CN110343692A - 一种细菌固定化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌固定化方法及应用，将LH‑52、TM‑30、EggerthellaYY7918等三种菌包埋到载体微球上，再将此固定化细菌微球装填到层析柱中，制成微生物反应器。本发明通过固定化细菌方法，提高了细菌的利用率，而且可以回收重复使用；通过装入层析柱中，可以用于连续生产。同时，所得到的菌种固定化球生产成本低，菌体附着牢固，菌种具有较高的活性和较长的使用寿命，可高效生产S‑雌马酚。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种细菌固定化方法及应用。
背景技术
大豆异黄酮作为大豆的次级代谢产物，因其广泛的生物活性，近年来引起了国内外学者的高度重视，由于其具有类似雌二醇的结构，又被称为“植物雌激素”。大豆异黄酮包括大豆苷(Daidzin)，大豆苷元(Daidzein)，染料木苷(Genistin)，染料木素(Genistein)，黄豆黄素(Glycitin)，黄豆黄素苷元(Glycitein)等化合物，大豆苷元和染料木素为主要成分。S-雌马酚(S-equol)为大豆苷元的肠道菌群代谢产物，具有类似于大豆异黄酮的生物活性，但生物活性更高，且代谢动力学类型更理性。雌马酚在预防前列腺癌、乳腺癌、骨质疏松以及更年期综合征、心脏病和骨质疏松均有一定疗效。
研究表明，啮齿类动物均可代谢大豆异黄酮产生雌马酚，但对于人类，由于肠道菌群、饮食结构的个体差异，产生雌马酚的能力均不相同。在西方人群中，只有大约30％的个体能够产生雌马酚，而亚洲地区，约有60％的个体可以产生。因此，对于那些无法产生雌马酚的人，其摄入大豆类制品或大豆异黄酮后所产生的健康效应弱于雌马酚产生者。目前，雌马酚的合成途径主要有两种，一种是化学合成法，另一种是生物合成法。在化学合成法中，其合成具有操作复杂，时间周期长，产率不高的缺点；半合成中，多以大豆苷元等为原料，虽然合成步骤简化，产率也有所提高，但产物为消旋体雌马酚，而R-雌马酚的生物活性远远小于S-雌马酚。在生物合成法中，可以将大豆苷元全部代谢为S-雌马酚，转化率高，但目前存在的方法为扩大目标菌群后与大豆苷元厌氧共培养，具有成本高、菌种无法回收、不适合大生产的缺点。
发明内容
本发明目的是提供一种细菌固定化方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种细菌固定化方法，包括步骤：
(1)菌种的富集：在无菌条件下将LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株接种于液体培养基上进行培养，培养结束后，离心收集菌体，洗涤，保存；
(2)菌种的固定化：将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤；
(3)装柱与活化：将所述固定化的细菌球装填到层析柱，获得固定化细菌柱，用溶液进行活化，制成微生物反应器。
进一步的，步骤(1)中所述液体培养基的成份为蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠；所述液体培养基的pH为7.2±0.2；所述培养为在37℃下厌氧培养24-48h；所述离心的速度为10000r/min，时间为10min；所述洗涤为用磷酸盐缓冲液洗涤3次；所述保存温度为4℃。
进一步的，步骤(2)中所述载体微球为海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、卡拉胶或明胶-戊二醛中的任意一种或多种组合，所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株分别包埋到多个载体微球上，或者所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株同时包埋到同一个载体微球上。
进一步的，步骤(2)中所述将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤具体为：将2％的海藻酸钠浸泡24h后加热溶解，取2mL的菌液稀释2倍，两者混合均匀，用滴加装置将其慢慢滴入5％CaCl2溶液，并用玻璃棒不断搅拌，冰浴条件下交联3-6h，获得固定化的细菌球，过滤后，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤所述固定化的细菌球2-3次，放入冰箱4℃保存。
进一步的，步骤(3)中所述固定化的细菌球为LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918细菌球中的任意一种或者多种组合；所述层析柱为玻璃柱、塑料柱或不锈钢柱中的任意一种；所述溶液为葡萄糖溶液或培养液；所述活化时间为5～30h。
进一步的，所述培养液为厌氧培养液，其配方为：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、刃天青、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸、碳酸钠、牛肉浸粉、蛋白胨、琼脂，所述厌氧培养液的pH为7.5-8.0。
本发明的另一技术方案是：一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用。
进一步的，将待降解反应物溶解于缓冲液中，然后输送到所述微生物反应器上，细菌将所述待降解反应物降解，生成产物，收集流出液。
进一步的，所述待降解反应物为大豆异黄酮、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素苷元中的任意一种或几种；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和Tris三羟甲基甲烷缓冲液，所述缓冲液的pH范围为6.4～7.5。
本发明提供了一种细菌固定化方法及应用，优点为：解决了现有S-雌马酚生产工艺复杂、效率低的的难题，具有投资少、转化效率高、适合大生产的特点。
附图说明
图1为大豆苷元代谢生成S-雌马酚的路线图；
图2为大豆苷元与S-雌马酚标准品的HPLC图；
图3为大豆苷元被转化为S-雌马酚的HPLC图。
具体实施方式
本发明的技术方案是：
(1)菌种的富集：在无菌条件下将LH-52、TM-30、Eggerthella YY7918菌株接种于液体培养基，进行培养，培养结束后，离心收集菌体；
(2)菌种的固定化：将富集后的细菌用载体微球固定化，无菌水洗涤备用。菌种固定化微球可以为海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、卡拉胶、明胶-戊二醛中的一种或多种组合，优选为壳聚糖。LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株分别固定化到载体微球上，也可以同时固定到一种微球上。
(3)装柱与活化：将固定化的细菌装柱，用溶液进行活化。柱子可以为任意规格的玻璃柱、塑料柱、不锈钢，优选为玻璃柱。柱子可以为装填LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918固定化微球中的一种或者几种组合，优选为三种固定化细菌微球组合。溶液可以为；葡萄糖溶液或培养液，优选为葡萄糖溶液。活化时间5～30h。
(4)生产：将溶解有待降解反应物溶液输送到固定化细菌柱上，细菌将待降解反应物降解，生成产物，收集流出液。溶液可以为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和Tris(三羟甲基甲烷)缓冲液。其pH范围为6.4～7.5。待降解反应物为大豆异黄酮、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素苷元其中一种或几种组合，优选为大豆异黄酮。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本发明一种细菌固定化方法的技术方案如下：
一、海藻酸钠固定法：
1.菌种的富集
在超净工作台中将LH-52、TM-30、Eggerthella YY7918菌株分别接种于已提前高压蒸汽灭菌的液体培养基(蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，pH7.2±0.2)，于37℃下在恒温培养箱中厌氧培养24-48h；培养结束后10000r/min离心10min收集菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，4℃低温保存；
2.菌种的固定化
将2％的海藻酸钠浸泡24h后加热溶解，取2mL的菌液稀释2倍，两者混合均匀，用滴加装置将其慢慢滴入5％CaCl2溶液(凝胶化剂)，并用玻璃棒不断搅拌，冰浴条件下交联3-6h，过滤后，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤小球2-3次。放入冰箱4℃保存。
3.装柱与活化
将固定化的细菌倒入玻璃柱(h＝800mm，d＝50mm)，倒入厌氧培养液(磷酸氢二钾0.293g/L，磷酸二氢钾0.176g/L，氯化钠0.443g/L，硫酸铵0.45g/L，氯化钙0.045g/L，硫酸镁0.094g/L，刃天青0.001g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，L-抗坏血酸0.5g/L，碳酸钠4.0g/L，牛肉浸粉1.0g/L，蛋白胨1.0g/L，琼脂1.0g/L，pH＝7.5-8.0)，活化12-24h。
4.洗涤
将大豆苷元10g溶解于2000mL pH7.2的磷酸盐缓冲液(2mL DMSO助溶)，2mL/min流过玻璃柱，收集流出液。浓缩为500mL后，乙酸乙酯萃取三次，萃取液回收后液相监测。其原理请参阅图1，图1为大豆苷元代谢生成S-雌马酚的路线图。如图1所示，大豆苷元先被三种菌还原成二氢大豆苷元或者脱氢雌马酚(Phenoxodiol)，再被还原成S-雌马酚。
5.HPLC条件
流动相为20％乙腈：80％水，流速为1mL/min，进样量20微升，检测波长280nm，色谱柱ODS C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，柱温25℃。请参阅图2和图3，图2为大豆苷元与S-雌马酚标准品的HPLC图；图3为大豆苷元被转化为S-雌马酚的HPLC图。如图2所示，大豆苷元保留时间为7.1min，S-雌马酚保留时间为13.6min。如图3所示，根据保留时间可以判断7.1min的峰为大豆苷元，13.5min的峰为代谢生成的S-雌马酚。
实施例2
聚乙烯醇固定法：分别取2mL的菌液稀释两倍后，将其加入50mL含量为8％PVA溶液中，混合均匀后，采用滴加装置将其液体滴加到上层为石蜡下层为水的烧杯中。然后在-20℃条件下冷冻2-8h后过滤，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤小球2-3次。放入冰箱4℃保存。
实施例3
聚丙烯酰胺固定法：称取0.3g海藻酸钠、3g丙烯酰胺单体、0.225gN，N-亚甲基双丙烯酰胺，去离子水溶解。加入0.07mL四甲基乙二胺(TEMED)，冷却后加菌悬液，稀释至30mL，最终浓度为海藻酸钠1％、丙烯酰胺单体10％、N，N-亚甲基双丙烯酰胺0.75％、TEMED0.25％。采用滴加装置将滴入含0.5％TEMED、5％CaCl2、1％K2S2O3的混合溶液中。过滤后，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤小球2-3次。放入冰箱4℃保存。
实施例4
壳聚糖包埋法：在0.8％的壳聚糖溶液中加入1％的冰乙酸，溶解壳聚糖，然后加入氢氧化钠溶液调节pH至7.0。取2mL菌悬液稀释2倍，将二者混合均匀，采用滴加装置将混合溶液滴加入2％的焦磷酸钠溶液中，成球后，固化10-15min，再放入稀释后的2％的焦磷酸钠溶液中继续固化30-40min。过滤后保存。
实施例5
固定化细菌
(1)用壳聚糖固定LH-52菌株，装柱后活化12h。
(2)固定TM-30菌株，装柱后活化16h。
(3)固定EggerthellaYY7918菌株，装柱后活化24h。
装柱方式
(1)将LH-52和TM-30两种固定化微球按1：1的比例混合后，装柱后活化24h。
(2)将TM-30和EggerthellaYY7918两种固定化微球按1：1的比例混合后，装柱后活化24h。
(3)将上述三种菌珠的固定化微球按1：1：1的比例混合后，装柱后活化24h。
大豆苷元2g溶解于400mL pH 7.2磷酸盐缓冲液(0.4mL DMSO助溶)，2mL/min流过玻璃柱，收集流出液。综上所述，本发明所述的一种细菌固定化方法及应用，提高了细菌的利用率，而且可以回收重复使用；通过装入层析柱中，可以用于连续生产。同时，所得到的菌种固定化球生产成本低，菌体附着牢固，菌种具有较高的活性和较长的使用寿命，可高效生产S-雌马酚。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种细菌固定化方法，其特征在于，包括步骤：
(1)菌种的富集：在无菌条件下将LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株接种于液体培养基上进行培养，培养结束后，离心收集菌体，洗涤，保存；
(2)菌种的固定化：将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤；
(3)装柱与活化：将所述固定化的细菌球装填到层析柱，获得固定化细菌柱，用溶液进行活化，制成微生物反应器。
2.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：步骤(1)中所述液体培养基的成份为蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠；所述液体培养基的pH为7.2±0.2；所述培养为在37℃下厌氧培养24-48h；所述离心的速度为10000r/min，时间为10min；所述洗涤为用磷酸盐缓冲液洗涤3次；所述保存温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：步骤(2)中所述载体微球为海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、卡拉胶或明胶-戊二醛中的任意一种或多种组合，所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株分别包埋到多个载体微球上，或者所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株同时包埋到同一个载体微球上。
4.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于，步骤(2)中所述将所述菌体包埋到载体微球上，获得固定化的细菌球，用无菌水洗涤具体为：将2％的海藻酸钠浸泡24h后加热溶解，取2mL的菌液稀释2倍，两者混合均匀，用滴加装置将其慢慢滴入5％CaCl2溶液，并用玻璃棒不断搅拌，冰浴条件下交联3-6h，获得固定化的细菌球，过滤后，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤所述固定化的细菌球2-3次，放入冰箱4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：步骤(3)中所述固定化的细菌球为LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918细菌球中的任意一种或者多种组合；所述层析柱为玻璃柱、塑料柱或不锈钢柱中的任意一种；所述溶液为葡萄糖溶液或培养液；所述活化时间为5～30h。
6.根据权利要求5所述的一种细菌固定化方法，其特征在于：所述培养液为厌氧培养液，其配方为：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、氯化钙、硫酸镁、刃天青、L-半胱氨酸、L-抗坏血酸、碳酸钠、牛肉浸粉、蛋白胨、琼脂，所述厌氧培养液的pH为7.5-8.0。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用，其特征在于，包括步骤：将待降解反应物溶解于缓冲液中，然后输送到所述微生物反应器上，细菌将所述待降解反应物降解，生成产物，收集流出液。
9.根据权利要求8所述的一种细菌固定化方法在制备雌马酚中的应用，其特征在于：所述待降解反应物为大豆异黄酮、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素苷元中的任意一种或几种；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和Tris三羟甲基甲烷缓冲液，所述缓冲液的pH范围为6.4～7.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191018 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |