CN1824783A - 发酵转化米糠油脚生产香草酸和香草醛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以米糠油加工过程产生的废弃物(皂脚)为原料，通过微生物发酵转化生产香草酸与香草醛的方法。该方法利用发明人筛选并保藏的微生物菌株黑曲霉菌(Aspergillus niger)CGMCC 0774水解米糠油皂脚中的阿魏酸酯产生阿魏酸，并将其转化成香草酸，继而利用另一株朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)CGMCC 1115将香草酸转化为香草醛。采用本发明的方法生产香草醛，充分利用了稻米加工的废弃资源，缓解化学合成香草醛制造过程中对环境的污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产香草酸与香草醛的方法，尤其涉及一种以米糠油加工过程产生的废弃物(皂脚)为原料，通过微生物发酵转化生产香草酸与香草醛的方法，属生物催化领域。
背景技术
香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，俗称香兰素(vanillin)，是享有世界“食品香料之王”美称的香荚兰(Vanilla planifolia Andreurs)的主要成份，具有纯正的香荚兰豆香气及浓郁的奶味，气味幽雅清爽，是当今世界上重要的广谱型高档香料，被广泛应用于食品、饮料、烟草、酒类、化妆品、医药和化工等行业。
目前，“合成(artificial)”或半合成(semi-synthetical)的香草醛多数是由苯基石化原料如愈创木酚经Reimer-Tiemann反应或从木质素原料进行化学合成，虽然方法简单，能大规模生产，价格低廉，但却存在容易造成环境污染、采用的原料如愈创木酚有毒等弊端。从植物(Vanilla planifolia)提取的香草醛，由于受气候与地域的限制，产量少(年产约20吨)，价格昂贵($1,200~4,000/kg)。随着人们对食品安全性的重视，欧洲已建议在食品中使用天然香草醛，而不许可使用廉价的化学合成香草醛(European Directive 88/388/CEE，JO No.L184，22nd of June1988)。从天然原料经物理或生物方法加工的香料称天然香料，由生物转化生产的香草醛被称“生物香兰素(bio-vanillin)”，与植物提取的香兰素“天然等同(nature-identical)”。为满足人们对天然香草醛的需求，开发微生物或酶生产香草醛的方法，其中特别是由各种真菌培养液生物转化阿魏酸生产香草醛的方法被认为是一经济性的方法。(In the May 2000 edition of″Chemistry in Britain″，pages48-50)
阿魏酸由于与香草醛的化学相似性，在植物体内从葡萄糖转变为香草醛的整个过程中是一个重要的底物，因而被认为是一种很有前途的香草醛前体物质。Gross等(US5262315)发现P.cinnabarinus CNCMnDEG I-937或CNCMnDEG I-938能转化0.3g/L阿魏酸产生0.045g/L香草醛，摩尔转化率20.5％；转化香草酸生成香草醛，转化率35.1％。Lesage-Meessen等(US5866380，US 6,162,637)改用丝状真菌二步法生产香草醛，提高香草醛的产率。第一步用黑曲霉菌株Asp.niger MIC 373的发酵培养液，按每24小时加阿魏酸430mg/L均衡方式添加了5.05g/L阿魏酸。培养发酵15天后HPLC检测培养液中的香草酸最终浓度为3.60g/L，添加的阿魏酸完全消耗，很大部分转化为香草酸(82％)，小部分(2％)为代谢产物甲氧基氢醌，没有香草醛和香草醇；也可用Streptomyces setonii strain ATCC 25497的发酵培养液，转化0.88g/L阿魏酸生成0.332g/L香草酸。第二步培养黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporiumMIC 247，每天添加0.3g/L香草酸，连续流加3天，同时在菌体培养3天后加入XAD-2选择性树脂，最终将1.2g/L香草酸还原成0.628/L香草醛。后续的研究报道对朱红密孔菌P.cinnabarinus MUCL39533转化香草酸生成香草醛进行实验室发酵罐上的放大，香草醛的浓度达到1,575mg/L(StenielaireC.，Lesage-meessen.L.，Oddou J.et.al.，J of Biosci and Bioengineering.2000，89，223-230)。这种以阿魏酸为前体通过两种微生物的转化制备香草醛的方法，涉及到两种微生物的培养，两次底物的转化反应，和中间产物的提取，整个生产流程长，生产效率低。Rabenhorst等(US6133003)培养拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.DSM 9992，在培养过程中分次加入3.3％的阿魏酸，47h产7317ppm香草醛，残留1526ppm阿魏酸。Muheim等(US 6,235,507)用S..setonii ATCC 39116培养5～40h，至碳源葡萄糖几乎消耗完后，在发酵液中按分批方法添加阿魏酸5～40g/L，继续培养(生物转化)约5～50h，阿魏酸转化香草醛积累达到8～16g/L，但副产物较多，有香草醇、香草酸、愈创木酚、对-乙烯基愈创木酚和2-甲基4-乙基-苯酚等，不利于转化产物的分离提取。
在上述从阿魏酸微生物转化生产香草醛的方法中，都未提及采用的底物阿魏酸和香草酸的来源。FDA规定，只要原料是天然的，通过生物催化获得的香料就是天然的，采用的阿魏酸是否天然关系到生产的香草醛是否属天然产品。
天然阿魏酸以反式阿魏酸的形式存在，它是构成植物细胞壁成分的组分之一。在米糠植物细胞壁中阿魏酸主要以阿拉伯糖苷的形式存在于植物细胞壁的米糠渣中外，还以环木菠萝醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯的形式存在于米糠毛油中，含量约为2～3％。米糠毛油提取色拉油后的皂脚中含阿魏酸酯约70％，该酯中阿魏酸的含量高达25％~30％。
发明内容
本发明的一种生产香草酸和香草醛的方法，依次包括以下步骤：
(1)黑曲霉菌株Aspergillus nige CGMCC0774在发酵罐中进行常规培养，发酵30-50h时；
(2)一次或分次添加含阿魏酸的米糠油皂脚溶液，使发酵液中阿魏酸的终浓度为1～5g/L，转化24～80h，得到含香草酸转化液；
(3)含香草酸转化液进行膜过滤除去菌丝体，调pH4～6，并补加1～10g/L的葡萄糖后，高温灭菌；
(4)朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115或其突变株在发酵罐中进行培养，发酵24～72h，获得湿菌丝体；
(5)湿菌丝体以10％的比率与处理过的含香草酸转化液混合，进行转化反应生成香草醛液，反应时间24～80h；
(6)从香草醛液中提取香草醛。
步骤(4)转化反应过程中还可以添加2~20％的孔径范围为80~200的大孔树脂或20~80％的有机溶剂。
以下是本发明的详细描述。
本发明采用微生物发酵转化天然原料生产香草酸和香草醛的方法，涉及的微生物Asp.Niger CGMCC 0774和P.cinnabarinus CGMCC1115菌株已保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心。发明内容包括：
(1)天然阿魏酸或其水溶液的制备
黑曲霉Asp.Niger CGMCC 0774斜面培养：配制含葡萄糖1～10％，马铃薯浸汁5～30％，琼脂1～2.5％，pH6～9的培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，下同。100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～40℃培养3～7天。
种子培养和发酵：麦芽糖5～50g/L、酒石酸二铵0.2～10g/L、酵母膏1～5g/L、磷酸二氢钾0.2～2g/L、氯化钙1～10g/L、硫酸镁0.2～5g/L，pH值为4～9的培养基，装液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、接种，接种量5～10％，20～40℃，摇瓶转速100～250r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养1～5天，分别作为种子或发酵培养液。
阿魏酸酯的酶法水解：取米糠油皂脚溶液，加入培养好的黑曲霉发酵液中，25~40℃下水解反应24~48h，用0.2um微滤膜过滤除去菌丝体，加正己烷萃取甾醇后，溶液加稀酸酸化，调pH4~5，用0.2um微滤膜过滤得到阿魏酸沉淀，用10％的NaOH调pH7.0，得到含阿魏酸的溶液，该溶液可直接用于微生物转化，阿魏酸的浓度由HPLC测定。也可将此含阿魏酸的溶液用常规的结晶方法制备成品阿魏酸。
(2)香草酸转化液的制备与处理
按上述种子培养和发酵条件，将黑曲霉Asp.nigerCGMCC 0774种子以5-10％的种量接入发酵罐中，控制罐温30~37℃，转速100~200r/min，通气量0.5~1vvm，当发酵液pH降为最低点pH3.5以下时，加入终浓度为1~4g/L的按上述方法制备的底物阿魏酸，转化30~54h，补加1~4g/L的阿魏酸底物，继续转化至阿魏酸接近耗完。用0.2um微滤膜过滤除去菌丝体，调pH4~5，补加0.2~5g/L的葡萄糖，100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却，即得到含香草酸1~3g/L的溶液，香草酸对阿魏酸摩尔转化率达到64~86％。
利用筛选得到的丝状真菌黑曲霉(Asp.niger)CGMCC 0774同时具有阿魏酸酯酶与具备氧化裂解阿魏酸侧链的转化活力，可以将水解阿魏酸酯与进而发酵转化为香草酸一步进行。由于黑曲霉缺乏还原香草酸生产香草醛的能力，需要再用朱红密孔菌(P.cinnabarnus)CGMCC1115进行转化，得到所需产物香草醛。
(3)生物转化制备香草醛
朱红密孔菌P.cinnabarinusCGMCC1115斜面培养：配制含葡萄糖1～10％，马铃薯浸汁5～30％，琼脂1～2.5％，pH6～9的培养基。100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～40℃培养3～7天。
种子培养和发酵：培养基的成份为：葡萄糖0.1~30g/L，牛肉膏0.1~15g/L，酵母膏0.1~10g/L，磷酸二氢钾0.1~2.0g/L，硫酸镁0.1~0.5g/L，氯化钙0.1~1.0g/L。培养基的起始pH3~8，装液量20～150ml/250ml三角瓶，100～120℃灭菌，20～50分钟，灭菌后冷却、接种，接种量5～10％，20~35℃，摇瓶转速100～250r/min。在上述条件下进行摇瓶发酵试验，培养时间36~72h，分别作为种子或发酵培养液。发酵罐培养控制转速50~100r/min，通气量0.5~1vvm，温度20~40℃，培养36-48h，pH降为pH3.5以下时，离心或过滤得到菌丝体，即可用于香草酸的生物转化。
将菌丝体以10％的量接入灭菌的香草酸处理液，进行转化反应，控制发酵罐转速50~100r/min，通气量0.2~0.8vvm，温度20~40℃，反应过程中添加20~80％的乙酸正丁酯、邻苯二甲酸二丁酯等有机溶剂，或者添加2~20％的HZ802、D001、D001-CC、D061、D113、DA201、HPD600、HPD300、HPD100A等不同型号的，孔径范围为80~200的大孔树脂，反应24～80h，不断生成的香草醛被萃取于有机溶剂中或被吸附到树脂上，当溶液中香草酸浓度接近0时结束反应，香草醛浓度可到1.8~4.0g/L，对香草酸的摩尔转化率达到60~80％。
(4)香草醛的提取
分离反应液中的有机溶剂，或吸附树脂，用100％乙醇进行洗脱，香草醛集中在有机相中。含有香草醛的有机相，经饱和氯化钠等脱水后，在30~70℃下真空浓缩，回收溶剂，得到100~600g/L的香草醛浓缩液。浓缩液冷却，搅拌得到纯度为70~80％的香草醛深棕色粗结晶。再用体积比为0.01~0.8的乙醇~水溶液溶解，加热至60~85℃，至香草醛粗晶体完全溶解后，冷却至0~10℃，静止结晶，滤去母液，用冷乙醇洗涤，50℃下真空干燥，得到纯度为99％的香草醛乳白色或淡棕色的结晶体。
本发明的目的是提供一种有效的微生物发酵转化天然原料生产香草酸和香草醛的方法。本发明采用微生物水解以环木菠萝醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯为主要成分的米糠油加工皂脚，直接作为发酵原料，或用其生产阿魏酸或含阿魏酸的溶液，进而作为微生物转化生产香草酸、香草醛的原料。通过两种微生物的连贯转化生产天然香草醛，即用黑曲霉Asp.Niger CGMCC 0774或其突变株水解油脚制备阿魏酸，并将其转化为香草酸。含香草酸的发酵转化液经过膜处理去除微生物菌丝体后，用培养好的朱红密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115或其突变株进行还原转化，为消除产物香草醛对细胞和酶的毒害作用，转化过程中采用水/有机溶剂双相生物催化反应，或加入吸附树脂，生物转化产物被萃取于有机溶剂中，或被吸附在树脂上。通过乙醇洗脱，浓缩结晶，水重结晶，得到高纯度的香草醛。
中国富产稻谷，谷制米的副产品米糠，一般占稻谷的5-8％，年产米糠1,000多万吨，米糠资源丰富。米糠可用于提取一系列具有保健功能的化学物质，如功能性油脂、谷维素、γ-谷维醇、菲丁(植酸钙镁)、植酸、肌醇、VB、VE等，这些功能性成分具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、降胆固醇、杀菌、消炎、增强免疫力等功能。通过对米糠的综合利用可以降低阿魏酸原料的生产成本。
本发明利用微生物对天然原料进行转化生产香草醛，反应条件温和，有害物质含量低，产品安全可靠，对环境友好，并且不受种植业的影响，可大规模生产，生产周期短，用可再生的农产品资源，替代煤焦油来源的苯基石化原料，可缓解合成香草醛的石化资源紧张问题与制造过程中的环境污染问题，有极其重要的社会意义。
本发明突出的特点：
(1)采用农副产品加工副产物米糠为阿魏酸原料进行生物转化生产天然的香兰素，即“生物香兰素”(bio-vanillin)，利用可再生的农产品资源，替代煤焦油来源的苯基石化原料，不仅用于食品安全可靠，可缓解合成香草醛的石化资源紧张问题与制造过程中的环境污染问题，并且原料成本也大幅度下降。
(2)生物转化过程中采用反应与分离耦联技术，较好地解决了产物抑制问题，特别是消除了香草醛对细胞和酶的毒害作用，使转化产物浓度达1.8~4.0g/L，并有利于产物分离提取，减少提取成本与能耗。
(3)实现从阿魏酸到香草酸再到香草醛的两种微生物的连贯转化，与两步法生产工艺相比，大大缩短生产流程和生产周期，提高生产效率。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
以下是说明本发明的实例，但不限于这些实例。
具体实施方式
实施例1
从新鲜的生长好的黑曲霉Asp.niger CGMCC 0774斜面刮下一定量的菌块放在100mL装有玻璃珠的无菌水中，在180r/min的转速下打碎20min，得到的孢子液浓度约为106个/mL，按10％接种量接到800mL种子培养基中，30℃，170r/min培养2d，将种子液打碎20min，最后将种子液接入到经120℃灭菌20～50分钟、冷却的发酵培养基中，发酵培养基组分为麦芽糖20g/L、酒石酸二铵10g/L、酵母膏2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙5g/L、硫酸镁0.5g/L，pH值为7.0。发酵条件为装液量100ml/250ml三角瓶，接种量10％，35℃，摇瓶转速120r/min。菌体培养生长40小时后，添加米糠油皂脚溶液10g/100ml，计算其中含阿魏酸2.02g/100ml。培养液于37℃下继续发酵水解反应24小时，HPLC测定阿魏酸浓度为1.22g/100ml，香草酸浓度为0.68g/100ml。
实施例2
按实施例1培养黑曲霉A5p niger CGMCC 0774，将种子液放在特定的接种瓶中，接入到装有8L的实罐灭菌发酵培养基中的15L发酵罐中，在37℃，200r/min，1vvm通气量，0.1Mpa罐压条件下菌体生长44h，加入按实施例1得到的10g/L的无菌阿魏酸溶液(钠盐溶液，pH7.0)1L，在相同条件下进行转化，定时取样用薄层层析跟踪，转化34h时，阿魏酸基本耗尽，香草酸浓度为0.506g/L，相应的摩尔转化率为83.32％。生物量(菌体干重)可达到4.8g/L。
实施例3
按实施例1培养黑曲霉Asp.niger CGMCC 0774，按10％接种量接到1.6L种子培养基中，30℃，170r/min培养2d，将种子液放在特定的接种瓶中接入装有16L的实罐灭菌发酵培养基中的25L发酵罐中，在37℃，200r/min，1vvm通气量，0.1Mpa罐压下进行菌体生长，生长41h时，pH降到最低点pH3.1，加入按实施例1得到、经浓缩或结晶调成的36g/L无菌阿魏酸钠盐溶液(pH7.0)1L，测得转化液中阿魏酸浓度为2.0g/L，在相同的发酵罐条件下进行转化。转化36h时，流加33g阿魏酸调成的无菌阿魏酸钠盐溶液(pH7.0)1L，测得转化液中阿魏酸浓度为2.3g/L，继续转化。用HPLC跟踪测定的底物和产物，转化72h时香草酸浓度2.24g/L，摩尔转化率64.6％。
实施例4
将培养48h的朱红密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115种子以10％接入发酵培养基，培养基的成份为：葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L，培养基的起始pH7.0。在30℃，120r/min，装液量100mL/250mL三角瓶中发酵培养48h，然后向其中加入1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L香草酸，转化12h后，加入树脂HZ802，继续摇床转化，48h后HPLC测定，结果见表1。由表1可见在底物浓度4g/L时香草醛达2.197g/L，mol转化率为60.69％；5g/L香草酸和25g树脂条件下，最高香草醛产2.498g/L，mol转化率是55％，延长转化时间至72h，香草醛产量达2.787g/L，mol转化率为61.59％。
表1 不同底物浓度转化48小时的香草醛产量
| 最高浓度g/L | 摩尔转化率 | 残留香草酸g/L | |
| 1g/L+5g树脂2g/L+10g树脂3g/L+15g树脂4g/L+20g树脂5g/L+25g树脂 | 0.4741.2861.7462.1972.498 | 52.3771.0564.3160.6955.20 | 0.0020.2020.3810.6781.601 |
实施例5
在25L发酵罐中装发酵液16L，以10％种量接入按实施例4培养的朱红密孔菌P.cinnabarinusCGMCC1115，温度30℃、罐压0.1Mpa，转速100r/min，通气量1∶1vvm，菌体生长48h时，pH降至最低点pH2.9，加入终浓度2g/L的香草酸溶液，温度升为35℃，通气量降为0.3vvm，转化12h后以10％(质量体积比)加入树脂HZ802，转化57h时，转化达到最高值1.446g/L，转化率为79.9％。
实施例6
黑曲霉Aspergillus nigerCGMCC 0774种子培养2天，接入发酵培养基中培养2天，再加入含有环木菠萝醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯为主要成分的米糠油皂脚溶液，计算其加阿魏酸量为4g/L，在37℃，150r/min继续进行发酵转化2天，得到含香草酸为1.960g/L，残留的阿魏酸为0.897g/L的转化液，调pH5.0，补加终浓度为5.0g/L的葡萄糖，灭菌后，以10％的菌体量接入按实施例4发酵培养48h的朱红密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115菌丝体转化。在转化过程中加入树脂HZ802，转化50小时产香草醛最高为1.066g/L，对香草酸摩尔转化率60.1％，对阿魏酸的摩尔转化率34.01％。
实施例7
按实施例5方法，培养朱红密孔菌P.cinnabarinus CGMCC1115，将发酵培养48h的朱红密孔菌菌丝体1g接入含香草酸3.980g/L的转化液100mL(含5g/L葡萄糖，pH4.5)中进行转化，反应中添加100mL如表2所示的各种有机溶剂，形成水/有机溶剂两相生物反应体系，35℃，180r/min振荡转化，不断生成的香草醛被萃取于有机相中，24h后结束反应，其结果见表2。其中正己烷中香草醛浓度达到3.08g/L，对香草酸的摩尔转化率达到70.00％。
表2 有机溶剂对P.cinnabarnus CGMCC1115转化香草酸生成香草醛的影响
| 有机溶剂 | 100mL有机相香草醛(mg) |
| 正己烷 | 108 |
| 环己烷 | 81 |
| 正庚烷 | 62 |
| 正辛烷 | 64 |
| 异丙醚 | 25 |
| 甲基叔丁基醚 | 112 |
| 四氯化碳 | 0 |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | 250 |
| 乙酸正丁酯 | 158 |
| 异丁醇 | 15 |
| 正己醇 | 18 |
| 未加溶剂对照 | 102mg/100mL水 |
实施例8
按实施例6在25L发酵罐中进行转化，取罐中吸附香草醛的树脂299g，用95％乙醇浸泡洗脱，收集得到1860ml洗脱液，HPLC测定香草醛1.865g/L，溶液50℃真空浓缩至约170ml，测定含香草醛2.60g，乙酸乙酯萃取三次，饱和氯化钠和无水硫酸镁脱水后，得乙酸乙酯溶液480ml，测定含量5.474g/L，35℃真空浓缩至粘稠液，慢慢形成黄棕色粉状晶体，35℃烘干得到2.89g粗结晶，HPLC测定其纯度77％。取粗结晶1.89g，加12倍量85℃热乙醇-水(乙醇∶水＝1∶1)溶解，调pH7.0，冷却，去除先析出的棕色油状物，再冷却析出晶体，经过滤烘干后得到淡棕色结晶，HPLC测定含量95％，重复进行二次重结晶得到0.87g乳白色结晶，HPLC测定其纯度为99.01％。
Claims (2)
1、一种生产香草酸和香草醛的方法，依次包括以下步骤：
(1)黑曲霉菌株Aspergillus nige CGMCC0774在发酵罐中进行常规培养，发酵30-50h时；
(2)一次或分次添加含阿魏酸的米糠油皂脚溶液，使发酵液中阿魏酸的终浓度为1～5g/L，转化24～80h，得到含香草酸转化液；
(3)含香草酸转化液进行膜过滤除去菌丝体，调pH4～6，并补加1～15g/L的葡萄糖后，高温灭菌；
(4)朱红密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115或其突变株在发酵罐中进行培养，发酵24～72h，获得湿菌丝体；
(5)湿菌丝体以10％的比率与处理过的含香草酸转化液混合，进行转化反应生成香草醛液，反应时间24～80h；
(6)从香草醛液中提取香草醛。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)转化反应过程中添加2～20％的孔径范围为80～200的大孔树脂或20～80％的有机溶剂。
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