CN110093302A - 一种乳杆菌突变菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过化学诱变获得了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)突变菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17859。本发明的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859能够催化乙酰乙酸酯转化成R‑β‑羟基丁酸酯，催化能力较原始菌种提高了十二倍，产物浓度高达2.78g/L，且手性纯度达到91％，具有工业化开发和应用前景。

Description

一种乳杆菌突变菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，涉及一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)突变菌株及其用于催化乙酰乙酸酯转化生成R-β-羟基丁酸酯的用途。
背景技术
R-β-羟基丁酸酯又名(R)-3-羟基丁酸酯，是具有下述结构式的手性化合物：
其中R例如为C1-C4烷基。R-β-羟基丁酸酯类化合物具有双官能团，其聚合物形式如聚β-羟基丁酸酯(PHB)是一种生物合成塑料，具有良好的生物相容性、生物降解性，被广泛应用于各种环保型高分子材料，如包装材料、生物降解薄膜、药物缓释控释材料、骨科及医用手术缝合材料等。除此之外，具有光学纯的R-β-羟基丁酸酯及R-β-羟基丁酸盐也是手性助剂、医药、农用化学品、香料、保健品等领域中的重要中间体。
R-β-羟基丁酸酯目前主要通过化学合成法制备，主要有两种方式：一是由乙醛与烯酮在Zn盐存在下反应，生成β-内酯，有β-内酯的水解制备手性β-羟基丁酸酯；另一种是利用Reformatsky反应，通过将Zn加到α-卤代酯(通常是α-溴代酯)与乙醛的乙醚(或芳烃)溶液中，制得手性β-羟基丁酸酯。化学制备方法中，使用金属离子或者氰化物，反应条件严苛，而且对环境污染比较大，手性纯度较低，成本相对来说比较高，因此，工业化应用前景一直不是好。
为了克服化学合成法的上述缺点，使用绿色环保、反应条件温和的生物制备方法比如微生物发酵或生物酶催化法成为一种研究开发趋势。虽然有报道称R-β-羟基丁酸酯的下游产物R-β-羟基丁酸可以通过生物法即发酵法制备，例如2017年Hiroto Yokaryo等利用Halomonas sp.OITC1261直接发酵制备出了R-3羟基丁酸，产量高达58g/L；2018年NicholasM.Thomson等利用大肠杆菌基因工程菌发酵获得了R-3-羟基丁酸，产量可达39.4g/L，但由于直接发酵法杂质含量高、产物完全溶于水导致提取工艺复杂、成本高，现在还未能大规模产业化。而对于R-β-羟基丁酸酯生物法制备，中国专利申请CN101210258A报道了一种膜醭毕赤酵母(Pichia membranaef aciens Hansen)可以催化乙酰乙酸乙酯进行不对称还原反应得到R-3-羟基丁酸乙酯，但该研究再无后续进展。目前还没有报道哪一种生物制备法具有工业化生产R-3-羟基丁酸酯的可行性。
发明内容
为了探索微生物酶催化法制备R-3-羟基丁酸酯的工业化途径，发明人对于众多微生物的代谢途径和酶系进行了广泛的研究，发现一些包括乳杆菌属(Lactobacillus)在内的微生物表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶，能够将乙酰乙酸酯选择性还原为具有光学活性的β-羟基丁酸酯(R-或S-构型)。进一步筛选发现，有10种乳杆菌能够立体特异性地将乙酰乙酸酯选择性还原为R-β-羟基丁酸酯。但是，这些乳杆菌的催化活力都相对较低，成为工业化应用的最大瓶颈。为了提高这些乳杆菌的酶活性，我们通过化学诱变剂加压力筛选的方式对这些菌株进行了诱变筛选，得到了一种具有工业化应用前景的鼠李糖乳杆菌突变菌株。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)突变菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17859。本公司命名为HR-460。
本发明的第二个目的在于提供所述鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859用于生产R-β-羟基丁酸酯的应用。
在一种实施方式中，上述应用是通过酶催化生产R-β-羟基丁酸酯的方法，即，以鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859菌体或者其细胞破碎物(例如细胞破碎液)为催化剂，以乙酰乙酸酯为底物，通过立体选择性羰基还原反应制备R-β-羟基丁酸酯。
优选地，上述乙酰乙酸酯是乙酰乙酸甲酯或者乙酰乙酸乙酯，相应的还原产物R-β-羟基丁酸酯是R-β-羟基丁酸甲酯或者R-β-羟基丁酸乙酯。
在一种优选的实施方式中，上述反应体系中还添加有NADPH。其浓度可以是2-10mM例如5mM。NADPH的作用是在氧气参与下作为羰基还原酶的辅因子。
优选地，上述反应体系中还可以添加有葡萄糖和NADP+。NADP+的浓度可以是2-10mM例如5mM。其中NADP+的作用是，葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化，同时将NADP+还原为NADPH，产生充足的NADPH，从而促进羰基还原酶对乙酰乙酸酯的选择性还原反应。
上述反应体系优选优选是缓冲溶液体系，例如磷酸缓冲溶液或者Tris缓冲溶液。
上述反应体系为pH6.5-7.8、优选pH6.8-7.5、更优选pH7.0。
上述反应温度是25-40℃、优选28-35℃、更优选30℃。
相比原始菌株CGMCC No.1.2134，本发明通过化学诱变筛选出的鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859催化乙酰乙酸酯转化成R-β-羟基丁酸酯的酶活力提高了十二倍。该酶催化反应条件温和，易控制，生物安全性高，产物浓度高达2.78g/L，且手性纯度达到90％以上，具有工业化开发和应用前景。
本发明筛选的鼠李糖乳杆菌的拉丁学名是Lactobacillus rhamnosus，中文名称是鼠李糖乳杆菌，即鼠李糖乳酸杆菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2019年05月27日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.17859。
具体实施方式
R-β-羟基丁酸酯是具有光学活性的手性化合物，例如R-β-羟基丁酸乙酯的比旋光度[α]20/D为-45.5°(589nm，c＝1，CHCl3)。
乙酰乙酸酯是在具有高度立体选择性的羰基还原酶催化下发生羰基还原反应而转化成R-β-羟基丁酸酯的。研究发现鼠李糖乳杆菌中产生的羰基还原酶具有这种立体选择性。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，LGG)是上世纪80年代由两位美国科学家Gorbach和Goldin从健康人的肠道中分离出来的第三代益生菌，具有平衡和改善胃肠道、增强人体自身免疫、预防和帮助治疗腹泻、减少受感染的几率，比如呼吸道感染、预防龋齿、预防过敏、增强肠道粘膜屏障等功能。该菌株入选了2010年我国卫生部印发的关于《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)，被广泛的应用于酸奶、酸奶饮料、牛奶、奶粉、奶酪，果汁饮料、胶囊等。该菌株的生物安全性是本发明的重要优势，相比致病性或者潜在致病性的微生物比如某些大肠杆菌，由于不产生细菌内毒素等有害物质，因此可以保障其生产安全性，其产物更容易被产品用户和各个国家食品和药品监督管理局批准进入市场，有助于商业上取得成功。对于R-β-羟基丁酸酯的后期羟基丁酸类产品在保健品、医药方面的应用提供了一个很好的生物产业化平台。
由于原始菌株CGMCC No.1.2134的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的酶活力较低，要想实现其催化乙酰乙酸酯选择性羰基还原反应的工业化应用潜力，需要努力提高其酶活力。众所周知，诱变育种是微生物改良常用的和有效的手段，人工诱变改良菌种的方法至今仍不失为选育高产菌的有效手段，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子(如紫外线、X射线、快中子等)、化学诱变剂(如氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等)和生物诱变因子(如噬菌体)三大类，它们都能够提高生物体突变频率，同时又造成生物体的大量死亡。发明人采用亚硝基胍作为诱变剂进行化学诱变、然后以添加乙酰乙酸酯生长培养基压力筛选的方式，获得一株诱变菌种，该突变菌株明显提高了催化活力，催化乙酰乙酸乙酯转化的产物浓度高达2.78g/L，且手性纯度达到90％。
作为一种优选的实施方式，可以采用微生物菌体作为酶催化的生物催化剂，因为当鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。此时菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。由于反应底物乙酰乙酸酯和反应产物R-β-羟基丁酸酯都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
可替代地，鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859发酵后的微生物菌体可以经受细胞破碎处理成为粗酶液例如细胞破碎液，用于催化羰基还原反应。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的乳杆菌菌株由洛阳华荣生物技术有限公司提供。
化学试剂均为分析纯，购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
旋光仪型号：Rudolph Autopol V
质谱仪(液质联用(LCMS))，型号：Agilent 6120 B，检测器为DAD，流动相A为0.2％磷酸水溶液，流动相B为100％乙腈溶液。检测条件：
时间(min) A B 流速(ml/min) 压力(bar)
25 55 45 1.0 400
实施例1：乳杆菌菌株筛选
对10株乳杆菌进行MRS液体培养基(1％蛋白胨，1％牛肉膏，0.5％酵母膏，0.2％柠檬酸氢二铵，2％葡萄糖，1‰吐温80，0.5％乙酸钠，0.2％磷酸氢二钾，0.058％硫酸镁，0.025％硫酸锰，5％乙酰乙酸酯，pH6.5)活化，30℃，150rpm培养2-4天，以5％菌浓转接至MRS液体摇瓶中，30℃，150rpm培养2天，收集菌体，加入100mM Tris·HCl(pH7.0)，2％乙酰乙酸乙酯，0.5M葡萄糖，5mM NADPH，5mM NADP+，30℃，150rpm孵育48h，检测各菌株中R-β-羟基丁酸乙酯的含量。结果显示一株鼠李糖乳杆菌显示孵育48h，有0.253g/L的R-β-羟基丁酸乙酯产生，其中R-β-羟基丁酸乙酯的手性纯度为88％。用于筛选的10株的菌种信息如下：
CGMCC No. 中文名称 拉丁文名称
1.8727 干酪乳杆菌 Lactobacillus casei
1.1856 植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum
1.2134 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus
1.2743 卷曲乳杆菌 Lactobacillus crispatus
1.3222 路氏乳杆菌 Lactobacillus reuteri
1.3223 发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum
1.3348 约氏乳杆菌 Lactobacillus johnsonii
1.3396 加氏乳杆菌 Lactobacillus gasseri
1.1878 嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus
1.1881 唾液乳杆菌 Lactobacillus salivarius
实施例2：鼠李糖乳杆菌的化学诱变及压力筛选
将上述鼠李糖乳杆菌(CGMCC No.1.2134)冻存菌株用MRS液体培养基于30℃，150rpm活化4天后，按照5％菌浓转接至新鲜MRS液体培养基中，30℃，150rpm培养2天后，将菌体制成108/ml的菌悬液，加入100ug/ml的亚硝基胍，30℃处理30min，诱变结束后，离心收集菌体，无菌水洗涤三次后，用无菌生理盐水将菌液重悬至107/ml。
重悬后的菌悬液接种取100μl涂布至压力筛选固体培养基(1％蛋白胨，1％牛肉膏，0.5％酵母膏，0.2％柠檬酸氢二铵，10％葡萄糖，1‰吐温80，0.5％乙酸钠，0.2％磷酸氢二钾，0.058％硫酸镁，0.025％硫酸锰，5％乙酰乙酸酯，2％琼脂粉，pH6.5)平板上，30℃培养5天，挑选长出的克隆株。共挑选400个菌落进行下一步的发酵培养筛选。
实施例3：高产R-β-羟基丁酸乙酯诱变菌落的筛选
以出发菌种CGMCC No.1.2134为阳性对照，将压力筛选长出的菌株，分别接种至含有800μl MRS液体培养基的96孔板中，30℃，250rpm，培养3天，离心收集细胞，加入200μl的反应液(100mM Tris·HCl(pH7.0)，2％乙酰乙酸乙酯，0.5M葡萄糖，5mM NADPH，5mM NADP+)，于30℃，150rpm孵育48h，检测培养基中R-β-羟基丁酸乙酯的含量，结果筛选获得一株鼠李糖乳杆菌HR-460产量高出发菌种约12倍的诱变菌种，且产物手性纯度液到达90％，反应48小时两株菌种的检测数据如下：
将鼠李糖乳杆菌HR-460向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏编号为CGMCC No.17859。
实施例4：诱变菌株HR-460生产R-β-羟基丁酸乙酯的应用
将1ml HR-460菌种冻存菌采用25ml MRS液体培养基摇瓶于30℃，150rpm培养3天活化，活化后菌种按照5％接种量，接种至150ml含有含有MRS液体培养基中，于30℃，150rpm，培养2天，离心收集细胞。配制如下反应体系：10％湿菌体，100mM Tris-HCl，2％乙酰乙酸乙酯，0.5M葡萄糖，5mM NADPH，5mM NADP+混匀，30℃，150rpm反应24h，结果检测反应液中R-β-羟基丁酸乙酯的含量为2.78g/L，产物ee值为91％。
上述实验证明，菌株CGMCC No.17859能够有效地催化乙酰乙酸乙酯转化成R-β-羟基丁酸乙酯，产物浓度高，且手性纯度高，具有工业化开发和应用前景。

Claims (10)

1.一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17859。
2.如权利要求1所述鼠李糖乳杆菌用于生产R-β-羟基丁酸酯的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，以鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859菌体或者其细胞破碎物为催化剂，以乙酰乙酸酯为底物，通过羰基还原反应制备R-β-羟基丁酸酯。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乙酰乙酸酯是乙酰乙酸甲酯或者乙酰乙酸乙酯，相应的R-β-羟基丁酸酯是R-β-羟基丁酸甲酯或者R-β-羟基丁酸乙酯。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，以鼠李糖乳杆菌CGMCC No.17859细胞为催化剂，以乙酰乙酸乙酯为底物，通过羰基还原反应制备R-β-羟基丁酸乙酯。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，反应体系中还添加有NADPH。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系中还添加有葡萄糖和NADP+。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系是缓冲溶液体系。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，反应体系为pH6.5-7.8。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应温度是25-40℃。
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