ES2858597T3 - Método para medir la capacidad de producir equol - Google Patents

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Abstract

Un método para medir la capacidad de producir equol de un sujeto de prueba, donde se detecta un gen de la enzima convertidora de THD-equol procedente de bacterias intestinales del sujeto de prueba utilizando tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en los siguientes a) a c): a) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases; b) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 4, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases; y c) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 o 7, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para medir la capacidad de producir equol
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para medir la capacidad de producir equol de un sujeto de prueba. Antecedentes de la técnica
La isoflavona, que está contenida en un alimento de soja en gran cantidad, es conocida como un componente funcional que tiene los efectos de aliviar un trastorno climatérico tal como el malestar general, de prevenir la osteoporosis, de prevenir la hiperlipidemia y la arteriosclerosis, y de prevenir el cáncer de mama y el cáncer de próstata. Estudios recientes esclarecieron que las bacterias intestinales internas metabolizan la daidzeína, que es una de las isoflavonas, a equol, que tiene una acción estrogénica y un efecto antioxidante más fuertes (véase la Fig. 1). Por consiguiente, se ha señalado al equol como un principio activo principal que realiza los efectos anteriores en el cuerpo.
Se ha informado que la producción de equol a partir de daidzeína en el cuerpo no se produce por igual en todos los seres humanos, la capacidad de producir equol varía entre los individuos, y del 30 al 50 % de los seres humanos tiene la capacidad de producir equol. Por tanto, se han llevado a cabo estudios intensos sobre las bacterias entéricas con capacidad para producir equol (una bacteria productora de equol), y Bacteroides ovatus, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus, Lactococcus garvieae, Slackia spp. cepa TM-30, Bifidobacterium adolescentis cepa TM-1, Bifidobacterium breve JCM 1273, Proprionobacterium freudenreichii, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius, SNU-Julong732, la bacteria grampositiva do03 y Slackia sp.YIT 11861 (FERM BP-11231) se han informado como bacterias productoras de equol (Bibliografía de patentes 1).
Como se ha descrito anteriormente, el equol tiene diversas actividades y se espera que tenga efectos preventivos sobre enfermedades dependientes de hormonas sexuales tales como el cáncer de mama y de próstata. Por tanto, es importante determinar si un individuo tiene la capacidad de producir equol o no.
En la situación actual, los métodos para determinar si un sujeto de prueba tiene capacidad para producir equol o no incluyen un método de detección y de medición en sangre u orina de equol metabolizado a partir de daidzeína por una bacteria productora de equol. Un inconveniente del método es que la cantidad de daidzeína en sangre u orina y, además, la cantidad de equol, varían dependiendo de la cantidad de soja que se ingiera antes de la extracción de sangre u orina. En concreto, cuando un sujeto de prueba no ingiere soja, el equol no se detecta en la sangre o la orina. Por tanto, existe el riesgo de que se pueda juzgar erróneamente que tal sujeto de prueba no tiene capacidad para producir equol, mientras que el sujeto de prueba tiene una bacteria productora de equol.
Por otro lado, puede ser posible un método para determinar si un sujeto de prueba tiene capacidad para producir equol o no mediante la presencia o ausencia de una bacteria productora de equol. Sin embargo, no se ha establecido un método para detectar con precisión la presencia de todas las bacterias productoras de equol, y no se ha informado sobre un método de este tipo.
La bibliografía no de patente 1 informa sobre la identificación de un sistema enzimático para la conversión de daidzeína a equol en Slackia sp. cepa NATTS. La bibliografía no de patente 2 describe el papel de las bacterias intestinales en el metabolismo de la isoflavona natural daidzina a equol. La bibliografía no de patente 3 informa sobre la identificación y expresión de genes implicados en la conversión de daidzeína y genisteína por la bacteria formadora de equol Slackia isoflavoniconvertens. La Bibliografía no de patentes 4 informa sobre el aislamiento y caracterización de la bacteria productora de equol Slackia sp. cepa NATTS.
Listado de citas
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patentes 1: Documento WO 2010/098103 A
Bibliografía no de patentes
Bibliografía no de patentes 1: TSUJI ETAL., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 78, n.° 4, páginas 1228 - 1236, 2012
Bibliografía no de patentes 2: FATEMEH RAFII, METABOLITES, vol. 5, n.° 1, páginas 56 - 73, 2015 Bibliografía no de patentes 3: SCHRODER ET AL., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 79, n.° 11, páginas 3494 - 3502, 2013
Bibliografía no de patentes 4: TSUJI ET AL., ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, vol. 192, n.° 4, páginas 279 - 287, 2010
Sumario de la invención
Problema técnico
La presente invención se refiere a la proporción de un método para medir si un sujeto de prueba tiene o no capacidad para producir equol.
Solución al problema
Los presentes inventores, después de realizar estudios en vista de los problemas anteriores, han descubierto que la detección de un gen de la enzima convertidora de tetrahidrodaidzeína (THD)-equol procedente de bacterias intestinales de un sujeto de prueba utilizando tres tipos específicos de conjuntos de cebadores puede utilizarse para una determinación altamente sensible de si el sujeto de prueba tiene capacidad de producir equol o no.
Efectos de la invención
El método de la presente invención puede proporcionar una medición altamente sensible de si un sujeto de prueba tiene una bacteria productora de equol o no, es decir, de la capacidad de producir equol del sujeto de prueba independientemente de la ingestión de un alimento que contenga daidzeína tal como la soja.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un esquema que muestra una ruta de producción de equol en el metabolismo de la daidzeína.
La Fig. 2 proporciona gráficas (curvas patrón) que muestran las propiedades cuantitativas de los respectivos cebadores. Izquierda: cebadores para la detección del complejo génico de tipo A (SL-F2/SL-R2), Derecha: cebadores para la detección del complejo génico de tipo B (Eght-F2/Egkm-R1)
La Fig. 3 proporciona gráficas (curvas patrón) que muestran las propiedades cuantitativas de los respectivos cebadores. Izquierda: cebadores para la detección del complejo génico de tipo C-1 (Adht-F1/Adht-R1), Derecha: cebadores para la detección del complejo génico de tipo C-2 (Adht-F1/Adkm-R1)
Descripción de realizaciones
De acuerdo con un método para medir la capacidad de producir equol de un sujeto de prueba de la presente invención, se detecta un gen de la enzima convertidora de THD-equol procedente de bacterias intestinales de un sujeto de prueba utilizando tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en los siguientes a) a c). La detección incluye detección cualitativa y cuantitativa. La detección cuantitativa incluye la cuantificación del número de genes (número de copias) de la enzima convertidora THD-equol.
a) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ Id NO: 2, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases
b) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 4, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases
c) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 o 7, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases
Cualquiera de los tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en a) a c) es una pareja de cebadores para la amplificación de un gen (en lo sucesivo en el presente documento denominado "gen de la enzima convertidora de THD-equol") que codifica la enzima convertidora de equol E3 (en lo sucesivo en el presente documento denominada "enzima convertidora de THD-equol"), en referencia a la conversión de c/s/trans-tetrahidrodaidzeína (THD) a equol en el metabolismo de la daidzeína (véase la Fig. 1).
Las enzimas convertidoras de THD-equol incluyen algunos homólogos y, por tanto, los genes de la enzima convertidora de THD-equol incluyen algunas secuencias distintas. Los presentes inventores han descubierto que los genes de la enzima convertidora de THD-equol pueden clasificarse en tres tipos (es decir, complejos génicos, con referencia al complejo génico de tipo A, el complejo génico de tipo B y el complejo génico de tipo C, como se describe a continuación) sobre la base de la diferencia en la homología de las secuencias de bases. La homología entre las secuencias de bases de los genes dentro del mismo complejo génico es aproximadamente del 95 al 99 % y la homología entre las secuencias de bases de genes de distintos complejos génicos es aproximadamente del 70 al 80 %. Además, los presentes inventores han producido un conjunto de cebadores con respecto a cada uno de los tipos de genes.
Un primer conjunto de cebadores representado por a) es una pareja de cebadores que puede amplificar un complejo génico de la enzima convertidora de THD-equol (también denominado "complejo génico de tipo A") producido por, por ejemplo, Slackia sp. cepa YIT 11861, Slackia isoflavoniconvertens cepa HE8 y Slackia sp. cepa MC6. En concreto, el conjunto de cebadores comprende un primer cebador que es un oligonucleótido que incluye una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 (5'-CCCGCGCATTTGTGGAGAACT-3' (SL-F2)) y un segundo cebador que es un oligonucleótido que incluye una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 2 (5'-CGTTCCGATATCGCCGAGGTTT-3' (SL-R2)).
Un primer conjunto de cebadores representado por b) es una pareja de cebadores que puede amplificar un complejo génico de la enzima convertidora de THD-equol (también denominado "complejo génico de tipo B") producido por, por ejemplo, Slackia equolifaciens cepa DZE, Lactococcus garvieae cepa 20-92 y Eggerthella sp. cepa YY 7918. En concreto, el conjunto de cebadores comprende un primer cebador que es un oligonucleótido que incluye una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 (5'-CGCTGCCTTCGAGTCCTCTA-3' (Eght-F2)) y un segundo cebador que es un oligonucleótido que incluye una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 4 (5'-GGTGGAGGTGAAGATGTCG-3' (Egkm-R1)).
Una primera pareja de cebadores representado por c) es una pareja de cebadores que puede amplificar un complejo génico de la enzima convertidora de THD-equol (también denominado "complejo génico de tipo C") producido por, por ejemplo, Adlercreutzia equolifaciens cepa DSM 19450T y Asaccarobactor celtus cepa DO-03. En concreto, la pareja de cebadores comprende un primer cebador que es un oligonucleótido que incluye una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 (5'-CGTTCGATACTGAGTACGACCTG-3' (Adht-F1)) y un segundo cebador que es un oligonucleótido que incluye una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 (5'-ATCCTTGAg GAAATCGATGGTA-3' (Adht-R1)) o una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 7 (5'-AGTTTGCGCGATAGTGGCTGTA-3' (Adkm-R1)).
El primer cebador se puede utilizar como cebador directo para una reacción de amplificación de ácido nucleico tal como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y el segundo cebador se puede utilizar como cebador inverso que se acopla con el primer cebador en la reacción de amplificación de ácido nucleico.
El conjunto de cebadores de la presente invención incluye una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a las secuencias de bases representadas por la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, que pueden amplificar el complejo génico de tipo A, una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a las secuencias de bases representadas por la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, que pueden amplificar el complejo génico de tipo B, y una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a las secuencias de bases representadas por la SEQ Id NO: 5 y la SEQ ID NO: 6 o 7, que pueden amplificar el complejo génico de tipo C.
En la presente invención, los oligonucleótidos que comprenden una secuencia de bases con 1 o 2 deleciones, sustituciones, adiciones o inserciones en una secuencia de bases representada por las SEQ ID NO: 1 a 7, y las secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases, o una secuencia de bases que tenga el 90 % o más, o preferentemente el 95 % o más de identidad con las secuencias de bases de las SEQ ID NO: 1 a 7, o las secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases, donde dichos oligonucleótidos tienen respectivamente funciones equivalentes a los oligonucleótidos que comprenden las secuencias de bases representadas por las SEQ ID NO: 1 a 7, o las secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases como cebadores, se tratan de la misma manera que los oligonucleótidos que tienen las secuencias de bases representadas por las SEQ ID NO: 1 a 7.
Un oligonucleótido de la presente invención puede sintetizarse mediante un método conocido públicamente para la síntesis de un oligonucleótido, tal como un método de fosfotriéster y un método de fosfodiéster, utilizando un sintetizador de ADN automatizado de uso general (por ejemplo, sintetizador de ADN Modelo 394 fabricado por Applied Biosystems).
La detección de un gen de la enzima convertidora de THD-equol utilizando los tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en a) a c) puede lograrse mediante una etapa de llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando ADN extraído de una muestra obtenida de un sujeto de prueba como un molde y utilizando el conjunto de cebadores anterior, y una etapa de detección de un producto de amplificación obtenido mediante la reacción de amplificación de ácido nucleico.
La muestra obtenida de un sujeto de prueba para la detección de un gen de la enzima convertidora de THD-equol incluye una muestra que contiene bacterias intestinales del sujeto de prueba, tal como heces y contenido del intestino. Preferentemente se utilizan heces debido a que pueden obtenerse fácilmente.
El ADN puede extraerse a partir de heces mediante un procedimiento similar al de un método convencional para la preparación de ADN genómico. Por ejemplo, el ADN puede obtenerse de la totalidad o de parte de las muestras obtenidas de un sujeto de prueba mediante cualquiera de los métodos conocidos públicamente, opcionalmente, en combinación con un pretratamiento por extracción, separación o purificación, según sea necesario. En concreto, el ADN puede obtenerse mediante pretratamiento utilizando un método conocido públicamente, tal como filtración, centrifugación o cromatografía, y a continuación extrayendo el ADN utilizando métodos de uso general tales como "un método de trituración física que incluye agitación en presencia de, por ejemplo, perlas de vidrio", "el método de CTAB", "un método de fenol cloroformo (método de fC)", "un método de perlas magnéticas" y "un método de columna de sílice", o utilizando una combinación de los métodos de uso general. Para lograr una alta sensibilidad de detección mediante PCR, se prefiere obtener ADN en altas concentraciones. Por otro lado, dado que en una muestra obtenida de un sujeto de prueba tal como un extracto de ácido nucleico de heces coexiste un material inhibidor de la PCR, preferentemente los materiales inhibidores se eliminan tanto como sea posible para obtener ADN de alta pureza. Para este fin, se prefiere específicamente utilizar el kit FastDNA SPIN para heces (MP Biomedicals), que puede extraer ADN en altas concentraciones y con alta pureza.
Una técnica de amplificación de ácidos nucleicos incluye, pero no se limita específicamente a, un método conocido públicamente que utiliza un principio de un método de PCR. Los ejemplos de la técnica de amplificación de ácidos nucleicos incluyen un método de PCR, el método LAMP (forma siglada de Loop-mediated isothermal AMPlification, amplificación isotérmica mediada por bucle), el método ICAN (forma siglada de Isothermal and Chimeric Primerinitiated Amplification of Nucleic acids, amplificación isotérmica de ácidos nucleicos iniciada por cebadores quiméricos), el método RCA (forma siglada de Rolling Circle Amplification, amplificación por círculo rodante), método LCR (forma siglada de Ligase Chain Reaction, reacción en cadena de la ligasa) y el método SDA (forma siglada de Strand Displacement Amplification, amplificación con desplazamiento de hebra).
Un producto de amplificación de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos puede detectarse utilizando un método conocido públicamente para reconocer específicamente el producto de amplificación. Por ejemplo, el ADN obtenido puede someterse a electroforesis para detectar específicamente un gen de la enzima convertidora de THD-equol como una banda electroforética. El gen de la enzima convertidora de THD-equol también puede detectarse específicamente midiendo la absorbancia. Además, un dNTP incorporado en el curso de las reacciones de amplificación puede reaccionar con una sustancia de marcaje, tal como un radioisótopo, una sustancia fluorescente o una sustancia luminiscente, y luego puede detectarse la sustancia de marcaje. Un método para observar el producto de amplificación con el dNTP marcado incorporado puede ser cualquier método en la técnica conocido públicamente para la detección de las sustancias de marcaje anteriores. Por ejemplo, cuando se utiliza un radioisótopo como sustancia de marcaje, la radioactividad se puede medir utilizando, por ejemplo, un contador de centelleo líquido o un contador y. Cuando se utiliza una sustancia fluorescente como sustancia de marcaje, la fluorescencia puede detectarse utilizando, por ejemplo, un microscopio fluorescente o un lector de placas de fluorescencia.
En la presente invención, se utiliza preferentemente como técnica de amplificación de ácidos nucleicos la PCR en tiempo real, en la que se controla y analiza una cantidad de ácidos nucleicos amplificados en la PCR en tiempo real, debido a que proporciona un análisis rápido y cuantitativo. Los ejemplos de la pCr en tiempo real utilizada incluyen métodos generalmente utilizados en la técnica, tales como un método con sonda TaqMan, un método con intercalante y un método cíclico con sonda.
Las condiciones para la PCR no están limitadas específicamente y se pueden establecer las condiciones óptimas para cada uno de los sistemas de PCR. Los ejemplos de las condiciones para la PCR incluyen las siguientes condiciones:
1) Desnaturalización térmica de ADN bicatenario para proporcionar ADN monocatenario: calentamiento generalmente a aproximadamente 93 a 95 °C, y generalmente durante aproximadamente 10 segundos a 5 minutos;
2) Apareamiento: calentamiento generalmente a aproximadamente 50 a 60 °C, y generalmente durante aproximadamente 10 segundos a 1 minutos; y
3) reacción de elongación del ADN: calentamiento generalmente a aproximadamente 70 a 74 °C, y generalmente durante aproximadamente 30 segundos a 5 minutos.
La reacción de apareamiento y elongación del ADN se puede llevar a cabo simultáneamente en lugar de llevarlas a cabo por separado.
Un gen de la enzima convertidora de THD-equol deseado puede amplificarse hasta un nivel detectable llevando a cabo las reacciones 1) a 3) anteriores generalmente durante aproximadamente 30 a 50 ciclos.
Dicha serie de operaciones de PCR puede llevarse a cabo utilizando un kit de PCR o un sistema de PCR disponible en el mercado de acuerdo con sus instrucciones. Se puede llevar a cabo una PCR en tiempo real utilizando un sistema especialmente diseñado para PCR en tiempo real que tenga un termociclador con un espectrofluorómetro integrado, tal como el sistema de detección de secuencias a Bi PRISM 7900 HT (Applied Biosystems).
Para medir una cantidad de ADN, se somete a PCR una muestra que contiene una solución patrón de ADN diluida en serie con una concentración de ADN conocida. A continuación, se genera una curva patrón representando la cantidad inicial de ADN (a lo largo del eje de abscisas) frente los números de ciclo (ciclo umbral: valor Ct ) para lograr una determinada cantidad del producto de amplificación por PCR utilizando el ADN anterior como molde (a lo largo del eje de ordenadas). También se somete a la reacción de PCR en las mismas condiciones una muestra con una concentración de ADN desconocida, para proporcionar un valor Ct . La cantidad del ADN deseado en la muestra se puede obtener a partir del valor Ct de la muestra y de la curva patrón.
Se pueden proporcionar los tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en a) a c) de la presente invención como un kit para una medición más conveniente de la capacidad de producir equol de un sujeto de prueba. Como kit de la presente invención se puede utilizar cualquier kit siempre que incluya los tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en a) a c). El kit de la presente invención puede incluir, según sea necesario, un reactivo para PCR tal como un reactivo para extracción de ADN, un tampón para PCR o una ADN polimerasa, una solución de ADN que contiene una región de amplificación por PCR que puede ser un control positivo para la reacción, un reactivo para la detección, tal como un reactivo de tinción o un gel para electroforesis, y unas instrucciones que describen los métodos de uso del kit. El reactivo que puede incluirse en el kit puede ser una solución o un material liofilizado. Por consiguiente, mediante un método de la presente invención puede lograrse la detección exhaustiva de los genes de la enzima convertidora de THD-equol procedentes de bacterias intestinales de un sujeto de prueba. Esto puede conducir a una determinación altamente satisfactoria de si un sujeto de prueba es productor de equol o no.
Ejemplos
Ejemplo 1: Diseño de cebadores dirigidos al gen de la enzima convertidora de THD-equol de bacterias productoras de equol procedente de seres humanos
En la Fig. 1 se muestra una ruta de producción de equol en el metabolismo de la daidzeína. Los cebadores dirigidos a cada uno de los tres tipos de genes de la enzima convertidora de equo1 se produjeron como cebadores capaces de detectar una bacteria productora de equol.
(1) Materiales
(a) Cepas utilizadas
Se utilizaron las cepas que se muestran en la Tabla 1, almacenadas en Yakult Honsha Co., Ltd., INSTITUTO CENTRAL. Los números bacterianos iniciales de cada cepa bacteriana se ajustaron a aproximadamente 1 x 105 células.
Las condiciones de cultivo de cada cepa se muestran en la Tabla 1. A continuación, se describen los detalles de las condiciones de cultivo A a C.
Condición A: Las bacterias se cultivaron utilizando medio de agar GAM Modificado (Nissui) complementado con glucosa al 1 % a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas. A continuación, las colonias del medio de cultivo de agar se recuperaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui).
Condición B: Las bacterias se cultivaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui) complementado con glucosa al 0,5 %, celobiosa al 0,1 %, maltosa al 0,1 % y almidón al 0,1 % a 37 °C durante 48 horas en condiciones anaeróbicas.
Condición C: Las bacterias se cultivaron utilizando caldo Anaerobio de Wilkins-Chalgren a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas.
El número de bacterias en cada una de las suspensiones bacterianas se determinó mediante el método DAPI (J. Microbiol. Methods 37, 215-221) y el caldo de cultivo de cada bacteria se preparó basándose en el número de bacterias para lograr 109 células/ml. Los caldos de cultivo obtenidos se utilizaron como caldos de cultivo bacteriano puro de las respectivas cepas.
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(2) Métodos
Antes de producir los cebadores, se llevó a cabo un análisis filogenético molecular utilizando el programa informático Clustal X basándose en la información sobre los genes de la enzima convertidora de THD-equol contenidos en las bacterias productoras de equol mostradas en la Tabla 2, y a continuación se identificaron tres tipos de genes de la enzima convertidora de THD-equol. Los genes de la enzima convertidora de THD-equol se clasificaron respectivamente como complejo génico de tipo A, complejo génico de tipo B y complejo génico de tipo C (los tipos de genes de la enzima convertidora de THD-equol de las respectivas cepas se muestran en la Tabla 2). La cepa MC6 en las bacterias productoras de equol que se muestra en la Tabla 1 es una nueva bacteria aislada e identificada por los presentes inventores.
Respecto a las secuencias de genes de la enzima convertidora de THD-equol contenidas en las 8 cepas de bacterias productoras de equol que se muestran en la Tabla 2, se alinearon las secuencias de los genes pertenecientes a cada uno de los tipos utilizando el programa informático Clustal X y se diseñaron los cebadores que se dirigen a cada tipo de genes basándose en la secuencia específica obtenida.
En un intento de diseñar cebadores alineando las secuencias de los genes de la enzima convertidora de THD-equol contenidas en las 8 cepas que se muestran en la Tabla 2 en su conjunto, sin dividirlas en tipos, utilizando el programa informático Clustal X, no se pudo descubrir una secuencia específica con alta homología de secuencia génica y, por tanto, no se produjo ningún cebador. Por consiguiente, se descubrió que el descubrimiento de la existencia de los tres tipos era importante para producir cebadores.
T l 2
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(3) Resultados
Las secuencias de los cebadores diseñados se muestran en la Tabla 3. En los cebadores que se dirigen al complejo génico de tipo C, los cebadores que se dirigen al complejo génico de tipo C-1 se obtuvieron alineando secuencias de genes de la enzima convertidora de THD-equol contenidos en las cepas bacterianas números 4 y 5 de la Tabla 2, utilizando el programa informático Clustal X y diseñando el cebador basándose en la secuencia específica obtenida. Los cebadores que se dirigen al complejo génico de tipo C-2 se obtuvieron alineando secuencias de genes de la enzima convertidora de THD-equol contenidos en las cepas bacterianas números 4 a 6 de la Tabla 2, utilizando el programa informático Clustal X y diseñando el cebador basándose en la secuencia específica obtenida.
T l
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Ejemplo de Prueba 1: Especificidad de los cebadores dirigidos al gen de la enzima convertidora de THD-equol (1) Materiales
(a) Cepas utilizadas
Además de las cepas que se muestran en la Tabla 1, se utilizaron las cepas que se muestran en la Tabla 4, almacenadas en Yakult Honsha Co., Ltd., INSTITUTO CENTRAL. Los números bacterianos iniciales de cada cepa bacteriana se ajustaron a aproximadamente 1 x 105 células.
Las condiciones de cultivo de cada cepa se muestran en la Tabla 4. A continuación, se describen los detalles de las condiciones de cultivo A a F.
Condición A: Las bacterias se cultivaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui) complementado con glucosa al 1 % a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas.
Condición B: Las bacterias se cultivaron utilizando Caldo GAM Modificado Glucosa (Nissui) complementado con glucosa al 0,5 % a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas.
Condición C: Las bacterias se cultivaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui) a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas.
Condición D: Las bacterias se cultivaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui) complementado con Na-Lactato al 1,5 % a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas.
Condición E: Las bacterias se cultivaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui) complementado con glucosa al 0,5 %, celobiosa al 0,1 %, maltosa al 0,1 % y almidón al 0,1 % a 37 °C durante 48 horas en condiciones anaeróbicas.
Condición F: Las bacterias se cultivaron utilizando medio de agar GAM Modificado (Nissui) complementado con glucosa al 1 % a 37 °C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas. A continuación, las colonias del medio de cultivo de agar se recuperaron utilizando Caldo GAM Modificado (Nissui).
El número de bacterias en cada una de las suspensiones bacterianas se determinó mediante el método de DAPI y se preparó el caldo de cultivo de cada bacteria basándose en los números de bacterias para lograr 109 células/ml. Los caldos de cultivo obtenidos se utilizaron como caldos de cultivo bacteriano puro de las respectivas cepas.
Tabla 4
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(2) Métodos
Se realizaron estudios de especificidad en las bacterias intestinales más dominantes (N.° 10 a 21), en bacterias pertenecientes a las Coriobacteriaceae (N.° 22 a 37) y bacterias productoras de equol obtenidas de ser humano (N.° 1 a 7), que se muestran en la Tabla 1 y la Tabla. 4.
La especificidad de los cebadores se estudió extrayendo ADN del caldo de cultivo bacteriano puro de cada cepa utilizando un método conocido públicamente (Appl. Environ. Microbiol. 70: 167-73) y a continuación realizando pCr cuantitativa.
A continuación, se proporciona un método para generar una curva patrón utilizada en PCR cuantitativa. Se utilizó Slackia sp. cepa YIT 11861 para generar una curva patrón de cebadores dirigidos al complejo génico de tipo A. De manera similar, se utilizó Slackia equolifaciens DZE para generar la de los cebadores dirigidos al complejo génico de tipo B y se utilizó Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450T para generar la de los cebadores dirigidos a los complejos génicos de tipo C-1 y -2. La PCR se realizó con los cebadores que se muestran en la Tabla 3, utilizando como molde ADN extraído de un caldo de cultivo bacteriano puro de cada cepa. Los productos de amplificación se purificaron utilizando el kit PCR Product Purification (Roche) y se midió la absorbancia (A. de 280 nm) del ADN utilizando el espectrofotómetro Life Science UV/Vis d U730 (BeCKMAN COULTER) para calcular el peso de ADN a partir del valor de la absorbancia. El número de copias se calculó a partir del peso del ADN y la cantidad de moléculas por 1 mol del producto de amplificación. Los a Dn purificados se diluyeron con tampón t E (pH 8,0) para lograr un número de copias de 2 x 108 números de copias/ml.
Se utilizó una solución de ADN con un número de copias de 2 x 108 número de copias/ml como una solución sin diluir y se diluyó mediante una dilución en serie con factor 10 utilizando tampón TE (pH 8,0). A partir de la solución diluida, se tomaron muestras de 5 pl de la solución de ADN diluida para lograr un número de copias de 10° a 105 por reacción y se sometieron a PCR cuantitativa. Las condiciones para la PCR cuantitativa se proporcionan a continuación. Para la PCR cuantitativa se utilizó Ampdirect plus (SHIMADZU). La composición de una solución de reacción fue de 10 pl de Ampdirect plus, 0,08 pl de sYb R Green 1 (LONZA) diluido 300 veces, 0,4 pl de colorante de referencia ROX (Invitrogen), 0,08 pl de cebador 150 pM y 0,08 pl de cebador 2 50 pM, 0,08 pl de rTaq (TaKaRa Bio.), 0,1 pl de anticuerpo de inicio Taq (Clontech) y 5 pl de la solución de ADN diluida anterior. A continuación, se ajustó una cantidad de la solución de reacción a 20 pl con ASN. La PCR se realizó en las siguientes condiciones: 45 ciclos de 94 °C durante 5 minutos, 94 °C durante 20 segundos, 60 °C durante 20 segundos y 72 °C durante 50 segundos. Se generó una curva patrón representando el valor Ct obtenido mediante la PCR cuantitativa (a lo largo del eje de las ordenadas) frente el número de copias para una reacción (a lo largo del eje de las abscisas).
El ADN extraído de cada uno de los caldos de cultivo bacteriano puro de las cepas mostradas en la Tabla 1 y la Tabla 4 se sometió a PCR en una cantidad de número de copias de 106 para una reacción de PCR. El valor Ct valor se obtuvo utilizando como molde el ADN extraído de cada uno de los caldos de cultivo bacteriano puro de las cepas. Los números de copias se calcularon a partir del valor Ct utilizando la curva patrón. A continuación, los cebadores que produjeron números de copias de 105 o más se consideraron positivos (+), de 101 o menos se consideraron negativos (-) y de 101 a 105 (más de 101 y menos de 105) se consideraron (±).
(3) Resultados
Los resultados de las especificidades se muestran en la Tabla 5. Utilizando los cebadores para la detección del complejo génico de tipo C-1, no se observó amplificación del ADN de la cepa bacteriana número 6 que tiene el gen de tipo C. Sin embargo, utilizando los otros cebadores, se observaron amplificaciones de ADN de las bacterias productoras de equol del tipo diana. Con respecto a cualquiera de los cebadores diseñados, no se observó amplificación de ADN de las bacterias intestinales más dominantes (N.° 10 a 21), de las bacterias pertenecientes a las Coriobacteriaceae (N.° 22 a 37) ni de bacterias productoras de equol, excepto para el tipo de bacterias diana. Por consiguiente, se descubrió que cada uno de los cebadores tiene una alta especificidad. Además, se ha descubierto que los cebadores para la detección del complejo génico de tipo C-2 tienen mayor especificidad que los cebadores para la detección del complejo génico de tipo C-1, y se prefieren como cebadores para la detección del complejo génico de tipo C.
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(continuación)
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Ejemplo de Prueba 2: Propiedades cuantitativas de los cebadores dirigidos al gen de la enzima convertidora de THD-equol
(1) Métodos
Se generó y utilizó una curva patrón utilizada para PCR cuantitativa de una manera similar al Ejemplo de Prueba 1. Las condiciones de la PCR cuantitativa también fueron similares a las descritas en el Ejemplo de Prueba 1, y así se generó una curva patrón de cada cebador.
(2) Resultados
Con respecto a cualquiera de los cebadores, se obtuvo una curva patrón que tiene una alta linealidad dentro de un intervalo de 10° a 105 números de copias por una reacción de PCR (Fig. 2). Por consiguiente, a partir de los resultados se estimó que fueron detectables al menos 103 número de copias por 1 g de heces.
Ejemplo 2: Detección del gen de la enzima convertidora de THD-equol a partir de heces - 1
(1) Métodos
(a) Detección del gen de la enzima convertidora de THD-equol a partir de heces
Las pruebas se realizaron en 25 adultos sanos. Los sujetos de prueba ingirieron una botella de bebida de leche de soja (200 ml contienen aproximadamente 40 mg de isoflavona) en la cena del primer día y el segundo día proporcionaron heces. Se extrajo ADN a partir de 20 mg de las heces recogidas de acuerdo con un método conocido públicamente (Appl. Environ. Microbiol. 70: 167-73), y el ADN obtenido se disolvió utilizando 100 pl de tampón TE. La PCR se realizó de manera similar al Ejemplo de Prueba 1 y al Ejemplo de Prueba 2, utilizando tres tipos de conjuntos de cebadores que se muestran en la Tabla 3 (con respecto al complejo génico de tipo C se utilizó el complejo génico de tipo C-1), y se realizó la detección y cuantificación de los genes de enzima convertidora de equol en las heces.
(b) Medición de la concentración de equol en orina
Sujetos de prueba de 25 adultos sanos ingirieron una botella de bebida de leche de soja (200 ml contienen aproximadamente 40 mg de isoflavona) en la cena del primer día, y el segundo día proporcionaron la primera orina del día. La orina recogida se mezcló con 4000 Ul/ml de solución de p-glucuronidasa (Sigma-Aldrich Japón) en una proporción de 1:1 (v/v), se sometió a una reacción de desconjugación a 37 °C durante 24 horas, y a continuación se añadió a la solución de reacción una cantidad de metanol de 4 veces. La solución se filtró utilizando Centricut Ultramini (W-MO, KURABO INDUSTRIES LTD.) para obtener una muestra de orina para análisis por CL/EM.
Para la medición de la muestra de orina se utilizó cromatografía líquida con espectrometría de masas (CL/EM). Se utilizó un detector de masas ZQ 4000, sistema Alliance HPLC y un detector de matriz de fotodiodos (Nihon Waters K.K.) como equipo de medición. La columna de separación utilizada fue CadenzaCD-C18 de 3 pl (diámetro interior: 3,0 mm, longitud: 75 mm, Imtakt) y la fase móvil utilizada fue una solución mixta de ácido fórmico al 0,1 % y acetonitrilo. Para la cuantificación de equol se utilizó el programa informático Waters Empower 2 (Nihon Waters K.K.).
(2) Resultados
Se detectó cualquiera de los tres tipos de genes de la enzima convertidora de THD-equol, tipo A a tipo C, en 15 de los 25 sujetos de prueba (Tabla 6). Los 15 sujetos de prueba, en los que se detectó cualquiera de los genes de la enzima convertidora de equol, se confirmaron como productores de equol mediante la concentración de equol en orina. Por consiguiente, se descubrió que los tres tipos de conjuntos de cebadores pueden utilizarse para la detección de los genes de la enzima convertidora de THD-equol a partir de las heces de un sujeto de prueba, y para la determinación de si el sujeto de prueba tiene capacidad de producir equol o no.
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Ejemplo 3: Detección del gen de la enzima convertidora de equol a partir de heces - 2
(1) Métodos
Las pruebas se realizaron en 35 adultos sanos. La PCR se realizó de manera similar al Ejemplo de Prueba 1 y al Ejemplo de Prueba 2, utilizando tres tipos de conjuntos de cebadores que se muestran en la Tabla 3 (se utilizaron los complejos génicos de tipo C-1 y -2 con respecto al complejo génico de tipo C), y se realizó la detección y cuantificación de los genes de enzima convertidora de equol en las heces. Los sujetos de prueba ingirieron una botella de bebida de leche de soja (200 ml contienen aproximadamente 40 mg de isoflavona) en la cena del primer día, y el segundo día proporcionaron la primera orina del día y heces. La orina se utilizó para el análisis de la concentración de equol, y las heces se utilizaron para la detección y cuantificación del número de genes de enzima convertidora de equol.
Se preparó una muestra de orina de una manera similar al Ejemplo de Prueba 2.
Las concentraciones de equol en orina se midieron de una manera similar al Ejemplo de Prueba 1 y al Ejemplo de Prueba 2.
(2) Resultados
Se analizaron los ADN de las heces de 35 adultos sanos utilizando cada uno de los cebadores, incluidos los cebadores para la detección del complejo génico de tipo A, los cebadores para la detección de complejos génicos de tipo B y los cebadores para la detección de complejos génicos de tipo C (complejo génico de tipo C-1 y complejo génico de tipo C-2), que se muestran en la Tabla 3. Se detectó cualquiera de los tres tipos de genes de la enzima convertidora de THD-equol, tipo A a tipo C, en 13 de los 35 sujetos de prueba (Tabla 7). Los 13 sujetos de prueba, en los que se detectó alguno de los genes de la enzima convertidora de equol, se confirmaron como productores de THD-equol mediante la concentración de equol en orina. Además de esta prueba, se descubrió que los tres tipos de conjuntos de cebadores (cualquiera de los complejos génicos de tipo C-1 o -2 con respecto a los complejos génicos de tipo C) pueden utilizarse para la detección de genes de la enzima convertidora de THD-equol a partir de las heces de un sujeto de prueba, y para la determinación de si el sujeto de prueba tiene capacidad de producir equol o no.
Tabla 7
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Ejemplo de Referencia: Confirmación de los cebadores para la detección de un complejo génico de tipo A
(1) Métodos
En relación con los cebadores para la detección del complejo génico de tipo A del Ejemplo 1, tales cebadores (SL-F1 y SL-R1, mostrados en la Tabla 8) se produjeron basándose en las secuencias de genes de la enzima convertidora de THD-equol contenidos en 2 cepas que incluyen Slackia sp. YIT 11861 y Slackia isoflavoniconvertens HE8 (es decir, sin considerar la secuencia del gen de la enzima convertidora de THD-equol contenida en Slackia sp. MC6). La PCR se realizó sobre heces humanas de 25 sujetos de prueba descritos en el Ejemplo 2, de una manera similar al Ejemplo 2, utilizando los cebadores así producidos (SL-F1 y SL-R1) y los cebadores para la detección del complejo génico de tipo A (SL-F2 y SL- R2) mostrados en la Tabla 3, y se realizó la detección de genes de la enzima convertidora de THD-equol a partir de las heces.
Tabla 8
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(2) Resultados
Aunque el sujeto de prueba N.° 3 muestra una alta concentración de equol en orina y tiene capacidad para producir equol, no se detectó un gen de la enzima convertidora de THD-equol en las heces del sujeto de prueba N.° 3 utilizando los cebadores SL-F1 y SL-R1 (Tabla 9). En el sujeto de prueba N.° 3, el gen de la enzima convertidora de THD-equol se detectó únicamente mediante el uso de cebadores para la detección del complejo génico de tipo A (SL-F2 y SL-R2) de la presente invención (Tabla 6). Por consiguiente, para la detección del complejo génico de tipo A es necesario utilizar SL-F2 y SL-R2 como cebadores.
T l
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método para medir la capacidad de producir equol de un sujeto de prueba, donde se detecta un gen de la enzima convertidora de THD-equol procedente de bacterias intestinales del sujeto de prueba utilizando tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en los siguientes a) a c):
a) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases;
b) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 4, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases; y
c) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 o 7, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el gen de la enzima convertidora de THD-equol se detecta utilizando heces procedentes del sujeto de prueba.
3. Una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.
4. Una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 4, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.
5. Una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 o 7, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.
6. Tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en los siguientes a) a c):
a) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ Id NO: 2, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases;
b) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 4, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases; y
c) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 o 7, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.
7. Un kit para medir la capacidad de producir equol de un sujeto de prueba, que comprende tres tipos de conjuntos de cebadores expuestos en los siguientes a) a c):
a) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 1 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases;
b) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 3 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 4, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases; y
c) una pareja de cebadores que comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 5 y un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 o 7, o una pareja de cebadores que comprende secuencias complementarias correspondientes a dichas secuencias de bases.
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