CN110004077B - 一种能水解黄酮碳苷类化合物的碳苷键的菌株及其应用 - Google Patents

一种能水解黄酮碳苷类化合物的碳苷键的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从人肠道菌群中分离得到的能够水解黄酮碳苷的碳苷键的菌株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及其所含酶系。该菌株及其酶系能够把多种黄酮碳苷类化合物水解为其完整的苷元和相应的糖基。其催化的水解反应具有特异性高，水解能力强，经济和环保等特点，可用于医药、食品制造和研发以及化合物的结构鉴定。

Description

一种能水解黄酮碳苷类化合物的碳苷键的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种能水解黄酮碳苷类化合物的碳苷键的菌株及其应用。
背景技术
黄酮碳苷类化合物是自然界中天然存在的一类化合物，其主要特征是糖基以C-C键直接与黄酮母核相连(吴新安等.解放军药学学报，2005，21(2)：135-138)。其糖基常连接在黄酮A 环C-6或者C-8位，形成非常稳定的糖苷结构。这类化合物在开花植物中分布较多，最常见的苷元为木犀草素和芹菜素，其C-6或者C-8位与葡萄糖基连接，分别形成牡荆素、荭草素、异牡荆素、异荭草素等(龚金炎等.天然产物研究与开发，2010，22(3)：525-530)。由于黄酮碳苷类化合物的碳苷键非常稳定，仅通过化学方法几乎不能将碳苷键水解，得到其完整的苷元和相应的糖部分。根据文献报道(Xu J，et a1.J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci， 2014，944(3)：123-127；Hattori M，et al.J Nat Prod，1988，51(5)：874.)，人肠道菌群中存在一些特殊的菌株能够水解C-C糖苷键得到完整的苷元和糖基。因此，从人肠道菌中寻找并分离含有特殊水解酶的菌株是解决从碳苷类得到其完整苷元的有效手段。
发明内容
本发明提供了一种从人肠道菌丛中分离得到的能够水解黄酮碳苷的碳苷键的菌株及其所含酶系，该菌株及其酶系可用于医药、食品制造和研发以及化合物的结构鉴定。经分子生物学方法和形态学鉴定，该菌株被确定为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，命名为Enterococcus faecalis 2016-W12-1。菌株自身及其所含的酶能够把多种黄酮碳苷类化合物水解为其完整的苷元和相应的糖基。本发明提供的菌株及其酶系催化的水解反应具有特异性高，水解能力强，经济和环保等特点。经实验测定，该菌株及其所含酶系催化碳苷键水解的效率在24h内可达 100％，且无副反应发生。
本发明提供的细菌菌株的形态特征为：粪肠球菌Enterococcus faecalis 2016-W12-1，革兰氏阳性球菌。在TPY培养基中，37℃厌氧培养24h，菌体呈椭球型，0.5～1.0μm，单个、成对或呈簇排列；菌落呈米白色，圆形，表面湿润，凸起，半透明，边缘整齐。
本发明提供的菌株及其酶系能够特异性地水解碳苷类化合物，优选具有黄酮母核的C-6 和C-8位碳苷类化合物，最优选荭草素、牡荆素和异牡荆素等黄酮碳苷，由此导致其在医药、食品制造和研发以及化合物结构鉴定中的应用。
所述菌株保减证明如下：
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏编号：17244
分类命名：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)
保藏日期：2019年01月29日
附图说明
图1是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1转化荭草素的高效液相色谱图及其时间-转化效率曲线
如图1所示，A为转化前样品的高效液相色谱图，其中a为检测到的荭草素的色谱峰；B 为转化后样品的高效液相色谱图，其中b为检测到的苷元木犀草素的色谱峰；C为菌株转化荭草素的时效曲线。
图2是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1转化牡荆素的高效液相色谱图及其时间-转化效率曲线
如图2所示，A为转化前样品的高效液相色谱图，其中a为检测到的牡荆素的色谱峰；B 为转化后样品的高效液相色谱图，其中b为检测到的苷元芹菜素的色谱峰；C为菌株转化牡荆素的时效曲线。
图3是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1转化异牡荆素的高效液相色谱图及其时间-转化效率曲线
如图3所示，A为转化前样品的高效液相色谱图，其中a为检测到的异牡荆素的色谱峰； B为转化后样品的高效液相色谱图，其中b为检测到的苷元芹菜素的色谱峰；C为菌株转化牡荆素的时效曲线。
图4是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1所含酶系转化荭草素的高效液相色谱图
如图4所示，其中a为转化后样品中苷元木犀草素的色谱峰。
图5是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1所含酶系转化牡荆素的高效液相色谱图
如图5所示，其中a为转化后样品中苷元芹菜素的色谱峰。
图6是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1所含酶系转化异牡荆素的高效液相色谱图
如图6所示，其中a为转化后样品中苷元芹菜素的色谱峰。
图7是菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1的形态特征照片
如图7所示，其中A为菌落的宏观照片；B为菌株的显微照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
本发明水解黄酮碳苷的菌株粪肠球菌Enterococcus faecalis 2016-W12-1的分离、筛选及其鉴定：
(1)粪肠球菌的分离与筛选
本发明的菌株来源于人源粪便。
A.取自封袋，充满氮气，封口。装入新鲜粪便，封口。用手挤压自封袋，使粪便均质化。在无菌操作条件下，取3～5g粪便，放入已灭菌且装有培养基的具塞三角瓶中。置厌氧培养箱中，在37℃下培养24h。从三角瓶中取出菌液1mL，加至10mL螺口试管中并加9mL培养基，在37℃活化培养24h，即为人肠内细菌混合菌丛悬液；
B.取上述菌悬液1mL，用生理盐水10倍稀释，从中吸取悬浮液0.1mL，用无菌涂布器涂于GAM固体培养基平板上，以无菌水为对照，涂布均匀后于厌氧箱内37℃恒温倒置培养；
C.连续培养48h，挑取菌落形态不同的菌株，37℃、厌氧条件下静置培养24h，获得多株肠道菌细菌菌株，并4℃保存备用。
D.吸取活化的肠道菌菌株130μL加到含有荭草素纯品的含药GAM培养基中，对照组以无菌水代替菌液，空白组以无菌水代替含药培养基。37℃下恒温、厌氧静置培养24h。
E.分别取转化后样品200μL，置于1.5mL EP管中，在4℃，14800rpm离心15min除菌。取上清液150μL，加入甲醇450μL，混匀。再在4℃，14800rpm离心15min除去蛋白。各取上清液500μL，用于液相分析以筛选出具有水解黄酮碳苷能力的单一菌株。
F.取上述目的菌株菌液1mL，用生理盐水10倍稀释，再次在平板培养基上进行划线纯培养，获得纯净的功能菌株，并在4℃保存备用。
(2)菌株鉴定
A.粪肠球菌Enterococcus faecalis 2016-W12-1在TPY固体培养基(每1000mL含水解酪蛋白10.0g，大豆胨5.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖5.0g，L-半胱氨酸0.5g，磷酸氢二钾2.0g，氯化镁0.5g，硫酸锌0.25g，氯化钙0.15g，氯化铁0.000001g，琼脂20.0g，吐温801.0g，去离子水1000mL，pH6.5)上，菌落呈米白色，圆形，表面湿润，凸起，半透明，边缘整齐。
B.通过显微镜观察表明Enterococcus faecalis 2016-W12-1菌体呈椭球形，0.5～1.0μm，单个、成对或成簇排列，革兰氏阳性。
C.菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1生理生化特征如表1所示。
表1 Enterococcus faecalis 2016-W12-1菌株的生理生化特征
Figure BSA0000180572910000031
Figure BSA0000180572910000041
符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性。
D.经测序，菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1的16S rDNA序列如下所示。
Figure BSA0000180572910000042
Figure BSA0000180572910000051
根据16S rDNA的测序结果，通过NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，并在Genbank上下载肠球菌属中的模式菌株序列数据矩阵，采用MEGA5.0软件用邻位连接法构建系统发育树，进行1000次的相似度重复计算。发现菌株2016-W12-1与肠球菌属Enterococcus faecalis的同源性最高。结合菌株的形态特征、生理生化特征以及系统发育树分析，发现菌株2016-W12-1与菌株Enterococcus faecalis ATCC19433(ASDA01000001) 亲缘性最近，并聚在同一分支中，表明该菌株为Enterococcusfaecalis，并命名为粪肠球菌 Enterococcus faecalis 2016-W12-1。
本发明的粪肠球菌Enterococcus faecalis 2016-W12-1已于2019年01月29日保减于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例2
菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1对荭草素的生物转化
A.吸取活化的粪肠球菌菌株130μL加入到含有荭草素对照品的含药GAM培养基中，对照组以无菌水代替菌液，空白组以无菌水代替含药培养基。37℃下恒温、厌氧静置培养24h。
B.分别取转化后样品200μL，置于1.5mLEP管中，在4℃，14800rpm离心15min除菌。取上清液150μL，加入甲醇450μL，混匀。再在4℃，14800rpm离心15min除去蛋白。各取上清液500μL，用于高效液相分析。由图1可知，在24h内目的菌株能够完全降解荭草素生成相应苷元木犀草素。转化效率可达到100％。
实施例3
菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1所含酶系对荭草素的生物转化
A.吸取活化的粪肠球菌菌株130μL加入到GAM培养基中，37℃下恒温、厌氧静置培养 24h。4℃，10000rpm离心10min，取上清经0.22μm无菌微孔滤膜过滤除菌，取续滤液即为菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1所含酶系。吸取荭草素对照品溶液于3mL粗酶液中，对照组以无菌水代替粗酶液，空白组以无菌水代替荭草素对照品溶液。37℃下恒温、厌氧静置培养24h。
B.分别取转化后样品200μL，置于1.5mL EP管中，在4℃，14800rpm离心15min除菌。取上清液150μL，加入甲醇450μL，混匀。再在4℃，14800rpm离心15min除去蛋白。各取上清液500μL，用于高效液相色谱分析。由图2可知，在24h内菌株2016-W12-1所含酶系能够完全降解荭草素生成相应苷元木犀草素。转化效率可达到100％。
实施例4
菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1及其所含酶系对其他碳苷类化合物的生物转化
采用菌株2016-W12-1及其所含酶系对牡荆素和异牡荆素进行了生物转化实验，实验方法同实施例2和3，结果表明，菌株Enterococcus faecalis 2016-W12-1及其所含酶系可以完全转化牡荆素和异牡荆素，并生成其完整的苷元和相应的糖部分。

Claims (3)

1.一株水解黄酮碳苷类化合物的碳苷键的粪肠球菌Enterococcus faecalis，其编号为CGMCC No.17244。
2.如权利要求1所述的粪肠球菌Enterococcus faecalis在水解黄酮碳苷类化合物的碳苷键中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黄酮碳苷类化合物包括荭草素、牡荆素、异牡荆素。
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