KR20110084691A - 오미자 발효물, 그 발효방법 및 상기 발효물을 포함하는 식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오미자 발효물, 그 발효방법 및 상기 발효물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 섬유질 분해성 젖산균인 Enterococcus sp. TO-94로 오미자를 발효시킴으로써 프럭토오스, 글루코오스, 젖산, L-타르타르산, 비타민, 폴리페놀 및 안토시아닌 등의 함량을 증대시킨 오미자 발효물, 그 발효방법 및 상기 발효물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

오미자 발효물, 그 발효방법 및 상기 발효물을 포함하는 식품 조성물{Ferments of Schisandra chinensis, the method for fermenting thereof and the food composition containing the same}

본 발명은 오미자 발효물, 그 발효방법 및 상기 발효물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 섬유질 분해성 젖산균인 Enterococcus sp. TO-94로 오미자를 발효시킴으로써 프럭토오스, 글루코오스, 젖산, L-타르타르산, 비타민, 폴리페놀 및 안토시아닌 등의 함량을 증대시킨 오미자 발효물, 그 발효방법 및 상기 발효물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

오미자는 오미자 나무과에 속하는 낙엽성 덩굴식물로 혈압강하, 항암, 항노화, 면역조절 및 항균활성 등 다양한 생리 기능이 보고되어 있으며(Ames BN, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:7915-7922; Choi JS, et al ., Phytochemistry, 1995, 40:997-999; Devy C, et al ., Biochem. Parmacol., 1990, 39:399-405; Kuramoto T, Up to date Food Processing, 1992, 27(3):22-23; Hae J, DongEuBoGam , NamSanDang , Seoul ., 1990, p. 140-142; Takashi N, et al ., FEBS Lett ., 2002, 514:315-322; 및 Kamei R, et al ., Life Sci ., 2003, 73:2091-2099), 오미자 특유의 붉은색을 내는 색소인 안토시아닌(anthocyanin)은 항산화 활성이 있는 것으로 알려져 있다. 다섯 가지 맛을 내는 오미자는 다양한 기능성과 더불어 천연 유색음료의 비중이 높아지는 세계 음료시장의 추세에 따라 상품성이 높은 원료로 주목 받고 있다(Lee WY, et al ., Korean J. Food Preserv ., 2006, 13:252-258). 그러나 통상적으로 오미자의 특성 안정화를 위하여 60℃ 안팎의 저온에서 물 추출을 수행하는 과정을 거침으로써 그 수율 및 활성이 적어져서 실효성이 없다(Lee WY, et al ., Korean J. Food Preserv., 2006, 13:252-258; 및 Kim HK, et al ., Korean J. Food Culture, 2004, 19:484-490). 또한 과일 자체에 포함된 당 함량이 4.05% 정도에 불과하여 미생물 영양원으로 사용되기에 턱없이 부족하여 발효에도 적합하지 않으며(Hyun HK, et al ., Korean J. Plant Res ., 2002, 15:1-7), 초기 pH가 2.5로 저산성 성질을 나타내므로 발효 미생물의 생육에 적합하지 않다.

최근에는 전분질 원료를 가수분해할 수 있는 젖산균을 이용하여 저영양 소재로부터 영양 성분의 중량을 증가시키고, 이를 통해 고에너지 보충용 식품을 개발하고자 하는 다양한 연구가 시도되고 있다. 젖산균은 저산성 조건에서 생육이 가능하며 유산발효하여 식품의 부패를 방지하고 박테리오신(bacteriocin)과 같은 항균물질을 분비하여 식중독균 및 장내 부패세균의 성장억제 효과를 갖는 미생물이다(Park YS, et al ., J. Korean Soc . Agric . Chem . Biotechnol ., 2003, 461:367-375). 일례로, Songre-Ouattar 등(Songre-Ouattara LT, et al ., International Journal of Food Microbiology , 2009, 130(3):258-264)은 땅콩 슬러지 전분을 Lactobacillus plantarum A6를 사용하여 부분 분해시킬 경우 영양 성분의 중량이 증가하였다고 보고하였다. 그 외 옥수수(Nakamura LK, International Journal of Systematic Bacteriology, 1998, 31:56-63), 감자(Chatterjee M, et al., Biotechnology Letters , 1997, 19:873-874) 및 카사바(Cassava; Giraud E, et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 1991, 36:379-383) 등 녹말상 원료물질(amylaceous raw material)을 발효시키는 Lactobacillus amylovorus 및 Lactobacillus plantarum 등이 보고되었다. 또한 Thi 등은 쌀/콩을 Lactobacillus plantarum으로 발효하여 양양 보충성 식품을 개발하였다고 보고하였다(Nguyen TT, et al ., Food Chemistry 100., 2007, p. 623-631). 그러나, 오미자의 경우에는 당 함량의 부족으로 인해 젖산에 의한 발효도 어렵다. 오미자의 탄수화물 함량을 증가시키기 위하여 상업적 효소를 사용할 수도 있으나, 이 경우에는 오미자의 낮은 pH 조건에서 활성을 나타내는 효소의 구입이 원활하지 않을 뿐 아니라 제품 생산 비용의 상승 및 생산 시 추가 공정에 대한 설비 추가 등 실용성이 없다.

이에 본 발명자들은 오미자의 실효성을 높이기 위하여 오미자를 발효시킬 수 있는 특정 발효균을 분리, 동정하고 그 발효균을 이용하여 오미자를 발효시킬 경우 저산성을 나타내고 높은 섬유질 함량을 갖는 오미자 발효물을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규 발효균을 이용하여 제조한 오미자 발효물, 그 발효방법 및 이를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 기탁번호 KFCC11477P의 Enterococcus sp. TO-94로 발효시킨 오미자 발효물을 제공한다.

또한 본 발명에서는 기탁번호 KFCC11477P의 Enterococcus sp. TO-94로 오미자를 발효시키는 방법을 제공한다.

또 본 발명에서는 상기 오미자 발효물을 함유하는 식품 조성물을 제공한다.

오미자를 기탁번호 KFCC11477P의 Enterococcus sp. TO-94로 발효시켜 제조한 발효물은 발효시키지 않은 오미자 보다 프럭토오스, 글루코오스, 젖산, L-타르타르산 및 비타민 등의 함량이 증가하였고, 수크로오스, 말토오스, 옥살산(Oxalic acid), 포름산(Formic acid) 및 말산(Malic acid)의 함량은 감소하였다. 또한 상기 발효물은 폴리페놀 및 안토시아닌의 함량이 오미자 대비 각각 3.8배 및 1.2배 증가하였다.

도 1은 Enterococcus sp. TO-94의 16S rDNA 서열 및 계통수(Phylogenetic tree)를 보여준다.
도 2는 Entrococcus paecium IFO13712 및 Enterococcus sp. TO-94 총 막지질(total membrane lipid)의 지방산 구성을 비교한 결과를 보여준다.
도 3은 Enterococcus sp. TO-94를 MRS 배지 및 오미자 파쇄액에 각각 접종하여 37℃에서 배양하면서 4시간 간격으로 균의 생육을 비교한 그래프이다[■: 오미자 파쇄액, 및 ●: MRS 배지].
도 4는 Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자 발효 과정에서 얻어진 발효물의 유리당 및 총 당의 함량 변화를 측정한 그래프이다[■: 말토오스, ▲: 수크로오스, ●: 글루코오스, ※: 프럭토오스, 및 ◇: 총 당 함량].

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 Enterococcus sp. TO-94로 발효시킨 오미자 발효물 및 그 발효방법에 관한 것이다. 상기 Enterococcus sp. TO-94는 2개월 미만의 영아의 분변에서 섬유질 분해능을 갖는 유산균을 분리한 후 이를 동정하여 오미자 발효에 적합성 여부를 시험하여 얻은 것으로서, 2010년 1월 12일자로 (사)한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KFCC11477P를 부여받았다.

본 발명에 의한 오미자의 발효방법은 하기 단계들을 포함한다:

1) 오미자에 동량(v/v)의 물을 첨가한 후 균질기(homogenizer)를 사용하여 파쇄하는 단계;

2) 상기 1)의 파쇄물을 70∼75℃에서 5∼10분간 가열살균하는 단계;

3) 기탁번호 KFCC11477P의 Enterococcus sp. TO-94를 생리 식염수에 희석한 희석액(6.0∼8.0 CFU/ml)을 준비하는 단계; 및

4) 상기 2)의 살균 파쇄물에 3)의 희석액을 혼합한 다음 37℃에서 72시간 배양하는 단계.

또한 본 발명은 상기 오미자 발효물을 조성물 총 중량에 대하여 10∼100 중량%로 함유하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 식품 조성물은 음료수, 제빵, 드링크, 유지류, 아이스크림, 과자, 떡, 스넥류, 이유식, 주류, 조미료류, 레토르트 또는 통조림 등 각종 조리가공식품류로 제조될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 실시예 및 시험예에서는 ANOVA(one-way analysis of variance) 방법으로 통계처리하였다. 통계 결과는 3회 분석 결과를 평균값±표준편차로 나타내었다.

[실시예 1] Enterococcus sp. TO-94의 분리 및 동정

<섬유질 분해능을 갖는 유산균 분리 및 동정>

오미자 발효를 위한 섬유질 분해능을 갖는 유산균을 분리하기 위하여 생후 2개월 미만의 영아의 분변 총 17종을 수집하였다. 수집된 영아 분변은 여과 후 적정 배율(10^-8/ml)로 희석하였다. 이 희석액을 MRS 배지(Lactobacilli MRS broth; Difco Co., France)에 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 형성된 콜로니는 2% CaCO₃가 첨가된 MRS 배지에 투쓰 피킹(tooth picking)하여 투명환을 형성하는 균주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 1,150여 콜로니의 미생물 중 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC:　　carboxymethyl cellulose) 분해능이 우수한 균주를 선별하기 위하여, 덱스트로오스와 구연산 암모늄(ammomium citrate)을 제외시키고 10 g/L 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 MRS 한천 배지에 1차 선별 균주를 획선 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 1% 콩고 레드(congo red) 용액으로 염색한 다음 1% NaCl 용액으로 세척하여 노란색의 투명환을 형성하는 균주를 최종 선별하였다.

<형태학적 특성 분석>

분리균주의 크기와 형태는 Gerhatdt 등(Gerhardt P, et al ., American Society for Microbiology , Washington, 1984)의 방법에 따라 그람염색(BD Co., U.S.A)하여 광학현미경(Nicon, FK-IIA,Japan)으로 형태학적 특성을 관찰하였다. 이때, 글루코오스 영양 한천 배지, 탈지유(skim milk) 배지 및 LB(Luria-Bertani) 배지에서 생육한 집락의 형태, 크기 및 색깔 등을 관찰하였고, 반유동고체배지(트립토오스(tryptose) 1.0%, 염화나트륨 0.5% 및 한천 0.5%)에 배양하여 운동성을 조사하였다. 또한 분리균주는 산성 평판배지(pH 3.0)에서의 콜로니 형태는 원형이었고, 색깔은 밝은 유백색이었으며 표면은 볼록하고 매끄러운 상태였다. 또한 산성 액체배지에서 생육은 좋았고 혐기성이었으며, 균체의 침전현상을 나타내었다.

<생리적 특성 분석>

분리균주의 생리적 특성을 알아보기 위하여 미생물 실험 메뉴얼(Cappuccino JG, et al ., Benjamin and Cummings , California, 1975)에 따라 카세인(casein) 분해능, 전분 분해능, 젤라틴(gelatin) 액화력, 당 발효성, 인돌(indole) 생성능, 질산염(nitrate) 환원력, 카탈라아제(catalase)와 옥시다아제(oxidase) 생산능을 조사하였다.

또한 분리균주의 섬유질 분해능은 CMCase의 활성 및 펙티나아제(Pectinase) 활성을 측정하여 확인하였다. CMCase의 활성도는 DNS 방법(Miller GL, Anal . Chem ., 1959, 31:426-428)에 의하여 CMC로부터 유리된 환원당을 측정하여 정량하였다. 즉, 이 실험의 표준 측정을 위하여 증류수에 녹인 CMC(1.0%, w/v) 500 μl, 200 mM Na-구연산염 완충용액(pH 5.5) 250 μl와 효소 용액을 혼합하여 최종 1 ml로 한 후 55℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. DNS 시약 3.0 ml와 글루코오스 용액(0.1 mg/ml) 0.1 ml을 첨가하여 반응을 정지시키고 5분 동안 끓인 다음 식힌 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 환원당의 양은 글루코오스 표준용액을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다. 효소의 활성도 1.0 unit는 CMC를 기질로 하여 55℃ 조건 하에서 1분 동안에 1.0 μmol의 글루코오스에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

분리균주의 생리적 특성은 하기 표 1과 같다:

성장 온도	15∼45℃
성장 pH	2.0～9.0
NaCl 내성	≤ 10%
카탈라아제	-
옥시다아제	-
레시티나아제(Lecithinase)	+
리파아제(Lipase)	-
페닐알라닌 탈아민화(deamination)	-
가수분해능
전분	+
카세인	+
셀룰로오스	+
에스큘린(Esculin)	+
인돌 생산	+
수크로오스로부터 레반(Levan) 형성	+
아르긴으로부터 NH3 생산	+
펩톤으로부터 NH3 생산	+
젤라틴 액화(liquefaction)	+
메틸레드 시험	-
VP(Voges-Proskauer) 반응	+
질산염 환원	+
우유에서의 작용
응고(Coagulation)	+
펩톤화(Peptonization)	+
산화-발효 시험	발효
영양 플레이트에서의 성장	+

상기 표 1에서, 분리균주의 생육 pH 범위는 2.0∼9.0이었고, 생육온도 범위는 15∼45℃이었다. 또한 염농도 10%까지 생육이 가능하였고, 카탈라아제 음성, 옥시다아제 음성 및 전분 및 카세인을 가수분해하였으며, 셀룰로오스 가수 분해능은 양성이었다. 또한 인돌 생산능을 갖고 있었고, 아르기닌과 펩톤으로부터 NH₃를 생산하였으며, 중성의 영양배지에서도 생육이 확인되었다. 당 발효성 실험에서 L-람노오스를 이용하지 못하였으나 글루코오스, 수크로오스 및 라피노오스(raffinose)는 잘 이용하였다. 글루코오스를 비롯한 일부 당으로부터 산을 생산하였으나, 모든 당에서 가스는 생산되지 않았다.

<생물학적 특성 분석>

분리균주의 생물학적 특성은 Bochner 등(Bochner BR, et al ., Genome research .. 2001, 11: 1246-1255; Bochner BR, "Breath prints" at the microbial level, 1989, ASM News . 55:536-239; 및 Bochner BR, Nature , 1989, 339:157-158)과 Lee 등(Lee JS, et al ., Int . J. Syst . Bacteriol., 2002, 52:2110-2123)의 방법에 준하여 측정하였다. 분리균주를 영양 한정 배지(Resasoner DJ, et al., Appl . Environ. Microbiol., 1985, 49:1-7)에서 24시간 전배양한 후 멸균 식염수로 적정 농도까지 현탁하고, 각종의 탄소원, 질소원, 인산원(phosphate source), 황원(sulfur source), 독립영양 보충제(autotrophic supplement) 및 억제물질(inhibitory compound)이 포함된 Biolog^TM GP 마이크로플레이트에 150 μL씩 분주한 다음 4∼24시간 동안 배양하였다. 이 기간 동안 세포의 호흡활동으로 각종 원료(source)들이 산화하게 되고 플레이트에 포함된 테트라졸리움(tetrazolium) 염료는 보라색을 형성하게 된다. 바이올로그 데이터베이스(biolog data base)를 사용하여 Enterococcus sp. TO-94와 표준균주들의 유사도를 비교한 결과, 본 발명에 의한 Enterococcus sp. TO-94는 Lactococcus lactis와 약 43.3% 및 Streptococcus thermophilus와는 약 20.7%의 유사도를 나타내어 기존의 젖산균들과 상이한 새로운 미생물로 판명되었다.

<화학적 특성 분석>

분리균주의 화학적 특성은 Komagata 등(Komagata K, et al ., Method in Microbiology. Acadeic press., 1987, 19: 161-207)의 방법(Method in Microbiology) 및 Miller(Miller GL, Anal . Chem ., 1959, 31:426-428)의 MIS(Microbial identification system)에 준하여 분석하였다. 분석방법으로는 세포벽내의 지방산 유형, DNA 염기 구성(G+C 몰 함량) 및 DNA 서열 등을 조사하였다.

분리균주의 전체 세포 지방산 조성을 확인하기 위하여 가스 크로마토그래피(GC, HP 6890)를 사용하였다. 표준지방산으로는 HP(Hewlett-Packard)사에서 제공하는 표준 지방산(calibration standard kit)을 사용하였으며, 균주의 배양은 한천(Sabouraud's agar; Difco, USA) 배지를 사용하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 배양된 균체를 시험관에 취한 다음 비누화 시약(Saponification reagent: 수산화나트륨 45 g, 메탄올 150 mL 및 증류수 150 mL) 1 mL를 가한 후 30분간 100℃에서 중탕 후 유수에 냉각하였다.

비누화된 균체를 6 N HCl 325 mL와 메탄올 275 mL의 혼합물 2 mL를 가한 다음 80℃에서 10분간 메틸화(Methylation)시키고, 헥산 200 mL과 메틸-t-부틸에테르 200 mL의 혼합물 1.25 mL를 가한 다음 10분간 상온에서 천천히 진탕한 후 하층액을 제거하여 세포 지방산을 추출하였다. 5.4% NaCl로 세척한 다음 분석용 시료로 사용하였다. 분석용 시료는 GC를 사용하여 분석한 후 MIDI사의 균주 동정 프로그램인 Sherlock 프로그램을 통하여 분석하였다.

16S rDNA 유전자 분석은 DNA 정제 키트(Wizard Genomic DNA Prep Kit, Promega)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 반응조건은 94℃에서 1분간 변성하고, 60℃에서 1분 30초간 어닐링시킨 후, 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 총 30회 반복하였다. 이때 사용한 프라이머는 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGC TCAG-3'; 서열번호 1)와 1492r(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 2)를 사용하였다. 증폭 단편(16S rDNA 영역)을 pGEM T 이지 벡터(Promega)에 삽입하고, 숙주세포로 E. coli DH5α를 사용하여 일반적인 분자 클로닝(Molecular Cloning) 방법에 의하여 형질전환시킨 후, DNA 정제 시스템(Wizard Plus SV miniprep DNA purification system)을 이용하여 플라스미드를 정제(Mini-preparation)하고, 자동 DNA 서열화기기(ABI 3700, Applied Biosystems Inc.)를 사용하여 서열화하였다. Clustal X(ver. 1.8) 소프트웨어를 사용하여 서열을 rRNA 이차구조를 참고하여 배열(alignment)한 후, 유사도(simmilarity, %) 값을 구하였다. 또한 “Advanced Blast search”를 통하여 Genebank의 염기서열과 비교하였고, Treeview(ver. 1.66)을 이용하여 계통수(phylogenetic tree 및 dendrogram)는 이웃결합 분석(neighbor-joining analysis; Lee JS, et al ., Int . J. Syst . Bacteriol., 2002, 52:2110-2123)에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때 계통수의 스케일바(scale bar)는 부위당 0.1 치환을 의미한다.

Clustal X(ver. 1.8) 소프트웨어를 사용하여 16S rDNA 유전자 배열(alignment)을 행하여 서열번호 3의 1,674 bp 염기서열을 결정하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 또한 도 1에서 상기 분리 균주의 세포 지방산 성분을 검토한 결과, 주성분은 16:0과 19:0 사이클로프로판 w8c로 각각의 함량은 20.29%와 24.37%를 나타내었다. 특이적으로 19:0 사이클로프로판 w8c와 17:0 사이클로프로판의 함량이 높게 나타났다. 이는 Leuconostoc 속 유산균은 평균 11.29%와 0.38%를 가지고 있으며(Giraud E, et al ., Applied Microbiology and Biotechnology, 1991, 36:379-383) Enterococcus 속 유산균은 17:0 사이클로프로판 없이 19:0 사이클로프로판 w8c만 미량(2.5%) 가지고 있으며(Grazia FM, et al., nov . Inter . J. Sys . Evol . Micro ., 2004, 54:1717-1721), Streptococcus 속 및 Lactobacillus 속 유산균의 경우 39.8% 및 10.7%를 함유하고 있다는 보고(Goldberg I, et al ., Appl. Environ . Microbio., 1977, 33:489-496)와 비교 시 일치하는 점을 찾을 수 없었다. 대조물들(references)과 비교한 결과도 Leucomostoc pseudomesenteroides과는 약 33.6%의 유사도를 나타내었으며, Lactobacillus fermentum과는 약 22.9%, Tetragenococcus halophila와는 약 21.5%로서, 극히 낮은 유사도를 보였으나, Entrococcus faecium 표준균주와는 95.7%의 유사도를 나타내어 Entrococcus속에 속하는 세균임을 확인하였다. 그러나, 본 발명에서 분리한 균주와 Entrococcus faecium IFO13712를 비교한 결과(Youko S, et al ., Microbiology, 2003, 149:2901-2908)(도 2), 두 균주 사이의 비교가 불가능할 만큼 많은 차이를 보이고 있어 지금까지 보고되지 않은 새로운 미생물일 가능성이 높았다.

따라서, 본 발명에서 분리한 균주가 지금까지 발견된 유산균들과 다른 새로운 종이라 판단하여 이를 "Enterococcus sp. TO-94"라 명명하였으며, 2010년 1월 12일자로 (사)한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KFCC11477P를 부여받았다.

[실시예 2] 유산균의 배양

상기 실시예 1에서 분리한 Enterococcus sp. TO-94는 40% 글리콜 용액에서 -80℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 균의 증식은 1% CMC가 첨가된 MRS 배지에 10% 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 Spectronic 401 분광광도계(Milton Roy, paris, France)를 사용하여 600 nm에서 균의 생육(A600 vs. cfu/ml)을 측정하였다. 배양 후 14,000 g×10분간 원심분리하여 균체를 모았다. 이 균체를 생리 살균(physiological sterile) 용액(0.9%, w/v 식염수)에 세척 후 동일 조건으로 재원심분리하여 오미자 발효의 접종균으로 사용하였다. 발효 동안 유산균의 성장은 단계희석 후 생균수를 측정하였다.

[실시예 3] 유산균에 의한 오미자 발효

Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자의 발효는 다음과 같이 수행하였다.

본 발명에서는 전북 장수 농협에서 구입한 오미자를 -20℃에서 냉동 보관하면서 사용하였다. 냉동 보관한 오미자에 동량(W/V)의 정제수를 첨가한 후 균질기(homogenizer)를 사용하여 씨가 분쇄되지 않게 주의하면서 파쇄하였다.

유산 발효를 위한 발효균(starter)을 접종하기 위하여 오미자 과피에 존재하는 오염균을 제거하기 위하여 파쇄된 오미자 용액을 75℃에서 10분간 가열 살균하였다. 발효균으로 사용된 Enterococcus sp. TO-94는 생리 식염수에 희석하여 8.0 cfu/ml를 접종하고 37℃에서 72시간 배양하였다. 배양 후 균체, 씨 및 미발효 부산물을 여과하여(whatman No.5)제거하고 청징 상등액을 발효물로 사용하였다. 이때 발효액의 양은 160 g/오미자 원과 100 g 이었으며, 수율은 160% 이었다.

[시험예 1] pH 및 산도의 측정

< Enterococcus sp. TO-94의 생육 곡선>

일반적으로 유산균은 당을 발효하여 유산을 생성하는 미생물로 식품의 부패 및 식중독 유발균의 생육을 억제하는 등 다양한 기능성을 부여하는 미생물이다. 본 발명에서는 오미자 생과를 발효하기 위하여 셀룰로오스 분해 활성을 나타내는 유산균 Enterococcus sp. TO-94를 MRS 배지 및 오미자 파쇄액에 각각 접종하여 37℃에서 배양하면서 4시간 간격으로 균의 생육을 비교하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다[■: 오미자 파쇄액, 및 ●: MRS 배지].

도 3의 결과에서, MRS 배지에서 생육 시 접종 4시간부터 대수 증식기가 시작되어 12시간 후에 정지기에 도달하였다. 반면, 오미자 파쇄액에 접종 시 접종 8시간까지 유도기가 지속되었으며, 대수 증식기 또한 20시간까지 지속되었다. 이는 발효에 이용되는 당의 함량이 4.05%로(Hyun HK, et al ., Korean J. plant Res., 2002, 15:1-7) 과실 자체에 발효성 당이 거의 없고 영양원으로 이용될 수 있는 성분이 적기 때문인 것으로 판단되며, 발효가 진행됨에 따라 비발효성 고분자 성분이 분해되면서 유산균의 생육이 증가되는 것으로 판단된다.

<pH 측정>

상기 실시예 3의 발효과정 중 4시간 마다 pH 측정기(sp-701, Suntex Inc. Korea)로 pH를 측정하였으며, 산도는 AOAC법(#)에 의하여 발효액 20 mL를 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1 N NaOH 용액으로 적정한 후 0.1 N NaOH 소요량을 젖산 함량(%)으로 환산하였다. 이때 pH 및 산도의 유의적 변화는 관찰되지 않았다.

<유기산 측정>

또한 오미자 발효물의 유기산의 측정은 2008년도 건강 기능성 식품공전(Lee JS, et al., J. Microbiology, 1996, 34:225-228)에 준하여 C18 카트리지에 ACN/DW(1:1) 10에 오미자 발효액 10 ml를 가하여 초기 용출액 4∼5 ml를 제거 후 시세이도 HPLC 시스템(Shiseido; 일본 도쿄 소재)을 사용하여 측정하였다. 유기산의 분석 조건은 하기 표 2와 같다.

컬럼	Prevail Organic acid, 5 ㎛(4.6× 250 mm)
온도	40℃
주입량	10 μL
이동상	25 mM Kh2PO4 pH 2.5
유속	1 ml/min
검출기	PDA 검출기(210 nm)

Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자의 발효 과정 중 유기산의 함량 변화를 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

유기산	함량(mg/g)
	0 시간 후	20시간 후
옥살산	0.18	0.03
L-타르타르산	검출안됨	1.83
포름산	2.20	검출안됨
L-말산	18.91	14.17
L-젖산	검출안됨	9.84
아세트산	0.38	2.08
구연산	37.41	36.35
숙신산	검출안됨	검출안됨

상기 표 3의 결과에서 알 수 있듯이, 발효 과정 중 다양한 유기산의 변화가 측정되었다. 주산물인 젖산의 함량이 0에서 9.84 mg/g로 상승되었으며, 특이적으로 아세트산과 L-타르타르산의 함량 또한 0.38에서 2.08 mg/g와 0에서 1.83 mg/g으로 상승되었다. 반면, 옥살산, 포름산 및 말산의 함량이 감소하는 결과를 보였다. 또한 구연산은 변화를 나타내지 않았다. 전체적인 산도의 큰 변화없이 함량의 변화가 나타나는 결과를 보였다,

[시험예 2] 당도 및 유리당 측정

상기 실시예 3의 발효과정 중 4시간 마다 발효액을 취하여 당도계(Master-M, Atage, Tokyo, Japan)를 사용하여 당도를 측정하였고, 유리당은 멤브레인 필터(0.45 μM)로 여과 후 시세이도 HPLC 시스템(Shiseido; 일본 도쿄 소재)으로 분석하였다. 유리당의 분석 조건은 하기 표 4와 같다.

컬럼	아사히팩 NH2P-50 4E (4.6× 250 mm)
온도	35℃
주입량	20 μL
이동상	78% ACN
유속	1 ml/min
검출기	RID

Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자의 발효 과정 중 유리당 함량 및 총 당의 함량 변화를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다[■: 말토오스, ▲: 수크로오스, ●: 글루코오스, ※: 프럭토오스, 및 ◇: 총 당 함량].

도 4의 결과에서, 프럭토오스 및 글루코오스의 함량은 발효 20시간 후 5.83 및 4.30 mg/g으로 발효과정 동안 증가하였으나, 이당류인 수크로오스 및 말토오스는 발효 8시간 후 6.0 및 3.0 mg/g으로 증가되었으나 발효 20시간 후 각각 0.35와 0.90 mg/g으로 감소되었다. 이는 초기에는 Enterococcus sp. TO-94에 의한 비발효성 당의 분해에 기인하여 이당류의 증가가 나타났으며, 이후 균 생육의 영양원으로 이당류가 사용된 것으로 판단된다. 또한, 총 당의 함량이 1.8 Brix에서 10.2 Brix로 약 5배 증가하였다. 이는 탄소원의 부족으로 발효식품의 개발이 어려운 오미자의 발효식품의 개발에도 큰 역할을 할 것으로 판단된다.

[시험예 3] 비타민의 측정

오미자 발효물의 비타민의 측정은 건강 기능성 식품공전 미량 성분시험법에 준하여 시세이도 HPLC 시스템(Shiseido; 일본 도쿄 소재)을 사용하여 측정하였다. 비타민의 분석 조건은 하기 표 5와 같다.

컬럼	캅셀팩(Capcell pak) C18 UG 120(3.0×250 mm)
온도	40℃
주입량	10 μL
이동상	비타민 B1, B6, 나이신(Nicine), 엽산	A: DW 957 ml + MeOH 25 ml + PicB7 20 ml B: DW 500 ml + MeOH 500 ml + PicB7 20 ml
	비타민 B2	A: 10 ml NaH2PO4 in DW(1 L)(pH 5.5) B: MeOH A:B=78:22
	판토텐산(비타민 B5), 비타민 C	20 ml NaH2PO4(pH 2.1):ACN=98:2
	사이아노코발라민 바이오틴 (Cyanocobalamin Biotine)	A:5 mM KH2PO4 + 0.1% 인산 B:5 mM KH2PO4/MeOH=80/20 A:B=500:10
	비타민 K	MeOH
유속	1 ml/min
검출기	PDA 검출기(210 nm, 248 nm) 및 UV 검출기(200 nm, 270 nm)

Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자의 발효 과정 중 비타민의 함량 변화를 측정한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

비타민 종류	함량(mg/100g)
	0시간 후	20시간 후
B1	0.19	0.52
B2	0.024	0.08
B5	3.5	검출안됨
B6	검출안됨	검출안됨
B7	검출안됨	검출안됨
나이신	0.83	1.44
엽산	502,05	901.26
B12	검출안됨	검출안됨
C	12.65	38.0
K1	검출안됨	검출안됨
β-카로틴	검출안됨	검출안됨

상기 표 6의 결과에서, 비타민 B₁, B₂, 나이신, 엽산 및 C가 주를 이루고 있으며 발효 전에 비하여 모든 비타민이 약 1.5∼3배 가량 증가하였다. 발효 전 함량은 분쇄 착즙한 것으로 용출의 효율성과 관련이 있는 것으로 판단된다. Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자의 발효 과정 중 세포벽을 구성하는 섬유질의 분해에 의해 용출 효율이 증가함으로써 함량이 증가된 것으로 판단된다.

오미자는 열수 및 물과 알코올 추출이 주를 이루고 있어(Kim SI, et al ., The Korean journal of food and nutrition, 2009, 22:41-47; Choi EO, et al ., Korean journal of biotechnology and bioengineering, 2008, 23:271-275; Kwon HJ, et al ., Korean journal of food preservation, 2008, 15:587-592; Kim HK, et al ., Journal of the Korean society of food culture, 2004, 19:484-490; 및 Kim SI, et al ., Korean J Food and nutr., 2009, 22: 41-47) 비타민 함량에 대한 예를 찾아보기 어렵다. 가온 및 용매에 의한 비타민의 소실 및 용해도 저하에 기인한 것으로 판단된다. 따라서, 섬유소 보호능을 갖는 유산균에 의한 발효방법은 영양적으로 향상된 오미자 식품의 개발에 유용한 것으로 판단된다.

[시험예 4] 발효과정 중 폴리페놀 및 안토시아닌 함량의 변화

<총 페놀성 화합물의 측정>

상기 실시예 3의 오미자 발효물을 10배 희석한 5 mL에 Folin-Ciocalteu 시약 5 mL를 가하여 혼합하고 3분후 10% Na₂CO₃ 용액(w/v) 5 mL를 넣어 진탕하고 실온에서 방치한 다음 700 nm에서 비색정량하였다. 타닌산(Tannic acid)을 표준물질로 작성한 검량곡선으로부터 총 페놀성 화합물의 함량을 측정하였다.

<안토시아닌 측정>

상기 실시예 3의 오미자 발효물 10 mL를 0.1% HCl-80% MeOH 용액(v/v) 40 mL에 혼합하고 24시간 진탕 추출하였다. 추출된 색소는 3,000 g×10분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 0.1% HCl-80% MeOH 용액(v/v)으로 100 mL로 정용한 후 528 nm에서 비색정량하였다. 시아니딘(cyanidine)을 표준물질로 작성한 검량곡선으로부터 안토시아닌 함량을 측정하였다.

Enterococcus sp. TO-94에 의한 오미자의 발효 과정 중 폴리페놀 및 안토시아닌의 함량 변화를 측정한 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

유기산	함량
	0시간 후	20시간 후
폴리페놀(%)	0.211	0.823
안토시아닌(㎍/mL)	45.23	51.40

상기 표 7의 결과에서, 폴리페놀의 경우 발효초기 0.211%에서 20시간 후 0.823%로 약 3.8배 증가하였으며, 안토시아닌의 경우 또한 45.23 ㎍/ml에서 51.40 ㎍/ml로 약 1.2배 상승하였다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11477 20100112

<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Ferments of Schisandra chinensis, the method for fermenting thereof and the food composition containing the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1425 <212> DNA <213> 16S rDNA of Enterococcus sp. TO-94 <400> 3 agtcgaacgc ttctttcctc ccgagtgctt gcactcattg gaaagaggag tggcggacgg 60 gtgagtaaca cgtgggtaac ctacccatcg gagggggata acacttggaa acaggtgcta 120 ataccgcata acagtttatg ccgcatggca taagagtgaa aggcgctttc gggtgtcgct 180 gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggccacga 240 tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300 tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg agcaacgccg 360 cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa caaggacgtt 420 agtaactgaa cgtcccctga cggtatctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc 480 agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc 540 aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa 600 ctgggagact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta 660 gatatatgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgtaactg acgctgaggc 720 tcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga 780 gtgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag caaacgcatt aagcactccg 840 cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900 gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt 960 tgaccactct agagatagag ctttcccttc ggggacaaag tgacaggtgg tgcatggttg 1020 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattgt 1080 tagttgccat catttagttg ggcactctag cgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140 tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg 1200 gaagtacaac gagtcgctag accgcgaggt catgcaaatc tcttaaagct tctctcagtt 1260 cggattgcag gctgcaactc gcctgcatga agccggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1320 acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt 1380 gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt ttggagccag ccgcc 1425

Claims (3)

1. 기탁번호 KFCC11477P의 Enterococcus sp. TO-94로 발효시킨 오미자 발효물.
2. 1) 오미자에 동량(v/v)의 물을 첨가한 후 균질기(homogenizer)를 사용하여 파쇄하는 단계;
   2) 상기 1)의 파쇄물을 70∼75℃에서 5∼10분간 가열살균하는 단계;
   3) 기탁번호 KFCC11477P의 Enterococcus sp. TO-94를 생리 식염수에 희석한 희석액을 준비하는 단계; 및
   4) 상기 2)의 살균 파쇄물에 3)의 희석액을 혼합한 다음 37℃에서 72시간 배양하는 단계;
   를 거쳐 오미자를 발효시키는 방법.
3. 제 1항에 의한 오미자 발효물을 함유하는 식품 조성물.

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