KR101616180B1 - 케피어 발효유 감별 및 락토바실러스 케피라노팍시엔스 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물 및 그 검출 방법 - Google Patents

케피어 발효유 감별 및 락토바실러스 케피라노팍시엔스 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물 및 그 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 케피어 발효유 감별 및 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물 및 그 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개발된 프라이머/프로브 조성물은 Lb . kefiranofaciens 균만을 특이적으로 검출하였으며, 다양한 시판 발효유제품 중에서 케피어만을 선택적으로 판별할 수 있었고, 케피어 그레인과 케피어 내에 존재하는 Lb . kefiranofaciens를 성공적으로 정량할 수 있는 효과가 있다.

Description

케피어 발효유 감별 및 락토바실러스 케피라노팍시엔스 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물 및 그 검출 방법{A COMPOSITION FOR IDENTIFYING KEFIR FERMENTED MILK AND QUANTITATIVE IDENTIFYING SPECIFIC FOR Lactobacillus kefiranofaciens AND A METHOD USING THE SAME}
본 발명은 케피어 발효유 감별 및 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물 및 그 검출 방법에 관한 것이다.
케피어는 50종 이상의 유산균, 초산균, 효모가 공생계를 형성하고 있는 천연 발효유제품이다. 케피어를 정기적으로 섭취할 경우 정장작용, 항비만작용, 항염증작용, 항미생물작용 등 다양한 건강 유익효과를 얻을 수 다고 알려져 있으며, 케피어가 처음으로 유래된 구 소련의 코카서스 지방에서는 장수식품, 당뇨병의 치료 보조식품으로서 이용되어 왔다. 락토바실러스 케피라노팍시엔스(이하, 'Lactobacillus kefiranofaciens' 또는 'Lb . kefiranofaciens'라 함)는 케피어의 발효 스타터인 케피어 그레인에서 처음 분리된 균으로, kefiran이라고 불리는 항종양효과를 지닌 외다당체를 생산하며, 케피어 그레인의 형성에 핵심적인 역할을 수행한다고 알려진 유산균이다. 또한, 케피어 이외의 유제품에서는 발견되지 않기 때문에 케피어와 기타 발효유제품을 구별할 수 있는 중요한 지표균이라고 할 수 있다.
산업적인 측면에서, 케피어의 품질 관리 및 kefiran의 대량생산을 위해서는 Lb. kefiranofaciens를 선택적으로 검출 및 정량할 수 있는 방법이 필수적이지만, 아직까지 이 균을 선택적으로 검출 및 정량할 수 있는 방법이 개발되어있지 않은 실정이다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 케피어 발효유 감별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균을 특이적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균을 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 각각의 프로브는 서로 상이한 검출가능한 수단으로 표지된다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광 표지인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 예로, 형광 표지 인자가 가장 바람직하다. 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로,용이하게 입수가능하다. 형광 표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green,Cy3, Texas Red, RED610, RED670, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유 감별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 특이적인 정량 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 검출용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 구체적으로, 실시간 PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 발효유 또는 케피어로부터 지노믹 DNA를 추출하여 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 발효유 또는 케피어로부터 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균을 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 케피어 또는 케피어 그레인으로부터 지노믹 DNA를 추출하여 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 락토바실러스 케피라노팍시엔스 수를 정량화하는 단계를 포함하는 케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 수를 정량화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 상기 표준검량선은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) kefirgranum DSM10550 균주를 배지에서 배양하여 그 균수를 계수하고, 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) DSM10550 균주에서 지노믹 DNA를 추출하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct값과 상기 배지에서 얻은 균수를 각각 대응시켜 얻는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 실시간(Real-time) PCR(Polymerase chain reaction) 은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 방법으로, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 target DNA의 양을 분석하는 것으로, 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 확인을 위한 전기 영동이 필요 없으며,증폭이 지수함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 보다 정확한 정량이 가능한 신속성 과 정량성이 뛰어난 방법이다.
본 발명의 개발된 프라이머/프로브 세트는 Lb . kefiranofaciens 균만을 특이적으로 검출하였으며, 다양한 시판 발효유제품 중에서 케피어만을 선택적으로 판별할 수 있었다. 또한, 케피어 그레인과 케피어 내에 존재하는 Lb . kefiranofaciens를 성공적으로 정량할 수 있었다.
따라서 본 발명의 개발된 real-time PCR방법은 Lb . kefiranofaciens 균을 선택적으로 정량 검출할 수 있어 케피어의 감별 및 품질 관리, kefiran의 대량 생산 연구에 적극적으로 활용될 수 있다.
도 1은 표준 균주를 활용한 새로 개발된 real-time PCR의 민감성 및 특이성 검증에 대한 그림.
도 2는 시판 발효유 및 케피어를 활용한 새로 개발된 real-time PCR의 민감성 및 특이성 검증에 대한 그림.
도 3은 Lb . kefiranofaciens 정량용 표준 검량선에 대한 그래프이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 프라이머 / 프로브 세트의 개발
본 발명의 개발된 프라이머/프로브 세트는 Lb . kefiranofaciens의 16S rDNA 유전자를 표적으로 제작되었으며, 그 서열은 아래 표 1에 기재되어 있다.
프라이머/프로브 명칭 서열 농도
LKF_KU504F
(forward 프라이머)		 5′- CAGTTCGCATGAACAGCTTTTAA-3′ 250 nM
LKF_KU504R
(reverse 프라이머)		 5′- GCACCGCGGGTCCAT-3′ 250 nM
LKF_KU504P (프로브) 5′-FAM-CGCAAGCTGTCGCTAA-3′-TAMRA 900 nM
표 1은 Lb . Kefiranofaciens 특이 정량검출용 프라이머/프로브 세트 표이다.
실시예 2: 표준균주 및 시판발효유제품을 이용한 검증실험
개발된 프라이머/프로브 세트의 민감성/특이성을 평가하기 위해서 24개의 표준 유산균 및 25개의 표준 비 유산균을 사용하여 검증실험을 실시하였다. 사용된 표준 균주의 목록은 아래 표 2와 같다. 또한 시판되고 있는 서로 다른 30개의 발효유제품과 4개의 케피어를 이용하여 민감성/특이성을 평가하였다.
분류 균주
유산균 Lactobacillus kefiranofaciens sub sp. kefiranofaciens ATCC43761
Lactobacillus kefiranofaciens sub sp. kefirgranum DSM10550
Lactobacillus acidophilus ATCC4357
Lactobacillus acidophilus (isolated from kefir grain)
Lactobacillus amylovorus KCTC3597
Lactobacillus brevis ATCC8287
Lactobacillus crispatus KCTC3174
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842
Lactobacillus gasseri KCTC3163
Lactobacillus helveticus KCTC3545
Lactobacillus jensenii KCTC5194
Lactobacillus johnsonii JCM1022
Lactobacillus kefiri ATCC35411
Lactobacillus casei ATCC393
Lactobacillus paracasei KCTC13169
Lactobacillus fermentum ATCC11739
Lactococcus lactis subsp. lactis (isolated from kefir grain)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (isolated from kefir grain)
Leuconostoc mesenteroides KCTC13302
Bifidobacterium adolescents ATCC15703
Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM10140
Bifidobacterium breve ATCC15700
Bifidobacterium longum subsp. infantis KCTC5934
Bifidobacterium longum BL-720
비유산균 Acetobacter aceti ATCC23746
Bacillus amyloliquefaciens ATCC23845
Bacillus cereus ATCC 14579
Bacillus circulans ATCC21783
Bacillus licheniformis ATCC21415
Bacillus megaterium ATCC10778
Bacillus sphaericus ATCC33203
Bacillus subtilis subsp. subtilis ATCC6633
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ATCC33679
Bacteroides acidifaciens DSM15896
Bacteroides uniformis ATCC8492
Candida inconspicua ATCC16783
Clostridium perfringens ATCC3624
Enterococcus faecalis ATCC19433
Escherichia coli ATCC25922
Escherichia coli ATCC11775
Kluyveromyces lactis ATCC34440
Listeria grayi ATCC19120
Listeria innocua ATCC33090
Listeria monocytogenes ATCC51776
Listeria welshimeri ATCC35897
Pseudomonas aeruginosa ATCC15522
Saccharomyces cerevisiae ATCC6037
Saccharomyces cerevisiae ATCC7752
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus KCTC5091
표 2는 민감성/특이성 검증에 사용된 균주 목록 표이다.
상기 제시된 균주들 및 시판 발효유제품에서 genomic DNA를 추출한 후 아래 표 3에 제시된 것과 같은 PCR 반응용액을 제조하였다. 이후 반응액을 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems)을 이용하여 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 그리고 95℃에서 15초, 60℃에서 60초로 구성된 반응사이클을 40회 반복하며 결과를 얻었다.
재료 용량
TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 12.5 μL
LKF_KU504F 2.5 μL
LKF_KU504R 2.5 μL
LKF_KU504P 2.5 μL
표준균주에서 추출된 genomic DNA 5 μL
총 합 25 μL
표 3은 PCR 반응 용액의 제조 관련 표이다.
실시예 3: 케피어 내에 존재하는 Lb . kefiranofaciens 균의 정량
락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) sub sp. kefirgranum DSM10550 균주를 MRS 배지에서 27℃에서 72시간 동안 혐기배양하여 얻어진 집락을 10% skim milk에 접종하였다. 이를 10% skim milk를 이용하여 10배로 희석한 후 MRS 배지에 도말하여 균을 계수하였다. 동시에 접종액에서 genomic DNA를 추출하여 단계적으로 희석한 후, 위와 동일한 방법으로 real-time PCR 반응을 수행하였다. Real-time PCR에서 얻은 Ct값과 MRS배지에서 얻은 시료액의 균수를 각각 대응시켜 표준검량선을 작성하였다. 이어, 100 μl의 케피어 및 25 mg의 케피어 그레인에서 genomic DNA를 추출한 후 위와 동일한 방법으로 real-time PCR을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 Lb . kefiranofaciens 수를 정량하였다.
본 발명의 상기 실시예의 실험 결과는 Microsoft Excel 2010 (Microsoft)를 이용하여 평균 ± 표준편차로 제시하였다. 또한 정량치간의 통계학적 유의차는 Student t test로 분석하였으며 P값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의차가 있는 것으로 간주하였다.
상기 실시예의 결과는 하기와 같다.
(1) 민감성과 특이성
총 49개의 표준균주를 이용한 검증실험에서는 Lactobacillus kefiranofaciens sub sp. kefirgranum DSM10550, Lactobacillus kefiranofaciens sub sp. kefiranofaciens ATCC43761의 두 균주만이 양성반응을 나타내었으며, 나머지 47가지 균주들은 모두 음성 반응을 나타내었다 (도 1).
또한, 시판 발효유제품을 이용한 검증실험에서는 4개의 케피어에서만 양성 반응을 얻었으며, 30개의 기타 시판 발효유제품에서는 모두 음성 결과를 얻었다.
(2)케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 Lb . kefiranofaciens의 정량
케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 Lb . kefiranofaciens를 정량하기 위해서 아래와 같은 표준 검량선을 얻을 수 있었다.
도면 3의 표준 검량선을 이용하여 케피어 1ml과 케피어 그레인 1g에 존재하는 Lb. kefiranofaciens균을 정량한 결과가 아래 표에 제시되어 있다.
ml혹은 gram당 Log 균수 *
케피어 그레인 케피어
평균 ± 표준편차 7.07 ± 0.23 A 3.84 ± 0.83 B
표 4는 케피어와 케피어 발효유에서 Lb . kefiranofaciens균의 정량 관련 표이다. 표에서 *는 동일 행 내의 다른 알파벳은 두 값 사이의 통계학적 유의차가 있음을 의미함(P < 0.05)
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A COMPOSITION FOR IDENTIFYING KEFIR FERMENTED MILK AND QUANTITATIVE IDENTIFYING SPECIFIC FOR Lactobacillus kefiranofaciens AND A METHOD USING THE SAME <130> HY140341 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagttcgcat gaacagcttt taa 23 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcaccgcggg tccat 15 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 cgcaagctgt cgctaa 16

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유 감별용 조성물.
  2. 삭제
  3. 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 케피어 발효유 감별용 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 발효유 또는 케피어로부터 지노믹 DNA를 추출하여 제1항의 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 발효유 또는 케피어로부터 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균을 특이적으로 검출하는 방법.
  7. 케피어 또는 케피어 그레인으로부터 지노믹 DNA를 추출하여 제1항의 조성물을 이용하여 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 락토바실러스 케피라노팍시엔스 수를 정량화하는 단계를 포함하는 케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 유산균 수를 정량화하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 표준검량선은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) kefirgranum DSM10550 균주를 배지에서 배양하여 그 균수를 계수하고, 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) DSM10550 균주에서 지노믹 DNA를 추출하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct값과 상기 배지에서 얻은 균수를 각각 대응시켜 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140040636A 2014-04-04 2014-04-04 케피어 발효유 감별 및 락토바실러스 케피라노팍시엔스 유산균 특이적인 정량 검출용 조성물 및 그 검출 방법 KR101616180B1 (ko)

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