CN105524869A - 一种体外牙菌斑生物膜模型及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外牙菌斑生物膜模型。在无氧气氛下，以厌氧菌培养基作为培养介质，以口腔致病菌作为菌种，以表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板作为成膜介质，以培养介质对口腔致病菌培养一段时间后，在成膜介质上生长一段时间，然后进行浮游微生物的去除，最后在成膜介质的表面获得牙菌斑生物膜。本发明具有操作简单，稳定性高，重复性强等有益效果。

Description

一种体外牙菌斑生物膜模型及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物膜的体外模型，属于生物领域及口腔医学领域，具体涉及一种体外牙菌斑生物膜模型。

背景技术

口腔里生存着多种多样的微生物，包括细菌、真菌、病毒、支原体、原虫等，其存在形式包括游离态和聚集态。游离态的微生物称为浮游微生物。聚集态形式的微生物称为生物膜。和浮游微生物相比，以生物膜存在的微生物群具有以下特点：

1)微生物之间相互积聚和定殖，具有空间和环境的多样性；2)活性强，能够抵御苛刻的环境而存活；3)耐受性强，对抗生素敏感性下降；4)能表达不同于浮游细菌的表型。

生物膜中微生物的生存能力、抗药性、代谢效率均显著高于浮游微生物；两者呈现完全不同的生理特征。而长期以来，口腔护理产品的效能，尤其是抗菌效能，是采用浮游微生物(主要是游离的细菌)作为研究对象。其结果与真实的口腔情况存在很大的差异，难以指引口腔产品的开发和优化。

由于口腔产品的临床实验成本高昂，试验周期动辄数月，而且实验对象存在很大的特异性；导致实验数据的准确性和重复性难以保证。增加样本数量会导致测试成本进一步增加。因此，迫切需要建立一种体外的口腔生物膜模型；这种模型尽可能地模拟口腔的情况，而且能够保证多次测试具有重复性。

牙菌斑生物膜是口腔环境中的主要生物膜，是导致口腔疾病如龋齿，牙龈炎，牙周炎和口源性口臭病产生的主要原因之一。牙菌斑生物膜的各种微生物粘附在牙齿表面和口腔其它软组织上，其组成以细菌为主。细菌包括兼性厌氧菌和严格厌氧菌。

目前针对体外的牙菌斑生物膜的研究分为动态法和静态法两种。动态法是在人工唾液模拟口腔流动环境下形成牙菌斑生物膜。专利CN2628532Y、CN1480110A、CN200952006Y和CN1858200A公开了一系列用于筛选防龋药物效能的动态生物膜模型。CN201952427U公开了一种人工口腔模拟动态牙菌斑生物膜装置，该模型包括培养基罐，多通道泵，流动室，药物样品溶液瓶，废液收集罐等组成，所述的菌种培养是以人的唾液或菌斑作为生物膜的菌种来源。

动态模型存在以下问题：

1)每个检测周期可检样品数少，目前文献报道的检测周期一般是5至7天，每次最大可检样品数低于5个；

2)测试结果的重复性难以保证，目前文献报道的结果均采用单次的数据；

3)设备非常复杂，一般必须包含发酵、培养、尾气/废液处理、温控设备几个模块，需要大量的连接管道保持气体环境和培养环境；

4)设备成本高昂，厌氧发酵罐一台成本动辄在二十万以上；

5)研究处于初期阶段；目前没有市售的整套仪器，而不同文献中的设备多为自行构建，难以形成统一的标准，数据难以建立关联。

静态法是以特定菌种经历培养后，在成膜介质上形成生物膜。典型的模型如Zurich模型，具体如文献GuggenheimB,etal,ValidationofaninvitroBiofilmModelofSupragingivalPlaque.JDentRes.2001；80(1):363-370。静态法制备步骤决定了成膜介质上面生长和附着的微生物既有游离态(浮游微生物)也有聚集态(生物膜)。必须尽可能地清除浮游微生物，并最大限度地保留生物膜才能保证生物膜模型测试结果的可信度。因此，生物膜与成膜介质的结合稳定程度决定生物膜模型的成功与否。除此以外，特定菌种的培养环境也会严重影响生物膜的效果。

羟基磷灰石片是一种常见的成膜介质，由于其疏松多孔的特性，能够使微生物聚集并致密地附着于其表面形成稳定的牙菌斑。但两者结合非常紧密。羟基磷灰石片表面的生物膜难以使用水流冲刷、溶剂浸泡、超声振荡等方式清洗下来而不伤害其表面。因此，羟基磷灰石片只能单次使用，从而导致了检测费用高昂，不适合用于大批量产品或者原料的检测。此外，不同的羟基磷灰石片表面孔隙大小及疏密度等方面存在差异，会对生物膜产生一定的影响，将导致实验结果之间存在偏差。

综上可知，业界迫切需要构建一种简单快捷，价格低廉，单次样品数多，检测结果重复性好的牙菌斑生物膜模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种价格低廉、操作简易、稳定性高、重复性强的体外牙菌斑生物膜模型，以消除现有技术的某些缺陷。

本发明的另一个目的是提供一种每次能检测多个样品的牙菌斑生物膜模型的制备方法，而且该模型的测试结果具有良好的重复性。

本发明解决其技术问题的方法是通过采用以下技术方案来实现的：

一种体外牙菌斑生物膜模型，在无氧气氛下，以厌氧菌培养基作为培养介质，以口腔致病菌作为菌种，以表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板作为成膜介质，以培养介质对口腔致病菌培养一段时间后，在成膜介质上生长一段时间，然后进行浮游微生物的去除，最后在成膜介质的表面获得牙菌斑生物膜。

所述的口腔致病菌选自严格厌氧菌和兼性厌氧菌的一种或多种的混合物。所述的口腔致病菌选自血链球菌(Streptococcussanguis)、变异链球菌(Streptococcusmutans)、粘性放线菌(Actinomycesviscosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、中间普氏菌(Prevotellaintermedia)和具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)的一种或多种的混合物。

所述的厌氧菌培养基选自胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基和脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基。所述的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基是指每升胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。所述的脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基是指每升脑心浸出液肉汤(BHI)培养基含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。

L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、氯化血红素和维生素K1以溶液的方式添加至胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，所述溶液具有以下的配置步骤：

1)0.5g/mLL-半胱氨酸盐酸盐水溶液：将0.5克L-半胱氨酸盐酸盐溶解于1毫升去离子水中，经0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，储存温度为4℃；

2)5g/L氯化血红素水溶液：将0.5克氯化血红素和1.74克磷酸氢二钾，溶解于100ml去离子水中，煮沸助溶，0.22μm滤膜过滤，保留滤液，盛载滤液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃；

3)5g/L维生素K1乙醇溶液：将50毫克维生素K1溶解于10毫升无水乙醇中，盛载溶液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃。

8、如权利要求6所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、氯化血红素和维生素K1以溶液的方式添加至脑心浸出液肉汤(BHI)培养基，所述溶液具有以下的配置步骤：

1)0.5g/mLL-半胱氨酸盐酸盐水溶液：将0.5克L-半胱氨酸盐酸盐溶解于1毫升去离子水中，经0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，储存温度为4℃；

2)5g/L氯化血红素水溶液：将0.5克氯化血红素和1.74克磷酸氢二钾，溶解于100ml去离子水中，煮沸助溶，0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，盛载滤液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃；

3)5g/L维生素K1乙醇溶液：将50毫克维生素K1溶解于10毫升无水乙醇中，盛载溶液的容器锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃。

所述无氧气氛具体组成为：按体积比计，包含80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳；所述表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板为聚苯乙烯材质；经历浮游微生物洗涤处理后的牙菌斑生物膜在表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板孔板底部的保留率大于90％。

上述体外牙菌斑生物膜模型的制备方法，具体包括以下步骤：

1)分别将每种口腔致病菌在无氧气氛、恒温36℃的环境中在无菌平板上划线培养2至6天，直至平板上出现大量菌苔；

2)分别将每种培养后的口腔致病菌接种到厌氧菌培养基，在无氧气氛、恒温36℃的环境中培养1至3天，直到培养基浑浊，标志菌悬液培养成熟；

3)将成熟的菌悬液按照体积比2％～8％的比例混合到厌氧菌培养基，在无氧气氛、恒温36°℃的环境接种到表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板的小孔中，培养4至8小时；

4)吸取表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板小孔中的菌悬液，弃去；沿孔壁加入厌氧菌培养基至填满小孔，吸取厌氧菌培养基，弃去；再次沿孔壁向小孔中加入厌氧菌培养基至填满，吸取厌氧菌培养基，弃去；

5)保留经厌氧菌培养基洗涤的、含有口腔致病菌生物膜(牙菌斑生物膜)的表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板小孔。

借由上述技术方案，本发明具有的优点和有益效果是：

1、本发明意外地发现，通过使用特定的培养介质和成膜介质能建立稳定的体外牙菌斑生物膜模型；经过表面亲水改性处理(即Tissueculturetreated，TC处理)的细胞培养板在厌氧环境下有利于多数口腔细菌在其表面的粘附并在培养孔内形成牙菌斑生物膜。所得的牙菌斑生物膜具有良好的稳定性，两次的实验结果之间也有良好的重复性。

2、本发明涉及的模型装置成本低、占地面积小，培养条件容易满足；

3、本发明涉及的模型单次可检测样品数量多，相当于大幅缩短检测周期；

4、本发明涉及的模型可用于口腔产品抑制生物膜效能的快速筛选。

附图说明

图1是6种口腔厌氧菌混合菌于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基中，在表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，第一次试验中两个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

图2是6种口腔厌氧菌混合菌于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基中，在未经表面亲水改性处理(NT处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，2个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

图3是6种口腔厌氧菌混合菌于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中，在表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，2个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

图4是6种口腔厌氧菌混合菌于脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基中，在表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，第一次试验中2个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

图5是6种口腔厌氧菌混合菌于脑心浸出液肉汤(BHI)培养基中，在表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，2个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

图6是6种口腔厌氧菌混合菌于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基中，在表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，第二次试验中两个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

图7是6种口腔厌氧菌混合菌于脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基中，在表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板上形成的6小时生物膜，第二次试验中2个平行孔用结晶紫染色法染色后的图片。

具体实施方式

对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书的公开内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。

除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总重量计算的。除非另外指明，有关所列成分的所有重量均给予活性物质的含量，因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“重量含量”可用符号“％”表示。

除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。

本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。

生物膜

本发明涉及的生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌聚集群体。

牙菌斑生物膜

本发明涉及的牙菌斑是指牙面上或牙周袋内的多种多样微生物构成的生态系，各种细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。

口腔厌氧菌

牙菌斑生物膜中的细菌以口腔厌氧细菌为主，包括兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌。兼性厌氧细菌在有氧和无氧环境均能生长，严格厌氧细菌只能在无氧环境中生长。

口腔致病菌

口腔致病菌是指在一定条件下导致如龋齿、牙龈炎、牙周炎和口源性口臭病等口腔疾病的微生物，尤其是细菌，包括好氧细菌、兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌。

口腔厌氧致病菌

本发明涉及的口腔厌氧致病菌选自血链球菌(StreptococcussanguisATCC49295)，变异链球菌(StreptococcusmutansATCC25175)，粘性放线菌(ActinomycesviscosusATCC27044)，鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusATCC7469),牙龈卟啉单胞菌(PorphyromonasgingivalisATCC33277)，中间普氏菌(PrevotellaintermediaATCC25611)，具核梭杆菌(FusobacteriumnucleatumATCC25586)。

体外生物膜模型

本发明涉及的体外生物膜模型是指对口腔生物膜的体外模拟装置。具体是指在特定的培养气氛下，以培养介质对口腔致病菌培养一段时间后，在成膜介质上生长一段时间，然后进行浮游微生物的去除，最后在成膜介质的表面获得生物膜。

培养气氛和无氧气氛

本发明涉及的培养气氛是指整个生物膜模型装置的气体环境。本发明采用无氧气氛，其具体组成为体积比80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳。培养气氛通过厌氧工作站来实现的。本发明中使用的厌氧工作站是ELECTROTEK公司的300SG型号。

成膜介质

本发明涉及的成膜介质是指在生物膜模型中生物膜生长粘附的材料。成膜介质是生物膜模型的必要组成部分，用于替代活人牙齿作为生物膜生长粘附的底物。成膜介质可以是牙齿、玻片、羟磷灰石片、塑料等硬性材料。本发明中选择表面亲水改性处理(NT处理)细胞培养板作为成膜介质。

表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板

本发明涉及的表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板是指表面进行化学改性的细胞培养板。改性后的细胞培养板特征在于对细胞吸附能力、和蛋白结合能力较改性前有大幅提升。细胞培养板为聚苯乙烯材质。

为了作为区分表面亲水改性处理(TC处理)细胞培养板，本发明将没有进行化学改性的细胞培养板称为未经表面亲水改性处理(NT处理)细胞培养板。

结晶紫染色法

本发明涉及的结晶紫染色法是指在形成牙菌斑生物膜的细胞培养板中加入一定体积的0.1％(w/t)结晶紫溶液对牙菌斑生物膜进行染色，15分钟后吸弃结晶紫溶液，用自来水轻轻清洗以去除多余染料。本发明中，结晶紫染色法用于牙菌斑生物膜的稳定性检测。

培养介质和厌氧菌培养基

口腔致病菌在体外培养并聚集形成牙菌斑生物膜这一过程需要外界为其提供营养环境。该营养环境在本发明中称为培养介质。本发明选用厌氧菌培养基作为培养介质。

本发明涉及的厌氧菌培养基是指胰蛋白胨大豆肉汤补加培养基(TSB补加培养基)和脑心浸出液肉汤富集培养基(BHI富集培养基)。

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基是指每升胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。

脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基是指每升脑心浸出液肉汤(BHI)培养基含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。

生物膜体外模型的制备方法

所述的体外牙菌斑生物膜模型的制备方法具备以下步骤：

1)口腔致病菌的培养

本发明选择培养气氛为无氧气氛，恒温36℃的环境中以平板划线法培养口腔致病菌，培养时间为2至6天。当划线部分的平板出现大量菌苔表示该步骤完成。

2)口腔致病菌在培养介质中的培养

将每种培养后的口腔致病菌接种到厌氧菌培养基，在无氧气氛、恒温36℃的环境中培养1至3天。当目视培养基出现浑浊表示菌悬液培养成熟，该步骤完成。

3)口腔致病菌在成膜介质上生成生物膜

将成熟的菌悬液按照体积比2％～8％的比例混合到厌氧菌培养基，在培养气氛、恒温36℃的环境接种到表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板的小孔中，培养4至8小时。得到含有口腔致病菌生物膜的表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板。当目视细胞培养板的小孔底部被生物膜完全覆盖表示该步骤完成。

4)浮游微生物洗涤处理

本发明中浮游微生物洗涤处理是指用培养介质洗涤含有生物膜的成膜介质上吸附的浮游微生物。

具体操作：将步骤3)制备的含有口腔致病菌生物膜的表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板中的菌悬液吸出，弃去。沿孔壁加入厌氧菌培养基至填满小孔，吸取厌氧菌培养基，弃去。再次沿孔壁向小孔中加入厌氧菌培养基至填满，吸取厌氧菌培养基，弃去。

本发明将经历厌氧菌培养基洗涤的，含有口腔致病菌生物膜的表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板底部生物膜，称为浮游微生物处理后的牙菌斑生物膜。

生物膜在成膜介质上稳定性的评价方法

本发明采用目视法评价牙菌斑生物膜在成膜介质上的稳定性。对浮游微生物处理后的生物膜进行结晶紫染色法染色，目视生物膜占细胞培养板小孔面积的覆盖率。表1列出生物膜稳定性评价标准。

表1生物膜稳定性评价标准

生物膜重复性的评价方法

本发明采用对比法评价生物膜的重复性。对同样条件下制备的两次生物膜进行稳定性测试，表2列出生物膜重复性评价标准。

表2生物膜重复性评价标准

两次稳定性等级	生物膜重复性等级
		均为I级	优
均为II级	优
		均为III级	差
不相同	差

无需进一步详细说明，相信本领域技术人员使用以上所述即可最大限度地使用本发明。下面的实施例目的在于进一步介绍和展示在本发明范围内的具体实施方案。因此，实施例应理解为仅用于更详细地展示本发明，而不以任何方式限制本发明的内容。

以下实施例中，除非另外指明，所有的含量均是重量百分含量，有关所列成分的含量是经过换算的活性物质的含量。

在所述实施例中，将使用下面的牌号和缩写。

1)菌种

血链球菌StreptococcussanguisATCC49295；

变异链球菌StreptococcusmutansATCC25175；

粘性放线菌ActinomycesviscosusATCC27044；

鼠李糖乳杆菌LactobacillusrhamnosusATCC7469；

牙龈卟啉单胞菌PorphyromonasgingivalisATCC33277；

中间普氏菌PrevotellaintermediaATCC25611；

具核梭杆菌FusobacteriumnucleatumATCC25586；

以上菌种均购于广东省微生物菌种保藏中心。

2)试剂

牛心脑提取液(BHI)培养基；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基；蔗糖；葡萄糖；D-甘露糖；L-半胱氨酸氨酸盐酸盐；氯化血红素；维生素K1。

厌氧菌培养基制备

厌氧菌培养基的制备步骤如下：

1)溶液制备

0.5g/mLL-半胱氨酸盐酸盐水溶液：将0.5克L-半胱氨酸盐酸盐溶解于1毫升去离子水中，经0.22μm滤膜过滤，保留滤液，储存温度为4℃；

5g/L氯化血红素水溶液：将氯化血红素0.5克和1.74克磷酸氢二钾，溶解于100毫升去离子水中，0.22μm滤膜过滤，保留滤液，盛载滤液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃；

5g/L维生素K1乙醇溶液：将50毫克维生素K1溶解于10毫升无水乙醇中，盛载溶液的容器锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃。

2)胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基制备

称取30克胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基干粉和5克酵母提取物干粉，加入1升去离子水，121℃高压灭菌20分钟。灭菌后的培养基冷却后加入1毫升0.5g/L的L‐半胱氨酸氨酸盐酸盐溶液、1毫升5g/L氯化血红素溶液和0.2毫升5g/L维生素K1溶液。

3)脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基制备

称取37克脑心浸出液肉汤(BHI)培养基干粉、1克蔗糖、1克葡萄糖和1克D-甘露糖，加入1升去离子水，115℃高压灭菌15分钟。灭菌后的培养基冷却后加入1毫升0.5g/L的L-半胱氨酸氨酸盐酸盐溶液、1毫升5g/L氯化血红素溶液和0.2毫升5g/L维生素K1溶液。

牙菌斑生物膜模型的制备实施例1-4和对比例1-4

按照下表3组成制备口腔生物膜。制备步骤如下：

1)在体积比80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳的无氧培养气氛下，恒温36℃的环境以平板划线法培养口腔致病菌。当划线部分的平板出现大量菌苔表示该步骤完成。

口腔致病菌为血链球菌ATCC49295，变异链球菌ATCC25175，粘性放线菌ATCC27044，鼠李糖乳杆菌ATCC7469，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277，具核梭杆菌ATCC25586这6种。

2)将每种培养后的口腔致病菌接种到厌氧菌培养基，在体积比80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳的培养气氛，恒温36℃的环境中培养。当目视培养基出现浑浊表示菌悬液成熟，该步骤完成。

3)将成熟的菌悬液按照体积比5％的比例混合到厌氧菌培养基，在体积比80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳的培养气氛、恒温36℃的环境接种到细胞培养板的小孔中，培养。当目视细胞培养板的小孔底部被生物膜完全覆盖表示该步骤完成。

4)将制备的含有牙菌斑生物膜的细胞培养板中的菌悬液吸出，弃去。沿孔壁加入厌氧菌培养基至填满小孔，吸取厌氧菌培养基，弃去。再次沿孔壁向小孔中加入厌氧菌培养基至填满，吸取厌氧菌培养基，弃去。得到浮游微生物处理后的生物膜。

表3实施例1-4和对比例1-3所用生物膜培养介质和成膜介质

其中，实施例1和实施例3、实施例2和实施例4是完全一样的重复配制，用于生物膜稳定性的重复测试。

牙菌斑生物膜的稳定性检测

对实施例1-4和对比例1-3制备的牙菌斑生物膜进行如下稳定性测试。对浮游微生物处理后的生物膜进行结晶紫染色法染色，目视生物膜占细胞培养板小孔面积的覆盖率。按表1对稳定性进行评价。

不同成膜介质制备的生物膜的稳定性结果如图1、图2和表4所示。可见采用表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板作为成膜介质的生物膜(实施例1)具有优秀的稳定性；明显优于采用未经表面亲水改性处理(NT处理)细胞培养板制备的生物膜(对比例2)。

表4不同成膜介质制备的生物膜的稳定性

不同培养介质制备的生物膜的稳定性结果如图1、图3～5和表5所示。

使用表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板作为成膜介质；采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基作为培养介质的生物膜(实施例1)具有优秀的稳定性；明显优于采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基制备的生物膜(对比例2)。

使用表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板作为成膜介质；采用脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基作为培养介质的生物膜(实施例2)具有优秀的稳定性；明显优于采用脑心浸出液肉汤(BHI)培养基制备的生物膜(对比例4)。

表5不同培养介质制备的生物膜的稳定性

牙菌斑生物膜的重复性检测

对实施例1和实施例3；实施例2和实施例4的牙菌斑生物膜进行如下重复性测试。对浮游微生物处理后的生物膜进行结晶紫染色法染色，目视生物膜占细胞培养板小孔面积的覆盖率。按上述表2对重复性进行评价。

生物膜的重复性结果如图1、图6、7和表6所示。以胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基和脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基作为生物膜培养介质，口腔致病菌均能在表面亲水改性处理细胞培养板(TC细胞培养板)上形成稳定性极好的牙菌斑生物膜。两次实验的结果呈现良好的重复性。

表6生物膜的稳定性

本文所公开的量纲和数值不应理解为所述精确值的严格限制。除非另外说明，每个这样的量纲旨在表示所述值和围绕该值的功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

在发明内容中引用的所有文件都在相关部分中以引用方式纳入本文中。对于任何文件的引用不应当解释为承认其是有关本发明的现有技术。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：在无氧气氛下，以厌氧菌培养基作为培养介质，以口腔致病菌作为菌种，以表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板作为成膜介质，以培养介质对口腔致病菌培养一段时间后，在成膜介质上生长一段时间，然后进行浮游微生物的去除，最后在成膜介质的表面获得牙菌斑生物膜。

2.如权利要求1所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述口腔致病菌选自严格厌氧菌和兼性厌氧菌的一种或多种的混合物。

3.如权利要求2所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述口腔致病菌选自血链球菌(Streptococcussanguis)、变异链球菌(Streptococcusmutans)、粘性放线菌(Actinomycesviscosus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、中间普氏菌(Prevotellaintermedia)和具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)的一种或多种的混合物。

4.如权利要求1所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述厌氧菌培养基选自胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基和脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基。

5.如权利要求4所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)补加培养基是指每升胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。

6.如权利要求4所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基是指每升脑心浸出液肉汤(BHI)培养基含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。

7.如权利要求5所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、氯化血红素和维生素K1以溶液的方式添加至胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，所述溶液具有以下的配置步骤：

1)0.5g/mLL-半胱氨酸盐酸盐水溶液：将0.5克L-半胱氨酸盐酸盐溶解于1毫升去离子水中，经0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，储存温度为4℃；

2)5g/L氯化血红素水溶液：将0.5克氯化血红素和1.74克磷酸氢二钾，溶解于100ml去离子水中，煮沸助溶，0.22μm滤膜过滤，保留滤液，盛载滤液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃；

3)5g/L维生素K1乙醇溶液：将50毫克维生素K1溶解于10毫升无水乙醇中，盛载溶液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃。

8.如权利要求6所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、氯化血红素和维生素K1以溶液的方式添加至脑心浸出液肉汤(BHI)培养基，所述水溶液具有以下的配置步骤：

1)0.5g/mLL-半胱氨酸盐酸盐水溶液：将0.5克L-半胱氨酸盐酸盐溶解于1毫升去离子水中，经0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，储存温度为4℃；

2)5g/L氯化血红素水溶液：将0.5克氯化血红素和1.74克磷酸氢二钾，溶解于100ml去离子水中，煮沸助溶，0.22μm无菌滤膜过滤，保留滤液，盛载滤液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃；

3)5g/L维生素K1乙醇溶液：将50毫克维生素K1溶解于10毫升无水乙醇中，盛载溶液的容器锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃。

9.如权利要求1所述的体外牙菌斑生物膜模型，其特征在于：所述无氧气氛具体组成为：按体积比计，包含80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳；所述表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板为聚苯乙烯材质；经历浮游微生物洗涤处理后的牙菌斑生物膜在表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板孔板底部的保留率大于90％。

10.一种体外牙菌斑生物膜模型的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1)分别将每种口腔致病菌在无氧气氛、恒温36℃的环境中在无菌平板上划线培养2至6天，直至平板上出现大量菌苔；

2)分别将每种培养后的口腔致病菌接种到厌氧菌培养基，在无氧气氛、恒温36℃的环境中培养1至3天，直到培养基浑浊，标志菌悬液培养成熟；

3)将成熟的菌悬液按照体积比2％～8％的比例混合到厌氧菌培养基，在无氧气氛、恒温36°℃的环境接种到表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板的小孔中，培养4至8小时；

4)吸取表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板小孔中的菌悬液，弃去；沿孔壁加入厌氧菌培养基至填满小孔，吸取厌氧菌培养基，弃去；再次沿孔壁向小孔中加入厌氧菌培养基至填满，吸取厌氧菌培养基，弃去；

5)保留经厌氧菌培养基洗涤的、含有口腔致病菌生物膜(牙菌斑生物膜)的表面亲水改性处理(TC处理)的细胞培养板小孔。