KR101780509B1 - 에쿠올 산생 세균 및 그 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다이드제인으로부터의 에쿠올 변환능이 24 시간에 50 ％ 이상인 미생물, 그 미생물을 함유하는 음식용 또는 의약용 조성물, 그 미생물을 이용한 에쿠올의 제조 방법, 그리고 그 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 단편에 관한 것이다.

Description

에쿠올 산생 세균 및 그 이용{EQUOL-PRODUCING BACTERIUM AND USE THEREOF}

본 발명은 에쿠올 산생 세균 및 그 이용에 관한 것이다.

콩 식품에 많이 함유되는 이소플라본은 부정수소 (不定愁訴) 등의 갱년기 장애의 개선이나 골다공증의 예방, 고지혈증이나 동맥경화의 예방, 유방암이나 전립선암의 예방 등에 효과가 있는 기능성 성분으로서 알려져 있다. 최근의 연구에 의해, 이소플라본의 하나인 다이드제인 (Daidzein) 은 체내의 장내 세균에 의해 에스트로겐 작용이나 항산화 작용이 보다 강력한 에쿠올 (Equol) 로 대사되는 것으로 밝혀져, 에쿠올은 체내에서 상기 작용을 나타내는 주요한 유효 성분의 하나로서 주목받고 있다.

체내에서의 다이드제인으로부터 에쿠올로의 산생은 모든 인간에게 일률적으로 이루어지는 것은 아니며, 그 산생능에는 개인차가 있어 30 ∼ 50 ％ 의 인간이 에쿠올 산생능을 갖는 것으로 보고되어 있다 (비특허문헌 1). 그래서, 에쿠올 산생능을 갖는 장내 세균의 탐색이 정력적으로 이루어지고 있으며, 에쿠올 산생능을 갖는 미생물로서, 박테로이데스ㆍ오바투스, 스트렙토코커스ㆍ인터메디우스, 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 (특허문헌 1), 락토코커스ㆍ가르비에 (특허문헌 2), Slackia spp. TM-30 주, 비피도박테리움ㆍ아돌레센티스 TM-1 주, 비피도박테리움ㆍ브레베 JCM 1273 (특허문헌 3), 프로프리오노박테리아ㆍ프레운데렉키, 비피도박테리움ㆍ락티스, 락토바실러스ㆍ아시도필루스, 락토코커스ㆍ락티스, 엔테로코커스ㆍ페슘, 락토바실러스ㆍ카제이, 락토바실러스ㆍ살리바리우스 (특허문헌 4), SNU-Julong732 (비특허문헌 2), gram positive bacterium do03 (비특허문헌 3) 이 보고되어 있다.

그러나, 상기에서 보고되어 있는 미생물은 모두 기질이 되는 다이드제인으로부터의 에쿠올 변환능이 낮기 때문에, 미생물을 사용한 인간 체내에서의 에쿠올 산생이나 미생물을 사용한 에쿠올의 공업적 생산과 같은 용도에 사용할 수는 없었다.

국제 공개 99/7392호 팜플렛 국제 공개 2005/42호 팜플렛 일본 공개특허공보 2006-204296호 일본 공표특허공보 2006-504409호

Proc Soc Exp Biol Med, Vol.217, No.3, p335-339 (1998) Appl Environ Microbiol, Vol.71, p214-219 (2005) J Biosci Bioeng, Vol.102, p247-250 (2006)

따라서, 본 발명은 에쿠올 변환 효율이 높은 미생물, 그 미생물을 이용한 음식용ㆍ의약용 조성물, 그 미생물을 이용한 에쿠올의 제조 방법, 및 그 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 단편을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 본 발명자들이 먼저 발명한 에쿠올 변환능을 갖는 미생물의 선택 배지를 사용하여 에쿠올 산생능을 갖는 인간의 분변을 계대 배양함으로써 에쿠올 변환 효율이 매우 높은 미생물을 발견하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 다이드제인으로부터의 에쿠올 변환능이 24 시간에 50 ％ 이상인 미생물을 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 상기 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 함유하는 음식용 또는 의약용 조성물을 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 상기 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 다이드제인에 작용시키는 것을 특징으로 하는 에쿠올의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 미생물은 에쿠올 변환 효율이 매우 높기 때문에, 인간 체내에서의 에쿠올 산생을 기도한 음식품이나 의약품에 이용할 수 있어, 에쿠올이 관여하는 부정수소 등의 갱년기 장애, 골다공증, 고지혈증, 동맥경화, 유방암, 전립선암, 월경전 증후군 등의 여러 가지 질병의 치료나 개선, 혹은 그 예방 등의 목적에 이용할 수 있다. 또, 에쿠올의 공업적 생산에 이용한 경우에는, 에쿠올을 고농도로 회수할 수 있기 때문에, 그 후의 분리 정제 등의 작업이 용이해져 매우 효율적으로 에쿠올을 생산할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 핵산 단편을 사용함으로써 분변이나 소화관 내용물로부터 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 검출할 수 있고, 핵산 단편을 사용하여 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 정량화함으로써, 각 개인이 원래 갖는 에쿠올 산생능을 간편하게 조사할 수 있게 된다.

도 1 은 Slackia sp. YIT 11861 의 분자 계통수(樹)를 나타내는 도면이다. 도면 중, [ ] 은 액세션 넘버를, 수치는 Boot strap 값을 나타냈다.
도 2 는 제작한 프라이머의 검출 감도를 나타내는 그래프이다.

본 발명에 있어서, 에쿠올 변환능이란 에쿠올의 기질이 되는 다이드제인을 최종 농도 100 μM 가 되도록 첨가한 배지에, 대상이 되는 미생물을 10⁷ 개/배지ㆍ㎖ 가 되도록 접종하고, 37 ℃ 에서 일정 시간 보온하여 배지 중의 에쿠올 농도를 측정하고, 다이드제인의 초발 농도와 비교하여, 다음 식에 적용함으로써 조사할 수 있다.

에쿠올 변환능 (％) = (대상으로 하는 미생물을 함유하는 배양액 중의 에쿠올 농도)/(배양액 중의 다이드제인의 초발 농도) × 100

여기에서, 배양은 인간 장관 내의 상태를 재현하기 위해 혐기 배양으로 실시하는 것이 바람직하고, 배지로는 GAM 배지가 바람직하다.

또, 에쿠올 농도는 액체 크로마토그래피, LC-MS 등의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있다.

본 발명의 「다이드제인으로부터의 에쿠올 변환능이 24 시간에 50 ％ 이상인 미생물」이란, 상기 에쿠올 변환능이 24 시간의 보온에 의해 50 ％ 이상인 미생물을 가리킨다. 또한, 24 시간의 보온으로 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 100 ％ 인 미생물을 바람직하게 이용할 수 있다. 또, 보다 단시간의 보온, 예를 들어 8 시간의 보온으로 50 ％ 이상인 미생물도 바람직하게 이용할 수 있다. 이들의 일례로서 Slackia 속 세균을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물은 에쿠올 변환능을 갖는 미생물이 존재할 가능성이 있는 검체를 사용하고, 본 발명자들이 먼저 발명한 에쿠올 변환능을 갖는 미생물의 선택 배지 (국제 공개 2007/52740호 팜플렛) 를 사용하여 다이드제인으로부터의 에쿠올 변환능을 확인하면서, 분변 등의 검체를 계대 배양해 나감으로써, 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 스크리닝할 수 있다. 에쿠올 변환능을 갖는 미생물이 존재할 가능성이 있는 검체로는, 에쿠올 산생능을 갖는 인간 (에쿠올 프로듀서) 의 분변이나 소화관 내용물 등이 바람직하게 사용되며, 분변은 원심 세정 처리한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 방법에 의해 얻어진 에쿠올 변환능을 갖는 Slackia 속 세균 중 하나를, Slackia sp. YIT 11861 (FERM BP-11231) 로서, 2009년 2월 3일자로 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 (이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 1 츄오 다이 6) 에 기탁하였다. 이 Slackia sp. YIT 11861 의 계통 분류, 생화학 성상을 다음에 나타낸다.

Slackia sp. YIT 11861 의 1400 bp 이상의 16S rRNA 염기 배열을 정해진 방법에 따라 결정하고, 공공(公共) DNA 데이터베이스 (DDBJ) 에서 FASTA 프로그램을 사용하여 상동성 검색을 실시하였다. 그 결과, 이미 알려진 Slackia 속 세균주 Slackiaexigua ATCC 700122^T (액세션 넘버：AF101240) 와 본 균주의 16S rRNA 의 상동성은 92.4 ％ 였다. 또, DNA 데이터베이스로부터 입수한 다른 세균의 염기 배열을 다중 정렬 후, NJ 법에 의해 분자 계통 해석을 실시한 결과, 본 균주는 코리네박테리아과 Slackia 속에 속하고 있었다. 또, 특허문헌 3 에 기재된 Slackia spp. TM-30 및 3 종의 인간 유래 미배양균 (액세션 넘버；EF071271, DQ797152, AY916234) 과 99 ％ 이상의 상동성을 갖고 있어, 1 군의 클러스터를 형성하고 있었다.

생화학적 성상은 알칼리 포스파타아제가 양성을 나타낸 점, 아르기닌알릴아미다아제, 프롤린알릴아미다아제, 페닐알라닌알릴아미다아제, 류신알릴아미다아제, 티로신알릴아미다아제, 알라닌알릴아미다아제, 글리신알릴아미다아제, 히스티딘알릴아미다아제, 세린알릴아미다아제가 음성을 나타낸 점에서 S. exigua ATCC 700122^T 와 상이하였다. 또, D-만노오스, D-라피노오스의 자화성, 알칼리 포스파타아제가 양성을 나타낸 점에 있어서 Slackia spp. TM-30 과 상이하였다. 이상의 사실로부터, Slackia sp. YIT 11861 은 이미 보고된 주와는 상이하다는 것이 판명되었다.

본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 함유하는 음식용 또는 의약용 조성물은 체내, 혈중, 대장내 등의 장내 등에 있어서의 에쿠올 농도 상승제로서 이용할 수 있어, 부정수소 등의 갱년기 장애, 골다공증, 고지혈증, 동맥경화, 유방암, 전립선암, 월경전 증후군 등의 이소플라본이 관여하는 여러 가지 질병의 치료나 개선, 혹은 그 예방 등의 목적에 이용할 수 있다. 특히, 에쿠올 산생능을 갖지 않는 인간 (에쿠올 비프로듀서) 이나 에쿠올 산생능이 낮은 인간에 사용함으로써 이소플라본이 관여하는 여러 가지 질병을 일상적으로 예방할 수 있다. 또, 부정수소 등의 갱년기 장애나 골다공증, 발암의 리스크가 높아지는 중년기나 노년기의 인간에 바람직하게 이용할 수 있다.

여기에서, 본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물의 이용 형태는 특별히 제한되지 않아, 생균 또는 가열균체 (사균체) 중 어느 것이어도 되고, 또 동결 건조시킨 것이어도 되며, 배양 상청 등의 배양물, 균체 처리물 등을 이용할 수도 있다. 또한, 에쿠올 변환능은 세균 유래 효소에 의해 발휘되는 것으로 생각되기 때문에, 효소의 활성을 실활시키지 않는 상태에서 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에는 아도니톨, 아라비노오스, 에리트리톨, 갈락토오스, 락티톨, 멜레지토오스, 트레할로오스, 리보오스, 소르보오스, 자일로오스, 이노시톨, 소르비톨을 함유시켜도 된다. 이들 당류는 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 선택적으로 유지ㆍ증식시키거나, 혹은 미생물의 에쿠올 변환능을 항진시키는 작용을 가져, 에쿠올 농도 상승 작용을 갖기 때문에, 본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물과 병용함으로써 보다 우수한 에쿠올 농도 상승제로서 이용할 수 있다. 당류는 단독으로 사용해도 되고, 또는 2 종류 이상 조합하여 사용해도 된다. 이들 당류는 D 체, L 체 중 어느 것을 사용해도 되지만, 바람직하게는 D 체이다. 또, 무수물, 5 수화물 등의 수화물을 사용할 수도 있다.

트레할로오스에는 2 분자의 글루코오스의 결합 양식의 상이로 인하여 α,α 체, α,β체, β,β 체의 이성체가 존재하며, 어느 이성체나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 α,α 체이다. 이노시톨에는 9 종류의 입체 이성체 (myo-이노시톨, D(＋)-이노시톨, L-(-)이노시톨, muco-이노시톨, scyllo-이노시톨, cis-이노시톨, epi-이노시톨, allo-이노시톨, neo-이노시톨) 가 존재한다. 천연에는 myo-이노시톨, D(＋)-이노시톨, L-(-)이노시톨, muco-이노시톨, scyllo-이노시톨이 존재하지만, 입수 용이성의 관점에서 myo-이노시톨을 사용하는 것이 바람직하다. 당해 이노시톨은 2 종 이상의 입체 이성체를 병용할 수 있다.

당류는 합성품이나 천연 유래 추출물 등의 시판품을 사용해도 되고, 또 이들 당류를 많이 함유하는 천연 유래 소재로서 사용해도 된다. 구체적으로, 아도니톨을 많이 함유하는 소재로는 식물의 뿌리나 리보플라빈 함유 소재를 들 수 있고, 소르보오스를 많이 함유하는 소재로는 식물의 과실 등을 들 수 있고, 멜레지토오스를 많이 함유하는 소재로는 식물의 꿀이나 분비액을 들 수 있으며, 트레할로오스를 많이 함유하는 소재로는 버섯류를 들 수 있다.

본 발명의 조성물에 다이드제인을 함유시켜도 된다. 다이드제인은 에쿠올의 기질이 되기 때문에, 본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물이나 상기 당류와 병용함으로써 더욱 우수한 에쿠올 농도 상승제로서 이용할 수 있다. 다이드제인은 합성품이나 천연 유래 추출물 등의 시판품을 사용해도 되고, 다이드제인을 많이 함유하는 천연 유래 소재나 그 가공품을 사용해도 된다. 구체적으로, 다이드제인을 많이 함유하는 소재로는 콩, 완두콩, 칡, 클로버 등을 들 수 있고, 이들의 가공품으로는, 예를 들어 두부, 두유, 유부, 낫토, 간장, 된장, 템페 등을 들 수 있다. 이소플라본 배당체는 체내의 장내 세균의 기능에 의해 아글리콘화되기 때문에, 다이드제인은 그 배당체 화합물인 다이드진, 말로닐다이드진, 아세틸다이드진 등의 형태로서 사용할 수도 있다. 또, 다이드제인으로부터의 에쿠올 변환에 있어서의 중간 대사물인 디하이드로다이드제인 등을 사용할 수도 있어, 본 명세서의 「다이드제인」에는 이들의 배당체나 중간 대사물도 포함된다.

본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 함유하는 음식용 또는 의약용 조성물을 사용하는 경우의 투여량에 엄격한 제한은 없으며, 대상자나 적용 질환 등의 여러 가지 사용 양태에 따라 얻어지는 효과가 상이하기 때문에, 적절히 투여량을 설정하는 것이 바람직하다. 미생물량으로는 생균 환산으로 1 일당 10⁵ 개 ∼ 10¹⁰ 개를 투여하는 것이 바람직하고, 특히 10⁶ 개 ∼ 10⁹ 개가 바람직하다. 또, 조성물에 있어서의 당류의 함량은 0.5 ∼ 50 질량％, 또한 1 ∼ 10 질량％, 다이드제인의 함량은 다이드제인 환산으로 5 ∼ 2000 μM, 또한 100 ∼ 800 μM 로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 모두 사용할 수 있지만, 경구 투여가 바람직하다. 투여시에는, 유효 성분인 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 함유하는 조성물을 경구 투여, 직장내 투여, 주사 등의 투여 방법에 적합한 고체 또는 액체의 의약용 무독성 담체와 혼합하여, 관용의 의약품 제제의 형태로 투여할 수 있다.

이와 같은 제제로는, 예를 들어 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 고형제, 용액제, 현탁제, 유제 등의 액제, 동결 건조제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 제제 상의 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있다. 상기 의약용 무독성 담체로는, 예를 들어 전분, 덱스트린, 지방산 글리세라이드, 폴리에틸렌글리콜, 하이드록시에틸 전분, 에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 아미노산, 젤라틴, 알부민, 물, 생리 식염수 등을 들 수 있다. 또, 필요에 따라 안정화제, 습윤제, 유화제, 결합제, 등장화제, 부형제 등의 관용의 첨가제를 적절히 첨가할 수도 있다.

또, 본 발명의 음식용 조성물은 그대로 또는 여러 가지 영양 성분을 첨가하여 음식품 중에 함유시키면 된다. 본 발명의 음식용 조성물은 체내의 에쿠올 농도를 상승시킬 목적, 혹은 부정수소 등의 갱년기 장애, 골다공증, 고지혈증, 동맥경화, 유방암, 전립선암, 월경전 증후군 등의 개선, 예방 등에 유용한 보건용 식품 또는 식품 소재로서 이용할 수 있어, 이들의 음식품 또는 그 용기에는 상기 효과를 갖는다는 취지의 표시를 붙여도 된다. 구체적으로 본 발명의 조성물을 음식품으로 하는 경우에는, 마시거나 먹을 수 있는 첨가제를 적절히 사용하여, 관용의 수단을 사용하여 식용에 적합한 형태, 예를 들어 과립 형상, 입상, 정제, 캡슐, 페이스트 등으로 성형해도 되고, 또 여러 가지 식품, 예를 들어 햄, 소세지 등의 식육 가공 식품, 어묵, 부들어묵 등의 수산 가공 식품, 빵, 과자, 버터, 분유, 발효유 제품에 첨가하여 사용하거나, 물, 과즙, 우유, 청량 음료, 차 음료 등의 음료에 첨가하여 사용해도 된다. 또한, 음식품에는 동물의 사료도 포함된다.

본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 다이드제인에 작용시킴으로써, 효율적으로 에쿠올을 제조할 수 있다. 에쿠올 변환능을 갖는 미생물의 형태는 특별히 제한되지 않아, 생균 또는 가열균체 (사균체) 중 어느 것이어도 되고, 또 동결 건조시킨 것이어도 되며, 배양 상청 등의 배양물, 균체 처리물 등을 사용할 수 있지만, 에쿠올 변환능은 세균 유래 효소에 의해 발휘되는 것으로 생각되기 때문에, 효소의 활성을 실활시키지 않는 상태에서 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 미생물은 종래 공지된 에쿠올 산생균과 비교하여 에쿠올 변환능이 매우 높기 때문에, 수율이 양호하면서 저비용으로 에쿠올을 제조할 수 있다.

구체적으로는, 배지에 다이드제인을 10 ∼ 1000 μM 가 되도록 첨가하여, 본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 10⁶ ∼ 10¹⁰ 개/배지ㆍ㎖ 가 되도록 접종하고, 37 ℃ 에서 8 시간 이상 혐기 배양함으로써 에쿠올을 제조할 수 있다. 이 배지에는 아도니톨, 아라비노오스, 에리트리톨, 갈락토오스, 락티톨, 멜레지토오스, 트레할로오스, 리보오스, 소르보오스, 자일로오스, 이노시톨 및 소르비톨에서 선택되는 1 개 이상의 에쿠올 농도 상승 작용을 갖는 당류를 1 ∼ 10 질량％ 첨가 하는 것이 바람직하고, 그 밖의 질소원 등의 적당한 성분을 첨가하여 사용해도 되지만, 본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물의 증식을 저해하거나 에쿠올 변환능을 저해하는 성분의 사용은 바람직하지 않다. 첨가할 수 있는 성분으로는, 예를 들어 펩톤, 트립티카제 펩톤, 이스트 엑기스, 헤민, 비타민 K1 등의 비타민, L-시스테인염산염, KH₂PO₄, K₂HPO₄, NaCl, (NH₄)₂SO₄, CaCl₂, MgSO₄ 등을 들 수 있다. 본 발명의 배지 중에 함유되는 성분 중, 에쿠올 농도 상승 작용을 갖는 당류나 다이드제인 이외의 성분의 조성은 예를 들어 PY 배지, GAM 배지, BHI 배지 등의 조성으로 할 수 있다.

기질이 되는 다이드제인은 합성품이나 천연 유래 추출물 등의 시판품을 사용해도 되고, 다이드제인을 많이 함유하는 천연 유래 소재나 그 가공품을 사용해도 된다. 또, 다이드제인은 그 배당체 화합물인 다이드진, 말로닐다이드진, 아세틸다이드진 등의 형태로 사용할 수도 있고, 이 경우에는 이소플라본 배당체를 아글리콘화하는 작용을 갖는 공지된 미생물 (비피도박테리움 등) 이나 효소 (β-글루코시다아제 등) 를 본 발명의 미생물과 병용하면 된다.

본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물에 의한 배양 이외에, 미생물 유래의 에쿠올 변환능을 갖는 효소를 작용시킬 수도 있다. 그 사용 방법에 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는, 배양물을 그대로 사용하는 방법, 배양물을 원심 분리나 막 처리 등에 의해 농축시켜 배양물 농축액 혹은 펠릿으로서 사용하는 방법, 정지 균체로서 사용하는 방법, 건조 균체로서 사용하는 방법, 균체 파쇄물로서 사용하는 방법, 조(粗)효소 용액으로서 사용하는 방법, 정제 효소 용액으로서 사용하는 방법, 효소 분말로서 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

효소의 정제 조건, 정제도에 특별히 제약은 없어, 일반적인 정제 수법을 사용할 수 있다. 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 배양한 후, 원심 분리, 유기막, 무기막 등의 분리 수단으로 균체를 분리시키고, 배양 상청 중에 당해 효소가 함유되는 경우에는 이것을 회수하여 조효소 용액으로 할 수 있다. 또, 균체 내에 당해 효소가 함유되는 경우에는, 균체를 호모게나이저나 초음파 처리에 의해 물리적으로 파쇄하거나, 혹은 세포벽 용해 효소 등을 사용하여 효소적으로 처리함으로써 균체내 추출액을 얻어, 조효소 용액으로 할 수 있다. 이들 조효소 용액을 황산암모늄 염석 처리, 투석, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등을 적절히 조합함으로써, 정제도가 높은 정제 효소 용액으로 해도 된다.

에쿠올 변환능을 갖는 미생물이나 미생물 유래의 에쿠올 변환능을 갖는 효소는 일반적인 고정화 수법을 이용하여 고정화시킨 것을 사용해도 된다. 고정화 수법으로는, 담체 결합법, 가교법, 포괄법 등을 들 수 있는데, 이것에 제한되는 것은 아니다. 담체 결합법으로는 공유 결합법, 이온 결합법, 물리적 흡착법, 가교법으로는 글루타르알데히드법, 포괄법으로는 격자형 포괄법과 마이크로캡슐형 포괄법을 예로서 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 활성탄, 톱밥 등에 흡착시키는 방법, CM-셀룰로오스, P-셀룰로오스, DEAE 셀룰로오스, ECTEOLA-셀룰로오스 등에 결합시키는 방법, 글루타르알데히드, 톨릴렌디이소시아네이트 등에 의해 가교하는 방법, 아크릴아미드, κ 카리기난, 알긴산, 젤라틴, 아세트산셀룰로오스 등에 의해 포괄시키는 방법을 들 수 있다. 또, 고정화시킨 세균 혹은 효소를 배치식, 칼럼식 등의 일반적으로 이용되는 방법으로 사용할 수 있고, 이들은 단회, 반복, 혹은 연속 사용할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조한 에쿠올은 배양 상청 등의 에쿠올 함유 배양물을 그대로 사용해도 되고, 칼럼 크로마토그래피, 유기 용매 추출 등의 통상적인 방법에 따라 배양물로부터 에쿠올을 분리 정제해도 된다. 얻어진 배양물을 이온 교환 칼럼에 흡착시킨 후, 메탄올로 용출시켜, 에쿠올 정제물로 할 수 있다.

본 발명의 에쿠올 변환능을 갖는 미생물의 DNA 및/또는 RNA 에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 단편은 본 발명자들이 시퀀스를 실시하여 얻은 Slackia sp. YIT 11861 의 염기 배열과 데이터베이스 (DDBJ, Genbank 등) 를 비교ㆍ검토함으로써 얻었다. 본 발명의 핵산 단편을 작성할 때에, 그 타깃에는 계통 분류의 지표로서 신뢰성이 높은 16S rRNA 유전자를 사용하고, 분석에는 PCR 법 등의 수단이 필요해지기 때문에, RNA 가 아니라 DNA 를 사용하였다.

핵산 단편의 설계시에는, 표적으로 하는 에쿠올 변환능을 갖는 Slackia 속 세균과 그 근연균의 16S rRNA 염기 배열로 얼라이먼트를 실시하였다. 즉, 현재의 유전자 배열을 지표로 한 분류 체계에 기초하여 코리네박테리아과에 속하는 근연균종 (아토포비움속, 콜린셀라 등) 을 선택하여, 얼라이먼트를 실시하였다. 그 결과, 배열 번호 1 또는 2 에 기재된 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편이 얻어졌다. 목적 세균의 DNA 및/또는 RNA 에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 핵산 단편으로는, 이렇게 하여 설계된 배열뿐만 아니라, 공지된 기술 상식에 따르면 적절히 상정할 수 있으며, 당해 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편, 또는 이것들과 상동인 염기 배열로 이루어지고 또한 기능적으로 등가인 핵산 단편을 들 수 있다. 여기에서, 이것들과 상동인 염기 배열로 이루어지고 또한 기능적으로 등가인 핵산 단편으로는, 예를 들어 이하의 (a) ∼ (c) 에 나타내는 핵산 단편으로서, 목적 미생물의 검출이나 동정, 정량에 사용할 수 있는 것을 들 수 있다.

(a) 배열 번호 1 또는 2 로 나타내는 염기 배열 혹은 그것과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편에 있어서, 1 또는 여러 개, 바람직하게는 1 내지 10 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편.

(b) 배열 번호 1 또는 2 로 나타내는 염기 배열 혹은 그것과 상보적인 염기 배열과 90 ％ 이상, 바람직하게는 95 ％ 이상, 보다 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편.

(c) 배열 번호 1 또는 2 로 나타내는 염기 배열 혹은 그것과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편.

또한, 여기에서 염기 배열의 동일성은 GENETYX(R) 의 호몰로지 해석 프로그램을 사용함으로써 산출된다. 또, 「스트린젠트한 조건」으로는, 예를 들어 50 ％ 포름아미드, 5 × SSC, 5 × 덴하르트 용액 및 250 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA 를 함유하는 용액에 42 ℃ 에서 16 ∼ 24 시간 항온하여, 하이브리다이즈시키는 조건을 들 수 있다.

상기와 같이 설계한 핵산 단편은 그 염기 배열에 따라 DNA 합성기에 의해 인공적으로 합성할 수 있다. 그 특이성은 이하의 실시예에 나타내는, 핵산 단편을 프라이머로서 사용한 경우의 18 주의 근연종 (Atopobium fosser JCM 9981^T, Atopobium minutum JCM 1118^T, Atopobium parvulum JCM 10300^T, Atopobium rimae JCM 10299^T, Atopobium vaginae DSM 15829^T, Collinsella aerofaciens ATCC 25986^T, Collinsella intestinalis JCM 10643^T, Collinsella stercoris JCM 10641^T, Cryptobacterium curtum DSM 15641^T, Denitrobacterium detoxificans CCUG 47027^T, Eggerthella hongkongensis JCM 14552^T, Eggerthella lenta ATCC 25559^T, Eggerthella sinensis JCM 14551^T, Olsenella profusa JCM 14553^T, Olsenella uli JCM 12494^T, Slackia exigua JCM 11022^T, Slackia faecicanis JCM 14555^T, Slackia heliotrinireducens JCM 14554^T) 에 대한 안플리콘의 유무 그리고 대표적인 장내 세균종 및 병원균종 27 주의 안플리콘의 유무를 지표로 하여 확인하였다. 결과적으로, 특이성에 문제는 없었다.

본 발명의 핵산 단편은 에쿠올 변환능을 갖는 미생물에 특이적이기 때문에, 인간이나 동물의 분변이나 소화관 내용물로부터 얻은 DNA 나 RNA 를 대상으로 한 PCR 반응, 혹은 FISH (Fluorescence in situ hybridization) 등을 실시함으로써, 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 특이적으로 검출, 동정, 정량할 수 있다. 에쿠올 변환능을 갖는 미생물을 정량화함으로써, 각 개인이 원래 갖는 에쿠올 산생능을 간편하게 조사할 수 있게 되어, 에쿠올이 관여하는 부정수소 등의 갱년기 장애, 골다공증, 고지혈증, 동맥경화, 유방암, 전립선암, 월경전 증후군 등의 여러 가지 질병의 이환 (罹患) 리스크를 파악할 수 있고, 에쿠올 산생능이 없는 인간이나 낮은 인간에 대해 본 발명의 조성물을 투여하는 등의 예방책을 효과적으로 강구할 수 있다. 또, 이들 질병에 걸린 인간으로 에쿠올 산생능이 없는 인간이나 낮은 인간에 대해서도, 본 발명의 조성물을 투여하거나 하여 질병의 치료나 개선에 유용하게 쓸 수 있다.

PCR 혹은 RT-PCR 을 사용하는 분석 방법은, 예를 들어, (1) 검체 중의 DNA 또는 RNA 를 추출하는 공정, (2) 상기 핵산 단편 중 1 개 이상을 사용하여 PCR 혹은 RT-PCR 을 실시하는 공정, 및 (3) 공정 (2) 에 의해 증폭된 DNA 단편을 검출하는 공정에 의해 실시할 수 있다. 검체 유래의 주형 DNA (주형이 RNA 인 경우에는 cDNA) 에 본 발명의 핵산 단편을 조합, 증폭 반응을 실시함으로써, 표적으로 하는 Slackia 속 세균에 특이적인 DNA 단편 (PCR 산물) 을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA 를 전기 영동하면, 밴드의 유무로부터 표적으로 하는 Slackia 속 세균을 특이적으로 검출, 동정할 수 있다.

또, 주형의 DNA 또는 RNA (cDNA) 를 단계 희석시켜 PCR 을 실시하면, Slackia 속 세균의 정량화도 가능하다. PCR 을 사용하여 정량할 때에는, 상기 방법 외에, 리얼 타임 PCR (Real-time PCR) 을 사용하는 방법이 보다 바람직하다. PCR 에 의해 증폭되는 PCR 산물량을 시간 경과에 따라 관찰하여, 일정한 DNA 량에 이르렀을 때의 PCR 사이클수를 특정함으로써, 검체 중의 Slackia 속 세균의 정량이 가능해진다.

증폭되는 PCR 산물의 시간 경과적 관찰은 PCR 산물을 SYBR(R)Green I 등의 인터칼레이터성 형광 색소에 의해 표지하고, 각 PCR 단계에서의 형광 강도를 측정함으로써 실시할 수 있다. 인터칼레이터성 색소는 2 개 사슬 핵산에 인터칼레이션함으로써 형광 강도가 증가하는 성질을 갖기 때문에, 표적 세균의 DNA (RNA 의 경우에는 cDNA) 로부터 PCR 반응에 의해 생성되는 PCR 산물을 정확하게 측정할 수 있어, 특히 SYBR(R)Green I 가 바람직하게 사용된다.

임의로 설정된 일정한 형광 강도 (DNA 량) 에 이르렀을 때의 PCR 사이클수 (이하, C_T 값으로 한다) 를 특정함으로써, 검체 중의 표적 세균의 정량 혹은 검출ㆍ동정이 가능해진다. 또, 형광 색소에 의해 표지한 TaqMan 프로브나 Moleculer Beacon 등을 사용함으로써 실시할 수도 있다. TaqMan 프로브나 Moleculer Beacon 은 PCR 에 의해 증폭되는 영역의 내부 배열과 상동성을 갖는 올리고뉴클레오티드에 형광 색소와 퀀처를 결합시킨 프로브로서, PCR 반응에 공존시켜 사용한다. 프로브에 결합된 형광 색소와 퀀처의 상호 작용으로 PCR 증폭 반응에 따른 형광을 발하기 때문에, 각 PCR 단계에서의 형광 강도를 측정함으로써 증폭되는 PCR 산물의 시간 경과에 따른 관찰을 할 수 있다.

검체 중의 표적으로 하는 Slackia 속 세균의 정량 혹은 검출ㆍ동정은 배양법 등에 의해 계측한 세균수의 대수값과 C_T 값의 검량선에 의해 구할 수 있다. 즉, 표적으로 하는 세균수의 대수값을 횡축에, C_T 값을 종축에 플롯한 검량선을 미리 작성하고, PCR 반응의 결과 얻어진 C_T 값을 그 검량선에 적용하여, 검체 중의 표적으로 하는 Slackia 속 세균의 정량, 혹은 검출ㆍ동정을 실시한다.

본 발명의 핵산 단편은, 상기 PCR 법에서 프라이머로서 사용하는 것 외에, 단독으로도 프로브로서 사용할 수 있고, 이들은 다른 공지된 유니버설 프라이머, 올리고 뉴클레오티드 등과 조합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 핵산 단편을 프로브로서 사용하는 분석 방법으로는, 예를 들어 인시투 하이브리다이제이션 (in situ hybridization), 도트 블롯 하이브리다이제이션 (dot blot hybridization) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 인 시투 하이브리다이제이션은 검체 중의 핵산을 추출하는 공정을 필요로 하지 않기 때문에 신속한 수법으로서 바람직하고, 형광 물질에 의해 표지한 핵산 단편을 프로브로서 사용하는 FISH 가 보다 바람직하다.

FISH 는 구체적으로는 (1) 검체를 포름알데히드 혹은 포르말린에 의해 고정시키는 공정, (2) 고정시킨 검체를 슬라이드글라스 또는 멤브레인 필터에 도말 (塗抹) 하는 공정, (3) 형광 표지한 핵산 단편에 의해 하이브리다이제이션을 실시하는 공정, (4) 하이브리다이제이션 후의 여분의 핵산 단편 및 비특이적으로 결합된 핵산 단편을 세정하는 공정, 및 (5) 하이브리다이즈 후의 결과에 대하여 형광 현미경을 사용하여 육안으로 관찰, 혹은 CCD 카메라 등에 의해 화상으로서 취득하는 공정에 의해 실시할 수 있다.

검체 중에 표적으로 하는 Slackia 속 세균이 존재하는 경우에는, 사용한 핵산 단편과 하이브리다이즈하고, 상기 하이브리다이즈 후의 결과에 있어서의 시그널이 양성이 되기 때문에, 이들 세균을 특이적으로 검출하고, 동정할 수 있다. 또, 그것을 계수함으로써, 정량화도 가능해진다.

이하, 시험예 및 실시예를 들어 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 전혀 제약받지 않는다.

실시예

시험예 1 에쿠올 변환능을 갖는 세균의 취득

건강한 에쿠올 프로듀서의 신선 배설변을 유리 비즈 (φ3 ㎜) 존재하에서 10 배 용량의 혐기 상태의 희석액 (KH₂PO₄ 0.00255 ％, K₂HPO₄ 0.00255 ％, NaCl 0.006 ％, (NH₄)₂SO₄ 0.00255 ％, CaCl₂ 0.000255 ％, MgSO₄ 0.000255 ％, 0.1 ％ 레자주린 용액 0.1 ％, 8 ％ Na₂CO₃ 용액 2.2 ％, L-시스테인염산염 0.05 ％) 에 충분히 현탁시키고, 멸균 거즈를 사용하여 잔사를 제거하였다. 8,000 xg, 10 분의 원심 분리를 실시하고, 침전을 동량의 동 희석액으로 현탁시켰다. 이 상태에서 -30 ℃ 에서 동결 보존하였다. 사용시에 해동시킨 분변 희석액을 8,000 xg, 10 분의 원심 분리를 실시하고, 얻어진 침전에 대하여 소르보오스를 당원으로 한 PY 배지 (펩톤 0.5 ％, 트립티카제 펩톤 0.5 ％, 이스트 엑기스 1 ％, 헤민 0.00005 ％, 비타민 K1 0.0001 ％, L-시스테인염산염 0.05 ％, KH₂PO₄ 0.0006 ％, K₂HPO₄ 0.0006 ％, NaCl 0.0012 ％, (NH₄)₂SO₄ 0.0006 ％, CaCl₂ 0.00006 ％, MgSO₄ 0.00006 ％) 에 현탁시켰다. 37 ℃, 혼합 가스 (N₂：H₂：CO₂ = 88：7：5) 존재하에서 24 ∼ 48 시간 인큐베이트하였다. 이것을 7 대까지 계대한 배양물에 대하여, 동 배지를 사용하여 10⁶ 배 희석액을 조정하였다. 이 희석액 50 ㎕ 에 대하여, 각각 20 장의 GAM (1 ％ glucose 첨가) 한천 평판 배지에 도말하였다. 이것들을 37 ℃, 72 h, 혐기 글로브 박스 내에서 인큐베이트하여 콜로니를 형성하게 하였다. 얻어진 콜로니에 대하여, 콜로니 성상 (표면 성상, 크기) 및 그람 염색 이미지로부터 26 종류로 분류하였다. 각각의 대표 콜로니에 대하여 종농도 100 μM 의 다이드제인을 함유하는 GAM (1 ％ glucose 첨가) 액체 배지에 식균하였다. 37 ℃, 24 h, 혼합 가스 (N₂：H₂：CO₂ = 88：7：5) 존재하에서 인큐베이트한 배양액에 대하여 HPLC 로 에쿠올 농도를 측정한 결과, 높은 다이드제인 에쿠올 변환능을 갖는 그람 양성 간균을 발견하였다. 또한, HPLC 조건은 다음의 조건에서 실시하였다.

장치 ：LC 모듈 1 (Waters)

칼럼 ：YMC-Pack CN (Y.M.C 제조)

검출 ：자외 흡광 광도계 (측정 파장 280 ㎚)

칼럼 온도 ：40 ℃

이동상 ：0.1 ％ 포름산 용액/아세토니트릴/메탄올 (87：3：10) 혼액

유량 ：2.5 ㎖/min

샘플 주입량 ：10 ㎕

시험예 2 에쿠올 변환능을 갖는 세균의 분자 계통 해석, 생화학 성상 시험

시험예 1 에서 단리시킨 세균 게놈을 주형으로 하여, 프라이머 27f (배열 번호 3) 및 1552r (배열 번호 4) 을 사용하여, 16S ribosomal RNA (16S rRNA) 를 표적으로 PCR 을 실시하여, 약 1500 bp 의 증폭 산물을 얻었다. 그것을 주형으로 하여, 시퀀싱 PCR 을 실시하였다. 시퀀싱 PCR 에는, BigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) 를 사용하여, 제품 매뉴얼에 준한 방법으로 실시하였다. 시퀸서에는 AB 3130 제네틱 애널라이저 (Applied Biosystems) 를 사용하였다. 16S rRNA 배열의 분자 계통 해석 및 상동성 해석에는 Clustal X v1.83, TreeView v1.6.6 및 GENETIX(R) Ver.7 (주식회사 제네틱스) 을 사용하였다. 그 결과, 본 균주는 코리네박테리아과에 속한다는 것이 분명해졌다 (도 1). Slackia exigua ATCC 700122^T 가 계통적으로 가장 근연인 기존의 균종이었지만, 상동성은 낮은 값을 나타냈다 (92.4 ％). 특허문헌 3 에 기재된 Slackia spp. TM-30 과는 99 ％ 이상의 상동성을 갖고 있어, 데이터베이스 상에 등록되어 있는 미배양 균주와 아울러 1 군의 클러스터를 형성하고 있었다. 이 사실로부터 본 균주와 Slackia spp. TM-30 은 동종일 가능성이 나타났다.

본 균주 및 16S rRNA 배열 해석으로부터 기존 종에서 가장 계통적으로 가까운 S. exigua ATCC 700122^T 에 대하여, 래피드 ID 32A (시스멕스ㆍ바이오메리으 주식회사) 를 사용하여 생화학 성상을 조사하였다. 공시(供試)균의 배양에는 GAM (1 ％ glucose 첨가) 한천 배지를 사용하여, 37 ℃ 에서 24 시간, 혐기 조건하에서 배양하였다. 또한, 동정 키트 1 개에 대하여 2 장분의 GAM (1 ％ glucose 첨가) 한천 배지를 사용하였다. 키트에 대한 공시균액의 조정, 반응 그리고 판정은, 키트에 부속된 매뉴얼에 따랐다. 그 결과를 표 1 에 나타냈다. 에쿠올 변환능을 갖는 세균은, 래피드 ID 32A 에 있어서, S. exigua ATCC 700122^T 와는 크게 상이한 성상을 나타냈다. 또, 에쿠올 변환능을 갖는 세균은, 래피드 ID 32A 에서 D-만노오스, D-라피노오스의 자화성, 알칼리 포스파타아제가 양성을 나타낸 점에 있어서 특허문헌 3 에 기재된 Slackia spp. TM-30 의 생화학 성상과 상이하였다. 따라서, 이미 보고된 주와는 상이하다는 것이 분명해졌다. 이상의 분자 생물학적 및 생화학 성상 시험 결과로부터 본 균주는 Slackia 속에 포함되는 신규주인 것으로 생각되어, Slackia 속 세균 YIT 11861 (Slackia sp. YIT 11861) 로 명명하였다.

시험예 3 Slackia sp. YIT 11861 의 다이드제인 에쿠올 변환 활성

Slackia sp. YIT 11861 에 대하여 다이드제인 에쿠올 변환 활성을 조사하였다. 다이드제인 농도를 100, 400 μM 로 한 GAM 배지에, 10⁷ 개/배지ㆍ㎖ 가 되도록 본 균을 접종하고, 37 ℃ 에서 보온하였다. 시간이 경과함에 따라 배양액 중의 에쿠올 농도를 HPLC 로 측정하여, 다이드제인 에쿠올 변환 활성을 측정하였다.

결과를 표 2 에 기재하였다. 아울러, 특허 혹은 논문에서 공표되어 있는 균주의 활성을 조사하여 비교하였다. 그 결과, Slackia sp. YIT 11861 은, 100 μM 의 다이드제인을 8 시간의 인큐베이트에서 95 ％, 24 시간에 100 ％, 400 μM 의 다이드제인을 24 시간에 94 ％, 96 시간에서는 100 ％ 에쿠올로 변환시켰다. 한편, gram positive bacterium do-03 주 (비특허문헌 3) 에서는 193 μM 의 다이드제인을 48 시간에 33 ％ (초발 균체 농도：미기재, 최종 균체 농도：OD₆₆₀ = 0.277, 이것으로부터 10⁶ ∼ 10⁸ 개/㎖ㆍ배지인 것으로 추정된다), TM-30 주에서는, 391 μM 의 다이드제인을 24 시간에 불과 1 ％ 정도 (초발 균체 농도： 미기재, 최종 균체 농도：10⁹ 개/배지ㆍ㎖), 또 L. gariviae 92-90 주에서는 불과 42 μM 의 다이드제인을 100 ％ 에쿠올로 변환시키는 데에 72 시간을 필요로 하고, 24 시간에서의 에쿠올 변환은 0 ％ 였다 (초발 균체 농도：10⁷ 개/배지ㆍ㎖). 이상의 사실로부터, Slackia sp. YIT 11861 의 다이드제인 에쿠올 변환 활성은 기존의 균주에 비해 매우 높은 활성을 갖고 있는 것이 분명해졌다.

시험예 4 Slackia sp. YIT 11861 에 특이적인 핵산 단편의 설계

Slackia sp. YIT 11861 에 특이적인 배열을 기초로 프라이머의 설계를 실시하였다. 공공 데이터베이스 (DDBJ/GENEBANK/EMBL) 로부터 코리네박테리아과의 16S rRNA 배열을 입수하여, 얻어진 배열을 기초로 Clustal X v1.83 을 사용하여 근연종의 rRNA 배열과 함께 정렬시켜, 특이적인 영역에 대하여 프라이머 eq430-F/eq665-R 을 설계하였다 (배열 번호 1 및 2). Slackia sp. YIT 11861 균체 (2 × 10⁸ 개/㎖) 로부터 추출한 RNA 를, 2 × 10⁶ 내지 2 × 10^-1 개/㎖ 상당이 되도록 10 배 단계 희석을 하였다. 이 희석 RNA 를 1 반응당 5 ㎕ 를 주형으로 하여, 정량적 RT-PCR 을 실시하였다. 정량적 RT-PCR 에는 OneStep RT-PCR kit (QIAGEN) 를 사용하였다. 반응액은 50 ℃ 에서 30 분간 역전사 반응을 실시하고, 그 후 역전사 효소를 실활시키기 위해 95 ℃ 에서 15 분간 가열하였다. 계속해서, 94 ℃ 20 초, 60 ℃ 20 초, 72 ℃ 50 초를 1 사이클로 하여 45 사이클 실시하였다. 그 결과, 본 프라이머에 의한 PCR 증폭은 1 반응당 10^-3 내지 10³ 개의 범위에서 균수와 상관을 나타냈다. 분변 1 g 당으로 환산하면 10³ 개의 균체를 정량할 수 있다는 것이 분명해졌다 (도 2).

프라이머의 특이성의 검토에는, 표 3 에 기재된 대표적인 장내 세균, 감염증 기인균 및 코리네박테리아과에 속하는 근연종을 대상으로 하였다. DAPI 염색법에 의해 미리 균수를 측정해 둔 각 균주의 순배양균액으로부터 RNA 를 추출하여, 2 × 10⁸ 개/㎖ 상당이 되도록 RNA 농도를 조정하였다. 1 반응에 대해 RNA 를 1 × 10⁵ 개/㎖ 상당 공시하고, 상기 서술한 조건에 의해 정량적 RT-PCR 을 실시하였다. 상기 서술한 프라이머에 대하여, 대표적인 장내 세균, 감염증 기인균 및 코리네박테리아과에 속하는 근연종을 대상으로 하여 그 반응성을 검토하였다. 그 결과를 표 3 에 기재하였다. 표 3 에 있어서, ＋：C_T 값 ≥ 40, -：C_T 값 ＜ 40 을 나타낸다.

본 프라이머는 Slackia sp. YIT 11861 에 대해서만 높은 특이성을 갖고 있었다. 한편, 다른 대상 균주에 대한 교차 반응은 전혀 확인되지 않았다. 또, RNA 샘플 대신에 Nuclease-free water 를 첨가한 반응에 있어서의 비특이적 산물의 증폭은 관찰되지 않았다.

시험예 5 인간에 있어서의 해석

배열 번호 1 및 2 의 프라이머를 사용하여, 40 명의 건강한 성인 볼런티어의 분변 RNA 를 대상으로 정량적 RT-PCR 을 실시하였다. 신선한 볼런티어의 분변 20 ㎎ 으로부터 AGPC 법에 의해 전체 RNA 를 추출하였다. 이 전체 RNA 를 적절히 희석시켜, 정량적 RT-PCR 을 실시하였다. 반응은 시험예 4 에 기재된 방법에 따랐다. 미리 균수를 알고 있는 Slackia sp. YIT 11861 로부터 추출한 RNA 의 반응성을 지표로 하여, 샘플 중의 Slackia sp. YIT 11861 의 균수를 산출하였다. 그 결과, Slackia sp. YIT 11861 은 40 명 중 16 명 (40 ％) 으로부터 6.4 ± 2.4 (Log₁₀ 개/gㆍ분변) 의 균수로 검출되었다.

실시예 1 에쿠올의 제조

10 ℓ 의 다이드제인 함유 소르보오스 PY 배지 (다이드제인 0.025 ％, 소르보오스 1 ％, 펩톤 0.5 ％, 트립티카제 펩톤 0.5 ％, 이스트 엑기스 1 ％, 헤민 0.00005 ％, 비타민 K1 0.0001 ％, L-시스테인염산염 0.05 ％, KH₂PO₄ 0.0006 ％, K₂HPO₄ 0.0006 ％, NaCl 0.0012 ％, (NH₄)₂SO₄ 0.0006 ％, CaCl₂ 0.00006 ％, MgSO₄ 0.00006 ％) 에, 10⁸ 개/배지ㆍ㎖ 의 Slackia sp. YIT 11861 을 첨가하고, 37 ℃, 96 h, 혼합 가스 (N₂：H₂：CO₂ = 88：7：5) 존재하에서 인큐베이트하였다. 배양액을 원심 분리 (8000 xg, 15 분간) 하고, 그 상청에 등량의 디에틸에테르를 첨가하였다. 충분히 교반 후, 원심 분리 (1000 xg, 2 분간) 에 의해 2 층으로 분리하여, 디에틸에테르층만을 분취하였다. 디에틸에테르층을 40 ℃, 질소 기류하에서 건고 (乾固) 시켜, 2.4 g 의 에쿠올을 얻었다.

실시예 2 정제의 제조

하기 표 4 의 처방으로 각종 성분을 혼합하여 조립 (造粒)ㆍ건조ㆍ정립 (整粒) 한 후에, 타정하여 정제를 제조하였다.

1) Slackia sp. YIT 11861 의 생균체를 동결 건조시켜 제조하였다 (생균체 10¹⁰ 개/g 을 포함한다).

실시예 3 청량 음료의 제조

하기 표 5 의 처방에 의해, 통상적인 방법에 따라 각 성분을 배합하고, 균질화하여 청량 음료를 얻었다. 얻어진 청량 음료는 갈색병에 충전 후, 알루미늄캔으로 봉인하고, 가열 처리를 실시하였다.

1) Slackia sp. YIT 11861 의 생균체를 동결 건조시켜 제조하였다 (생균체 10¹⁰ 개/g 을 포함한다).

독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 FERMBP-11231 20090203

SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> equol-producing bacteria and the use <130> YK0053 <150> JP2009-042867 <151> 2009-02-25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide as PCR primer eq430-F <400> 1 gggacgaagt cattcgtga 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide as PCR primer eq665-R <400> 2 gcatccgagg cttccagtt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide as PCR primer 27f <400> 3 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide as PCR primer 1552r <400> 4 aaggaggtga tccarccgca 20

Claims (9)

1. Slackia sp. YIT 11861 (FERM BP－11231) 인 미생물.
2. 제 1 항에 기재된 미생물을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식용 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   추가로 아도니톨, 아라비노오스, 에리트리톨, 갈락토오스, 락티톨, 멜레지토오스, 트레할로오스, 리보오스, 소르보오스, 자일로오스, 이노시톨 및 소르비톨에서 선택되는 1 개 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식용 조성물.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
   추가로 다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식용 조성물.
5. 제 1 항에 기재된 미생물을 다이드제인에 작용시키는 것을 특징으로 하는 에쿠올의 제조 방법.
6. 제 1 항에 기재된 미생물의 DNA, RNA, 또는 DNA 및 RNA 에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는, 배열 번호 1 또는 2 에 기재된 염기 배열 혹은 그것과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 핵산 단편.
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