CN112410269B - 一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14854。实验证明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854可以将玉米赤霉烯酮降解为生物毒性大大降低且稳定存在的玉米赤霉烯酮磷酸盐。本发明具有重要的应用价值。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是一种2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，其对谷物、粮食和饲料的污染广泛且严重。ZEN自身没有毒性但其具有强烈的生物学效应，因其化学结构类似于天然存在的雌性激素导致ZEN具有生殖毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。ZEN的污染导致畜牧业的减产和人类疾病，带来巨大的经济损失，因此，世界各国已开始重视ZEN的污染问题。Pinotti等在2016年调查评估了世界范围内谷类及饲料中ZEN污染的流行状况，并指出在北美、南美、中欧、非洲、北亚和东南亚ZEN污染的发生率最高，其中复合饲料和青贮饲料超标率高达30％。
为减少ZEN对动物及人体的危害，我国规定了食品中ZEN的最高限量，儿童和婴儿食品中限量为20μg/kg，玉米小食中限量为50μg/kg，未加工玉米中的限量为200μg/kg，其余谷物及其制品中最大限量为60μg/kg。
鉴于玉米赤霉烯酮在食品及饲料中含量的限制，市场的监管检测越来越严格，但ZEN存在多种代谢形式，主要在猪和人的肠道中进行代谢，主要包括α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol，α-ZAL)、β-玉米赤霉醇(β-Zearalanol，β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol，α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenol，β-ZOL)、玉米赤霉酮(Zearalanone，ZAN)五种代谢产物。以上代谢产物仍存在一定的毒性，除上述5种主要衍生物之外，还存在着一类特殊的形式，该种形式改变了ZEN原有的化学特征，用传统的检测方法无法检测到，称为“隐蔽性毒素”。目前已发现的玉米赤霉烯酮的隐蔽型形式包括玉米赤霉烯酮-14-硫酸盐(Zearalenone-14-sulfate，Z-14-S)、玉米赤霉烯酮-16-硫酸(Zearalenone-16-sulfate，Z-14-S)、玉米赤霉烯酮-14-葡糖苷(Zearalenone-14-Glucoside，Z-14-G)、玉米赤霉烯酮-16-葡糖苷(Zearalenone-16-Glucoside，Z-16-G)等，其中以14位取代最为常见。最近还发现了玉米赤霉烯酮代谢物的其它隐蔽型形式，如α-玉米赤霉烯醇-硫酸盐(α-Zearalenol-sulfate，α-ZOL-S)。研究发现，玉米赤霉烯酮的隐蔽型形式在哺乳动物体内可以被微生物转化成其原型玉米赤霉烯酮进而产生毒性。
目前，现有的去除玉米赤霉烯酮的菌剂中存在一些弊端，如不能检测或确定玉米赤霉烯酮的转化或降解产物的毒性。因此，现有菌剂虽然去除了玉米赤霉烯酮，但仍有可能转化成了含隐蔽性毒性的衍生物。由此可见，亟需开发一种能够高效安全去除玉米赤霉烯酮的菌剂，该菌剂转化玉米赤霉烯酮的同时不会产生任何毒性，包括隐蔽性毒性。
发明内容
本发明的目的是降解玉米赤霉烯酮。
本发明首先保护一株枯草芽孢杆菌，名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816，该菌株已于2017年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.14854。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854简称枯草芽孢杆菌816。
本发明还保护一种菌剂，其可含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCCNo.14854。所述菌剂的用途可为a1)和a2)中的至少一种：
a1)降解玉米赤霉烯酮；
a2)制备用于降解玉米赤霉烯酮的产品。
所述菌剂的活性成分可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCCNo.14854。
所述菌剂具体可由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854组成。
本发明还保护所述菌剂的制备方法，可包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)816 CGMCC No.14854接种至细菌培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。
所述细菌培养基可为实施例提及的LB液体培养基、种子培养基、发酵培养基、TB液体培养基或MM液体培养基。
所述种子培养基的溶质及其浓度具体可为酵母粉0.5％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)和NaCl 1％(m/v)；溶剂为水；pH值可为7.0-7.5。
所述发酵培养基的溶质及其浓度具体可为麦芽糖1％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)、MgSO4 15mM/L和Tween40 0.01％；溶剂为水；pH值为7.2。
除了活性成分，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物。所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为麦麸、豆粕、玉米芯粉、豆粉和淀粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上述任一所述菌剂具体可为实施例提及的枯草芽孢杆菌816液态菌剂或枯草芽孢杆菌816固态菌剂。
本发明还保护枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854的应用，可为a1)和a2)中的至少一种：
a1)降解玉米赤霉烯酮；
a2)制备用于降解玉米赤霉烯酮的产品。
本发明还保护一种玉米赤霉烯酮降解剂，其含有将玉米赤霉烯酮降解为玉米赤霉烯酮磷酸盐的物质。
所述玉米赤霉烯酮降解剂的活性可为将玉米赤霉烯酮降解为玉米赤霉烯酮磷酸盐的物质。
所述玉米赤霉烯酮降解剂具体可由将玉米赤霉烯酮降解为玉米赤霉烯酮磷酸盐的物质组成。
上述任一所述将玉米赤霉烯酮降解为玉米赤霉烯酮磷酸盐的物质具体可为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854或上述任一所述菌剂。
上述任一所述玉米赤霉烯酮降解剂还可包括微生态制剂。所述微生态制剂包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种中的一种或多种。
本发明还保护一种降解玉米赤霉烯酮的方法，可为采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)816 CGMCC No.14854处理含有玉米赤霉烯酮的物质。
上述方法中，所述“采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854处理含有玉米赤霉烯酮的物质”可通过向含有玉米赤霉烯酮的物质中加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854或上述任一所述菌剂实现。
上述任一所述的方法中，所述处理可为20℃-60℃(如20℃-40℃、40℃-60℃、20℃、30℃、40℃、50℃或60℃)处理2h以上(如2h、3h、4h、5h、6h或7h)。
上述任一所述的方法中，所述处理的pH值可为2.0-9.0(如2.0-3.0、3.0-4.0、4.0-5.0、5.0-6.0、6.0-7.0、7.0-8.0或8.0-9.0)。
上述任一所述的方法中，所述含有玉米赤霉烯酮的物质包括但不限于食品(即含有玉米赤霉烯酮的食品)、饲料(即含有玉米赤霉烯酮的饲料)及其原料、粮食及其加工副产物、粮油、牛奶、陈化粮、茶叶、水果、果汁或中草药中的一种或多种。
上述任一所述方法在降解玉米赤霉烯酮的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述降解玉米赤霉烯酮可为在体内和/或体外降解玉米赤霉烯酮。
所述体内可为动物或人的体内。
所述体内可为胃液和/或肠液。
本发明具有如下有益效果：
1、现有菌剂虽然可降解玉米赤霉烯酮，但是其降解时间相对较长，降解玉米赤霉烯酮的浓度相对较低，而本发明中的枯草芽孢杆菌816可在5h内降解浓度为100μg/mL的玉米赤霉烯酮，且降解率为100％。
2、本发明的枯草芽孢杆菌816在降解玉米赤霉烯酮的同时不会产生有隐蔽性毒性的衍生物，其转化玉米赤霉烯酮后生成的玉米赤霉烯酮磷酸盐可稳定的存在于环境中。
3、本发明的枯草芽孢杆菌816是一株益生菌，对动物及人体没有危害，可安全的应用于食品及饲料的生产处理中。具有生产使用成本低、简单、易操作，菌种安全，玉米赤霉烯酮降解安全、高效等优点。本发明提供的菌株和菌剂可以用于谷物、饲料、饲料原料中玉米赤霉烯酮的去除，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。
由此可见，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854可以降解玉米赤霉烯酮，具体为将玉米赤霉烯酮降解为玉米赤霉烯酮磷酸盐。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)816 CGMCC No.14854将玉米赤霉烯酮降解为生物毒性大大降低且稳定存在的玉米赤霉烯酮磷酸盐。本发明具有重要的应用价值。
保藏说明
菌种名称：枯草芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus subtilis
菌株编号：816
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017年11月03日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.14854
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌816降解玉米赤霉烯酮的液相色谱图。
图2为枯草芽孢杆菌816降解玉米赤霉烯酮生成的产物的质谱鉴定图。
图3为玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮磷酸盐的毒性分析。
图4为枯草芽孢杆菌816菌剂降解含有ZEN的霉变饲料的效果比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
LB固体平板：将LB固体培养基121℃灭菌25min，之后乘热倒入培养皿，自然冷却获得。
LB固体培养基的溶质及其浓度为酵母提取物0.5％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)、NaCl 1％(m/v)和琼脂粉1.6％(m/v)；溶剂为水；pH7.0。
LB液体培养基的溶质及其浓度为酵母提取物0.5％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)和NaCl 1％(m/v)；溶剂为水；pH7.0。
下述实施例中，HPLC检测的参数如下：使用的液相为Waters，有四个流动相进口，A流动相为5mmol乙酸铵，B流动相为甲醇，流动相比例设置为65％：35％；流速为0.5ml/min；柱温为30℃；检测波长为236nm。
实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854的分离、鉴定与保藏
一、玉米赤霉烯酮降解菌816的分离
1、在装有30mL LB液体培养基的摇瓶(规格为50mL)中加入1g土壤样本(采自中国内蒙古自治区赤峰市玉米地)，混匀；然后37℃、180rpm振荡培养12h，得到培养菌液。
2、完成步骤1后，以96孔板为培养载体，取培养菌液采用5次连续玉米赤霉烯酮毒素浓度梯度的富集培养法，获得具有降解玉米赤霉烯酮的菌悬液。
3、取菌悬液，用无菌水稀释，得到不同稀释度的菌液。将各稀释度取0.1mL均匀涂布在LB固体平板上，37℃静置培养过夜。
4、分别将分离程度良好且菌落形态特征、颜色不同的菌落接种至2mL含10μg/mL玉米赤霉烯酮的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养24h，得到培养菌液。之后用甲醇提取培养菌液中残余玉米赤霉烯酮，HPLC检测，获得各个菌落的玉米赤霉烯酮降解效果。
筛选到一株可以明显降解玉米赤霉烯酮的菌株，将其命名为玉米赤霉烯酮降解菌816。
二、玉米赤霉烯酮降解菌816的鉴定
1、形态学鉴定
将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的玉米赤霉烯酮降解菌816进行单菌落状态观察。
结果表明，玉米赤霉烯酮降解菌816的菌落为椭圆形或圆形，大小为1.5mm×3mm，边缘不整齐，表面粗糙褶皱，颜色为微黄色，菌落不透明。
2、16S rDNA序列同源性分析
(1)提取玉米赤霉烯酮降解菌816的基因组DNA并以其作为模板，采用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(2)将PCR扩增产物进行测序。
测序结果表明，PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列在Genbank上进行BLAST比对。比对结果显示，玉米赤霉烯酮降解菌816与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性最高。因此，玉米赤霉烯酮降解菌816被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
三、保藏
玉米赤霉烯酮降解菌816已于2017年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为：CGMCC No.14854。玉米赤霉烯酮降解菌816的全称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)816 CGMCC No.14854，简称枯草芽孢杆菌816。
实施例2、检测枯草芽孢杆菌816降解玉米赤霉烯酮的效果
1、将枯草芽孢杆菌816单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃、180rpm培养24h，得到种子液。
2、将种子液按10％(v/v)接种量接种至含100μg/mL玉米赤霉烯酮的LB液体培养基中，得到培养体系。
3、用甲醇提取步骤2得到的培养体系中残余玉米赤霉烯酮，HPLC检测。
4、取步骤2得到的培养体系，37℃、220rpm培养2h、3h、4h或5h，得到培养菌液。用甲醇提取培养菌液中残余玉米赤霉烯酮，HPLC检测。
检测结果见图1。结果表明，枯草芽孢杆菌816可以降解玉米赤霉烯酮；培养5h时，玉米赤霉烯酮的降解率达100％。
实施例3、检测不同温度下枯草芽孢杆菌816对玉米赤霉烯酮的转化率
ZEN毒素储备液中ZEN的浓度为1mg/mL，溶剂为甲醇。
1、将枯草芽孢杆菌816单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到种子液。
2、将种子液按1％(v/v)接种量接种至5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到发酵液。
3、将2mL发酵液和40μl ZEN毒素储备液充分混合，然后置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃或60℃，200rpm培养2.5h，得到培养菌液。HPLC检测培养菌液中玉米赤霉烯酮的含量。
将发酵液替换为LB液体培养基，其它步骤均不变。作为空白对照。
4、计算转化率。
转化率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
部分检测结果见表1。结果表明，在20℃-60℃条件下，枯草芽孢杆菌816的发酵液对玉米赤霉烯酮的转化率均为60％以上；任何温度下，对照组LB液体培养基均不可转化玉米赤霉烯酮。
表1
温度(℃) 10 20 30 40 50 60
转化率(％) 32.15 73.65 99.81 99.54 79.61 63.85
实施例4、检测不同pH下枯草芽孢杆菌816对玉米赤霉烯酮的转化率
ZEN毒素储备液中ZEN的浓度为1mg/ml，溶剂为甲醇。
1、将枯草芽孢杆菌816单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到种子液。
2、将种子液按1％(v/v)接种量接种至5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到发酵液；之后调节发酵液的pH值为2.0、4.0、6.0、7.0、8.0或9.0。
3、将步骤2获得的2ml发酵液和40μl ZEN毒素储备液充分混合，37℃、200rpm培养2h，得到培养菌液。HPLC检测培养菌液中玉米赤霉烯酮的含量。
将发酵液替换为LB液体培养基，其它步骤均不变。作为空白对照。
4、计算转化率。
转化率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
部分检测结果见表2。结果表明，在pH2.0-9.0条件下，枯草芽孢杆菌816的发酵液对玉米赤霉烯酮的转化率均为60％以上；任何pH条件下，对照组LB液体培养基均不可转化玉米赤霉烯酮。
表2
Figure BDA0002825153370000071
Figure BDA0002825153370000081
实施例5、检测不同反应时间下枯草芽孢杆菌816对玉米赤霉烯酮的转化率
ZEN毒素储备液中ZEN的浓度为1mg/ml，溶剂为甲醇。
1、将枯草芽孢杆菌816单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到种子液。
2、将种子液按1％(v/v)接种量接种至5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到发酵液。
3、将2mL发酵液和40μl ZEN毒素储备液充分混合，然后37℃、200rpm培养0h、1h、2h、3h、4h或5h，得到培养菌液。HPLC检测培养菌液中玉米赤霉烯酮的含量。
将发酵液替换为LB液体培养基，其它步骤均不变。作为空白对照。
4、计算转化率。
转化率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
部分检测结果见表3。结果表明，反应3h后，枯草芽孢杆菌816的发酵液对玉米赤霉烯酮的转化率均为100％；任何反应时间下，对照组LB液体培养基均不可转化玉米赤霉烯酮。
表3
反应时间(h) 0 1 2 3 4 5
转化率(％) 0 25.61 87.49 100 100 100
实施例6、检测枯草芽孢杆菌816对不同浓度的玉米赤霉烯酮的转化率
ZEN毒素储备液中ZEN的浓度为1mg/ml，溶剂为甲醇。
1、将枯草芽孢杆菌816单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到种子液。
2、将种子液按1％(v/v)接种量接种至5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到发酵液。
3、将2mL发酵液和ZEN毒素储备液充分混合，得到混合液；混合液中，ZEN的浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL或200μg/mL。之后，取混合液，37℃、200rpm培养5h，得到培养菌液。HPLC检测培养菌液中玉米赤霉烯酮的含量。
将发酵液替换为LB液体培养基，其它步骤均不变。作为空白对照。
4、计算转化率。
转化率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
部分检测结果见表4。结果表明，ZEN浓度为100μg/mL以下时，枯草芽孢杆菌816的发酵液对玉米赤霉烯酮的转化率均为100％；ZEN任何浓度时，对照组LB液体培养基均不可转化玉米赤霉烯酮。
表4
玉米赤霉烯酮的浓度(μg/mL) 5 10 20 50 100 200
转化率(％) 100 100 100 100 100 97.82
实施例7、不同培养基对枯草芽孢杆菌816降解玉米赤霉烯酮的影响
ZEN毒素储备液中ZEN的浓度为1mg/ml，溶剂为甲醇。
1、将枯草芽孢杆菌816单菌落接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，得到种子液。
2、将种子液按1％(v/v)接种量接种至5mL培养基(LB液体培养基、TB液体培养基或MM液体培养基)，37℃、200rpm培养24h，得到发酵液。
LB液体培养基、TB液体培养基或MM液体培养基的pH值均相同，为7.0。
3、将2mL发酵液和40μl ZEN毒素储备液充分混合，然后37℃、200rpm培养24h，得到培养菌液。HPLC检测培养菌液中玉米赤霉烯酮的含量。
将发酵液替换为LB液体培养基，其它步骤均不变。作为空白对照。
4、计算转化率。
转化率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
部分检测结果见表5。结果表明，不同培养基不影响枯草芽孢杆菌816对玉米赤霉烯酮的降解效率。
表5
培养基 LB液体培养基 TB液体培养基 MM液体培养基
转化率(％) 100 100 100
实施例8、枯草芽孢杆菌816降解玉米赤霉烯酮的产物分析
1、利用二级质谱分析枯草芽孢杆菌816降解玉米赤霉烯酮的产物。
质谱结果见图2(A为一级质谱图，B为二级质谱图)。结果表明，玉米赤霉烯酮发生了磷酸化，产物为玉米赤霉烯酮磷酸盐。
2、采用酵母生物指示剂法分别检测玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮磷酸盐的生物毒性。检测步骤如下：
(1)将酵母接种于SD-trp-ura培养基，30℃、220rpm培养12h；然后再次接种至SD-trp-ura培养基，30℃、220rpm培养至OD600nm为0.4-0.6。
(2)完成步骤(1)后，加入ZEN，获得体系(体系中ZEN的浓度为0、1、5、10、20、50、80或100nmol/L)；之后将所述体系30℃培养4-6h，得到培养体系。
(3)完成步骤(2)后，取所述培养体系，离心，收集菌体；然后用pH7.2、50mM PBS缓冲液洗涤菌体三次，用pH7.2、50mM PBS缓冲液重悬菌体，得到重悬液，并检测OD600nm值。
(4)取酶标板，加入100μL重悬液，测定荧光强度。
(5)计算相对荧光强度。
相对荧光强度＝步骤(4)测定的荧光强度/步骤(3)检测的OD600nm值
检测结果见图3。结果表明，玉米赤霉烯酮磷酸盐的生物毒性大大降低，其雌激素活性小于玉米赤霉烯酮的5％。
实施例9、枯草芽孢杆菌816菌剂的制备及其在降解含有ZEN的霉变饲料中的应用一、枯草芽孢杆菌816液态菌剂的制备
固体培养基的溶质及其浓度为酵母粉0.5％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)、NaCl 1％(m/v)和琼脂粉2％(m/v)；溶剂为水；pH值为7.0-7.5。
种子培养基的溶质及其浓度为酵母粉0.5％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)和NaCl 1％(m/v)；溶剂为水；pH值为7.0-7.5。
发酵培养基的溶质及其浓度为麦芽糖1％(m/v)、胰蛋白胨1％(m/v)、MgSO4 15mM/L和Tween40 0.01％；溶剂为水；pH值为7.2。
1、将枯草芽孢杆菌816接种于固体培养基上，37℃培养24h。
2、完成步骤1后，从所述固体培养基上挑取单菌落并接种至种子培养基，37℃培养至对数期，得到种子液。
3、取规格为5L的发酵罐，加入3L发酵培养基，在1.1kg/cm2的压力、121℃的温度下进行高压湿热灭菌。待冷却至37℃，将种子液按2％(v/v)的接种量接种入发酵罐，37℃、200-260转/分培养30h，得到发酵液。发酵时，无菌空气的通气量为1:1～1.2。
发酵液即为具有降解玉米赤霉烯酮能力的枯草芽孢杆菌816液态菌剂。
枯草芽孢杆菌816液态菌剂中活细胞数量至少达到108CFU/mL。
将枯草芽孢杆菌816液态菌剂分装，保存。
二、枯草芽孢杆菌816固态菌剂的制备
将步骤一制备的枯草芽孢杆菌816液态菌剂和载体(麦麸或玉米芯粉)按照质量比为1:5的比例混合；之后低温(40℃以下)干燥至水分10％以下，再研磨成粉，得到枯草芽孢杆菌816固态菌剂。
将枯草芽孢杆菌816固态菌剂分装，保存。
三、枯草芽孢杆菌816菌剂在降解含有ZEN的饲料中的应用
1、在人工胃液中用枯草芽孢杆菌816降解含有ZEN的饲料
(1)根据中国药典中记载的方法配制人工胃液。具体方法如下：取0.2M的稀盐酸16.4ml，加入胃蛋白酶(Sigma)10g和约800ml水，搅拌均匀后，用1M HCl调节pH至2.0；最后用水定容至1000mL。
(2)取100ml的锥形瓶，加入含有0.4mg ZEN的饲料、2mg枯草芽孢杆菌816固态菌剂和10ml步骤(1)配制的人工胃液，调节pH值至2.0；之后用人工胃液定容至20ml，混匀；最后39℃、150r/min培养0h、4h或12h，加入甲醇终止反应，得到反应液。
(3)完成步骤(2)后，HPLC检测反应液中玉米赤霉烯酮的含量。
玉米赤霉烯酮的含量的检测结果见图4(SGF为人工胃液)。
(4)计算降解率。
降解率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
结果表明，在人工胃液中用枯草芽孢杆菌816消化12h，玉米赤霉烯酮的降解率为62％。
按照上述方法，将步骤(2)中“加入含有0.4mg ZEN的饲料、2mg枯草芽孢杆菌816固态菌剂和10ml步骤(1)配制的人工胃液”替换为“加入含有0.4mg ZEN的饲料和10ml步骤(1)配制的人工胃液”，其它步骤均不变，得到人工胃液的对照。
2、在人工肠液中用枯草芽孢杆菌816降解含有ZEN的饲料
(1)根据中国药典中记载的方法配制人工肠液。具体方法如下：(1)取磷酸二氢钾6.8g，加入500mL水，搅拌均匀后，用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8，得到溶液1；(2)取胰酶(Solarbio)10g，用适量水溶解，得到溶液2；将溶液1和溶液2混合，用水定容至1000mL。
(2)取100ml的锥形瓶，加入含有0.4mg ZEN的饲料、2mg枯草芽孢杆菌816固态菌剂和10ml步骤(1)配制的人工肠液，调节pH值至8.0；之后用人工肠液定容至20ml，混匀；最后39℃、150r/min培养0h、4h或12h，加入甲醇终止反应，得到反应液。
(3)完成步骤(2)后，HPLC检测反应液中玉米赤霉烯酮的含量。
玉米赤霉烯酮的含量的检测结果见图4(SIF为人工肠液)。
(4)计算降解率。
降解率＝1-[(培养菌液中剩余玉米赤霉烯酮的浓度/初始浓度)×100％]
结果表明，在人工肠液中用枯草芽孢杆菌816消化12h，玉米赤霉烯酮的降解率为95％。
按照上述方法，将步骤(2)中“加入含有0.4mg ZEN的饲料、2mg枯草芽孢杆菌816固态菌剂和10ml步骤(1)配制的人工肠液”替换为“加入含有0.4mg ZEN的饲料和10ml步骤(1)配制的人工肠液”，其它步骤均不变，得到人工肠液的对照。
将人工胃液的对照和人工肠液的对照按照相同的培养时间分组，之后取平均值，作为对照。结果见图4中的Control。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。例如，枯草芽孢杆菌816可能发生突变或变异，利用本领域已知的物理和化学方法得到枯草芽孢杆菌816的突变株，只要保留了降解玉米赤霉烯酮这样一个能力特征，也属于本发明的一部分。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420
ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720
cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960
cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200
aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc tttaggagcc agccg 1415

Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）816，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.14854。
2.一种菌剂，其含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）816。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）816接种至细菌培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。
4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）816的应用，为a1）和a2）中的至少一种：
a1）降解玉米赤霉烯酮；
a2）制备用于降解玉米赤霉烯酮的产品。
5.一种玉米赤霉烯酮降解剂，其含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）816或权利要求2所述菌剂。
6.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，为采用权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）816处理含有玉米赤霉烯酮的物质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述处理为20℃-60℃处理2h以上。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述处理的pH值为2.0-9.0。
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