrDNA基因测序结合生理生化实验结果鉴定为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)FCC5。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5，具有以下益生特性：在模拟胃液中处理3h存活率75.9％，之后于模拟肠液中处理4h存活率66.7％，处理8h后活菌数仍高于106CFU/mL。有良好的耐胆盐能力。对二甲苯、乙酸乙酯、正己烷三种溶剂的疏水性在50～70％之间，自聚集能力60％左右。无溶血性，对青霉素、新霉素、卡那霉素、头孢拉定等抗生素敏感，可作为潜在益生菌菌株应用于食品中。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5，以SDG为底物全细胞催化SDG转化，24h～48h内SDG转化率为50～70％，获得益生菌和转化产物混合物。
优选的，催化SDG转化所用的底物为亚麻木酚素提取物等。
具体的，植物乳植杆菌FCC5采用纤维二糖MRS肉汤培养基，35～37℃诱导培养18～24h，取菌液离心，菌体用生理盐水洗涤，加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)重新悬浮制成菌悬液；菌悬液加入0.5～50mmol/L(优选为10mmol/L)SDG，35～37℃培养24～48h，催化转化SDG，获得益生菌和转化产物混合物。
一种生物制剂，基于上述植物乳植杆菌制备得到。
所述的生物制剂，包含以下步骤：将该植物乳植杆菌接种至含纤维二糖的MRS肉汤培养基，35～37℃诱导培养18～24h，取菌液离心，菌体用生理盐水洗涤，加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)重新悬浮制成菌悬液；即可获得生物制剂。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5，可实现SDG脱糖苷、脱甲基、脱羟基等多步转化获得SECO，Demethyl-SECO(去甲基-SECO)、Demethyl-dehydroxy-SECO(脱甲基脱羟基-SECO)等11种代谢中间产物(见表5)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的植物乳植杆菌FCC5来源于传统发酵豆制品、体外实验显示胃肠液中存活率高，安全无溶血性，在食品中应用前景良好。
(2)本发明的植物乳植杆菌FCC5具有使亚麻木酚素SDG脱糖苷、脱甲基、脱羟基的转化功能，获得SDG代谢混合物，从而提高SDG的生物利用度。
(3)本发明的全细胞催化转化SDG方法具有以下特点：
a)转化效率高，24h～48h内SDG转化率为50～70％。
b)反应体系简单，仅含有SDG、植物乳植杆菌悬浮液和缓冲液，转化产物组成安全简单可直接添加到食品中。
c)本发明的全细胞转化产物是木酚素和活益生菌混合物具有活益生菌和木酚素双重功效。
d)本发明获得的全细胞转化产物，细胞与转化产物采用离心等简单方式分离、容易除去菌体获得不含细胞的SDG转化混合物。
附图说明
图1是肠道菌群将亚麻木酚素转化为步入动物木酚素ED和EL等；其中，N.d.表示未检测到的推定中间体；-Glc、-Met和-OH表示葡萄糖、甲基和OH残基的去除；-2H2表示氧化反应；？表明可能的脱水反应。1：SDG，2：SMG，3：SECO，4：Demethyl-SECO，5：Demethyl-dehydroxy-SECO，6：Didemethyl-dehydroxy-SECO，7：Hyroxy-ED，8：Demethyl-MATA，9：Demethyl-dehydroxy-MATA，10：dihydroxy-EL，11：hydroxy-EL，12：Demethyl AHS，13：Didemethyl AHS，15：Didemethyl-dehydroxy AHS 16：ED，17：EL。
图2是FCC5的菌落形态。
图3是FCC5的显微镜观察。
图4是植物乳植杆菌FCC5的系统发育进化树；其中，C5表示菌株FCC5。
图5是植物乳植杆菌FCC5在血琼脂平板划线情况。
图6是植物乳植杆菌FCC5全细胞催化转化SDG液相色谱图。
图7是植物乳植杆菌FCC5发酵SDG过程中SDG、SMG、SECO变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本发明所采用的检测方法如下：
1.高效液相色谱法(HPLC)检测亚麻木酚素
色谱柱：Titank C18 5u有机硅胶杂化色谱柱(250*4.6mm)；流动相：A相为含0.5％冰乙酸的超纯水，D相为色谱级乙腈；检测波长：280nm；洗脱梯度为：0min D相比例为5％，20min内B相比例线性增加至20％，20-50min，D相比例增加至80％，并以80％平衡至60min；流速：0.5mL/min；柱温：28℃；进样量：10μL。
2.液相色谱-质谱联用法检测亚麻木酚素
数据采集系统主要包括超高效液相色谱(Ultra Performance LiquidChromatography,UPLC)和串联质谱(Applied Biosystem 4500 QTRAP)。
液相色谱条件：
色谱柱：Agilent SB-C18 1.8μm，2.1mm*100mm；流动相：A相为含0.1％甲酸的超纯水，B相为含0.1％甲酸的乙腈；洗脱梯度为：0min B相比例为5％，9min内B相比例线性增加至95％，并维持在95％1min，10-11min，B相比例降为5％，并以5％平衡至14min；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：4μL。
质谱条件：
LIT和三重四极杆(QQQ)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪(Q TRAP)，AB4500Q TRAP UPLC/MS/MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口。可由Analyst1.6.3软件(AB Sciex)控制运行正负两种离子模式。ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷雾电压(IS)5500V(正离子模式)/-4500V(负离子模式)；离子源气体I(GSI)，气体Ⅱ(GSⅡ)和帘气(CUR)分别设置为50、60和25.0psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10和100μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的DP和CE优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。
实施例1植物乳植杆菌FCC5的分离和鉴定
取自然发酵豆腐生胚捣碎按10％(w/v)比例加入MRS肉汤培养基37℃增菌培养24h。取上述发酵液，按10％(v/v)比例接种到含2％(w/v)亚麻籽粕的无糖MRS肉汤培养基，37℃培养24h。上述发酵培养液先后采用含2％(w/v)碳酸钙的MRS平板、含2％(w/v)纤维二糖的MRS平板分离筛选，反复划线分离、镜检获得单菌落。
将单菌落菌株接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养18h制成菌悬液，按照细菌基因组提取试剂盒操作SK8255说明提取菌株的基因组DNA。以提取得到的基因组DNA作为PCR扩增的模板扩增16S rDNA片段，并由上海生工生物工程股份有限公司完成测序。所得16SrDNA序列在Gene Bank数据库中进行Blast比对，本菌株FCC5与Lactobacillus plantarumstrain HBUAS52251有超过99.9％的同源性。采用邻接法构建系统发育树(图4)，FCC5菌株与L.plantarum subsp.argentoratensis srain Ni804(AB598943)聚为一支。结合形态学特征及生理生化实验结果，鉴定菌株FCC5为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5。
其中，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5进行菌落形态观察(图2)，显微镜观察(图3)，具有以下主要形态特征：菌落圆形，在MRS平板上为乳白色，边缘整齐，不透明，菌体形态为短杆状，为革兰氏阳性菌，无芽孢。
乳酸菌生理生化鉴定试剂盒对菌株进行生理生化鉴定；通过应用HBI乳酸菌生化鉴定试剂盒分析菌FCC5的糖类利用情况，结果见表1。
表1菌株碳水化合物反应结果
Figure BDA0003380594410000051
注：阴性反应为无色或浅黄色。
通过对照《伯杰细菌鉴定手册》，对菌株进行生理生化特征的测定，结合16SrDNA测序结果，菌FCC5为植物乳植杆菌。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：61973，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2021年10月8日。
所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FCC5的16S rDNA序列，如SEQ ID NO：1所示(1482bp)。
实施例2植物乳植杆菌FCC5益生特性研究
1)在模拟胃肠液中的耐受能力
将0.5mL FCC5菌悬液加至4.5mL模拟胃液中，混合均匀，于37℃条件下孵育3h，分别计数0h及3h时混合液中乳酸菌数量，以菌株存活率评估植物乳植杆菌FCC5对模拟胃液的耐受能力。菌株存活率计算公式如下：
存活率(％)＝lg(3h活菌数)/lg(0h活菌数)×100％
将0.5mL FCC5菌悬液加至4.5mL模拟肠液中，混合均匀，于37℃下孵育4h和8h，分别计数0h及4h、8h时混合液中乳酸菌数量，以菌株存活率评估植物乳植杆菌FCC5对模拟肠液的耐受能力。菌株存活率计算公式如下：
存活率(％)＝lg(4h或8h活菌数)/lg(0h活菌数)×100％
植物乳植杆菌FCC5耐受模拟胃肠液能力见表2及表3。
表2乳酸菌在模拟胃液中活菌数试验结果(×109CFU/mL)
菌株 0h 3h 存活率
植物乳植杆菌FCC5 1.45±0.35 1.10±0.11 75.9％
表3乳酸菌在模拟肠液中活菌数试验结果(×108CFU/mL)
菌株 0h 4h 存活率 8h 存活率
植物乳植杆菌FCC5 1.2±0.20 0.80±0.11 66.7％ 0.65±0.05 54.2％
其中，模拟胃液、肠液(不含胃蛋白酶、胰蛋白酶)配制方法参照《美国药典》，模拟胃液：将2.0g氯化钠溶于500mL超纯水中，加入7.0mL浓盐酸，混匀后超纯水稀释至1L，即得，pH约为1.2；模拟肠液：将6.8g磷酸二氢钾溶于250mL超纯水中，搅拌溶解后加入77mL0.2mol/L氢氧化钠和500mL超纯水，0.2mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.8，超纯水稀释至1L，即得。
2)耐胆盐能力：
将活化的植物乳植杆菌菌株FCC5以2％(v/v)接种量接种于含0.3％(w/v)胆盐的MRS肉汤中，37℃孵育4h，活菌计数。结果表明，植物乳植杆菌FCC5存活率达80％。
3)自聚集能力
将1mL FCC5菌悬液用旋涡混合仪涡旋10s，在37℃下孵育5h，轻取200μL上层悬液，测量其600nm处的吸光值。其自聚集公式如下：
自聚集(％)＝(1-A1/A0)×100％
式中：A1为处理5h的吸光值；A0为初始菌悬液的吸光值。
植物乳植杆菌FCC5自聚集能力为60％。
4)疏水性
将等体积的植物乳植杆菌FCC5菌悬液及有机溶剂涡旋振荡2min，37℃静置30min后取水相测其吸光度。有机相选用二甲苯，乙酸乙酯和正己烷。疏水性计算如下：
疏水性％＝[1-(Aj/Ai)×100]
式中：Ai为培养0h的OD600 nm值，Aj为培养3h的OD600 nm值。
植物乳植杆菌FCC5对三种有机试剂的疏水性分别为71.35％、64.48％、57.94％。
5)溶血性：将植物乳植杆菌FCC5在哥伦比亚血琼脂平板表面划线，37℃培养24～48h。根据不同的光晕评估平板的溶血活性。没有明确的透明区域被确定为非溶血性。由图5可见，植物乳植杆菌FCC5没有溶血性。
6)抗生素敏感性：将植物乳植杆菌FCC5发酵液100μL接种至无菌MRS琼脂培养基中混匀后倾注平板，待凝后将10种抗生素药敏试纸贴于平板上，37℃培养2d后测定其抑制圈直径。结果见表4。
表4植物乳植杆菌FCC5对不同抗生素的敏感性
Figure BDA0003380594410000071
注：抗生素敏感性以菌株在平板上被抑制区域的直径(d)来确定。5≤d＜15mm表示敏感性较小，为“+”；15＜d≤30mm表示中等敏感性，为“++”；d＞30mm表示强烈敏感性，为“+++”；不敏感性，为“-”。
实施例3植物乳植杆菌FCC5全细胞催化转化亚麻木酚素开环异落叶松脂酚二葡萄糖苷(SDG)
植物乳植杆菌FCC5菌株在MRS平板上划线分离，挑单菌落接种于含2％(w/v)纤维二糖的MRS肉汤培养基培养18h，取菌液在4℃下10000rpm离心10min，弃上清，菌体用生理盐水洗涤两次，再加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)制成菌悬液，菌悬液的浓度为108CFU/mL。
上述菌悬液5mL加入SDG(10mmol/L)，37℃培养48h，产物在4℃下10000rpm离心10min，上清液采用HPLC(图6)检测SDG、SMG(开环异落叶松脂酚单糖苷)和SECO(开环异落叶松脂酚)，其他代谢物采用液相色谱-质谱联用法检测，可获得SDG转化率约为61％。
实施例4植物乳植杆菌FCC5液态发酵转化SDG为SECO等代谢混合物
植物乳植杆菌FCC5菌株在MRS平板上划线分离，挑单菌落接种于含2％(w/v)纤维二糖的MRS肉汤培养基培养18h获得种子液。
上述种子液以10％(v/v)接种量接种于添加了50mmol/L SDG的无糖MRS肉汤的培养基中，30～37℃培养8天。高效液相色谱法(HPLC)分析产物中SDG、SMG和SECO的含量，其他代谢成分采用液相色谱-质谱联用法进行检测。植物乳植杆菌FCC5发酵SDG过程中SDG、SMG、SECO变化曲线，见图7。SDG转化率约为30％，获得SMG、SECO、Demethyl-dehydroxy-SECO等11个脱糖苷、脱甲基、脱羟基转化产物(见表5)。
表5植物乳植杆菌FCC5液态发酵SDG产生的转化代谢物列表
Figure BDA0003380594410000081
/>
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一株植物乳植杆菌及其在亚麻木酚素生物转化中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）FCC5的16S rDNA序列
<400> 1
tttgatcatg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgaac 60
tctggtattg attggtgctt gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag 120
taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc 180
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agccgacctg agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg 360
gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga 420
gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa 480
ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 540
cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg 600
gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg 660
aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 720
atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa 780
agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct 840
aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg 900
ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960
gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa 1020
atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1080
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt 1140
gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1200
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt 1260
acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct cagttcggat 1320
tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1380
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac 1440
acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga accagccgcc ta 1482

Claims (8)

1.一株植物乳植杆菌，其特征在于：名称为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)FCC5，于2021年10月8日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：61973。
2.一种基于权利要求1所述的植物乳植杆菌制备得到的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：
将权利要求1所述的植物乳植杆菌接种至含纤维二糖的MRS肉汤培养基，35～37℃诱导培养18～24h，取菌液离心，菌体用生理盐水洗涤，加入乙酸-乙酸钠缓冲液重新悬浮制成菌悬液；即获得生物制剂。
4.权利要求1所述的植物乳植杆菌或权利要求2～3任一项所述的菌剂在亚麻木酚素SDG生物转化中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳植杆菌在全细胞催化亚麻木酚素SDG转化中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：
亚麻木酚素SDG转化所用的底物为亚麻木酚素提取物。
7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：应用于实现SDG脱糖苷、脱甲基、脱羟基转化获得代谢中间产物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的代谢中间产物包括脱甲基脱羟基-MATA、脱甲基-AHS、脱甲基脱羟基-SECO、去甲基-SECO、表松脂醇、罗汉松树脂醇、松脂醇、异落叶松脂素、开环异落叶松树脂酚、异落叶松脂素-9'-O-木糖苷、异落叶松脂素-9-O-葡萄糖苷。
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