CN112816678A - 一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，包括如下步骤：S1、羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片制备；S2、微生态生物膜生成；S4、志愿者唾液的收集和处理；S5、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片放置在过滤过的唾液中；S6、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至合适的培养基+1％蔗糖中；S7、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至新鲜的培养基培养过夜；S8、每天8次，每次3分钟暴露于含5％蔗糖的溶液中，暴露后用生理盐水冲洗后置于新鲜的培养基；S9、重复以上操作5天，该方法成本低，灵敏度高，可以对口腔清洁用品功效进行快速有效的筛查并能广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于口腔健康技术领域，更具体地说，尤其涉及一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法。
背景技术
口腔中的牙齿、龈沟、舌、颊黏膜、硬腭、软腭、扁桃体等这些高低不平的表面为各类微生物提供了栖身之所，共同形成口腔丰富多样的微生态系统。口腔微生物是口腔微生态的重要组成部分，口腔微生物不仅有细菌，还有真菌、病毒、螺旋体及古细菌等，种类可以超过1000种。最常见的菌群是甲型链球菌和厌氧链球菌，其次是表皮葡萄球菌、奈瑟氏菌、乳杆菌、螺旋体、假丝酵母等。口腔中微生物种类虽然多，但其构成结构比较稳定，不管你是来自不同的国家，不同的种族，不同的生活习惯，口腔中菌群构成都是相似的，这涉及到宿主免疫系统，以及定植菌群与外来微生物的相互作用。外来微生物，首先得适应口腔里高低错落的环境和时而有氧，时而无氧的状态；其次得适应唾液中大量的抗菌物质(如免疫细胞、溶菌酶等)的考验；最后还得经受口腔中已定植菌群的挑战，因此口腔微生物的这种稳定性是人体和微生物群多向选择的结果。细菌是口腔微生物中的最主要组成成分，有六七百种，主要是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门。除了细菌，真菌也是非常重要的成员。在口腔中，人们已经发现了至少85种真菌，其中，最主要的是念珠菌。除了上述的细菌和真菌之外，病毒虽然数量少，但是在口腔中也占有一席之地。它们中的大多数是以口腔细菌为食的噬菌体。与细菌的稳定性类似，对于某个特定的人而言，随着时间的推移，口腔中病毒的种类变化并不大。还有一种可能，就是口腔中噬菌体的稳定性，维持了细菌的稳定。在一个正常人的口腔中，菌群之间共生与拮抗、互生与竞争，时时刻刻发生着，生活在这里的菌群与口腔的组织器官共同形成了一个动态平衡的微生态社区。当菌群平衡时，口腔是健康的，菌群失调时则口腔患各种疾病，如龋齿，口腔溃疡，牙周病及口腔癌等严重影响人类的生命健康，甚至有些口腔细菌如具核梭菌与结直肠癌的发生发展密切相关。
利用适宜的生物学系统(细胞、动物或人体组织)进行功效测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品功效评价的常规检测项目。传统的口腔护理用品功效评价实验常用动物进行，虽然FDA指出，专著中包括的其他测试(氟化物可用性、体外釉质溶解度降低和体外氟化物吸收)是潜在有效性的很好预测因素，但该机构当时认为，体内动物试验为龋齿药物疗效提供了额外的保证。但FDA同时也认为，蛀牙仍然是一个全球关注的问题，而开发旨在提高消费者接受的新配方对于成功提供长期抗龋齿治疗是至关重要的。合理预期有效度的标准是专著系统的一个关键组成部分，而动物实验不仅试验周期长，成本高，会给动物造成极大的痛苦，而且鉴于动物与人的行为以及免疫系统的差异，动物试验的结果与人的相关性较差。因此开发任何体外实验旨在补充或取代已经接受的动物模型时，是其首要考虑因素。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，包括如下步骤：
S1、羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片制备，人或牛牙齿釉质/牙本质厚片大小约为4mm×7mm，厚度为1，2-1，5mm，垂直悬挂于24孔培养平板培养液中，(羟基磷灰石市售有9，65mmdiameter×1，52mm，用胶原包被后备用)腔菌群流动相唾液和固定相牙菌斑经过接种形成生物膜；
S2、微生态生物膜生成，直接通过志愿者口腔唾液，牙菌斑取样，厌氧培养后形成；
S3、口腔/牙菌斑菌群取样，收集500μl唾液，用500μl还原转移液稀释，牙菌斑用无菌刮子收集后用1mL还原转移液稀释；样本6000rpm离心10秒，后震荡混匀20秒，再超声20秒；200μl负80度保存用于测序，800μl用于生物膜设置；
S4、志愿者唾液的收集和处理，收集志愿者唾液，至少在饭后或则喝水或牙齿清洁的1，5小时后的唾液才能收集，收集后用含蛋白酶抑制剂的吸收缓冲液1:1稀释，再离心10min，4℃，3800xg，取上清过滤后待用；
S5、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片放置在过滤过的唾液中，于37摄氏度以60rpm慢速搅拌半小时；
S6、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至合适的培养基+1％蔗糖中，置于37摄氏度厌氧培养6-8小时作为细菌粘附阶段；
S7、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至新鲜的培养基培养过夜；
S8、每天8次，每次3分钟暴露于含5％蔗糖的溶液中，暴露后用生理盐水冲洗后置于新鲜的培养基；
S9、重复以上操作5天(人或牛牙齿釉质)，如是牙本质，则重复4次；受试物如是牙膏，1比3稀释搅拌，或其他口腔清洗液体，一日两次，每次在暴露于蔗糖之前将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片暴露于受试液体中1分钟，再放回培养基前用用生理盐水冲洗；
S10、测试结束后，可选择通过扫描电镜、生物膜面积、生物膜中死菌数量、生物膜中活菌数量、牙釉中矿物质丢失数量和微生物菌群等参数进行观察和分析。
优选的，所述口腔微生态检测主要是对口腔的微生物群落进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析口腔中微生物群体的构成机构，以及相关基因的功能，借助在口腔清洁用品使用前后微生物菌落的构成分析差异，从而分析微生物与口腔环境以及宿主免疫系统的相互关系，从而寻找健康/疾病状态标志性菌群或特定功能的基因。
优选的，所述步骤S4中针对志愿者的取样要求：志愿者三天内未用过抗生素，一天内未饮酒，三小时内未进食未刷牙，未使用口腔清洁用品前以及使用一段时间后。
优选的，所述清洁用品使用前后微生态生物膜的收取：(1)gDNA抽提和测序文库建立；(2)数据预处理：原始数据质控，数据优化，数据提交，数据统计；(3)OUT分析；(4)样本差异分析：差异性分析，beta多样性分析，聚类分析以及功能差异分析。
优选的，所述生物膜的分析方法还包括：整体影像学检查，如扫描电镜分析；生物膜的超声波去粘附后活菌数量分析(获得CFU数据)；生物膜中死菌数量检测，生物膜中蛋白质浓度的测定；生物膜的干重和检测细胞外可溶性和不溶性多糖的浓度。
优选的，所述步骤S1中对于培养液的分析包括：每次换液，新旧培养液pH值；每次换液，新旧培养液钙离子值；培养基中细菌因代谢糖而产生的酸性物质；如含氟物质被使用，则测定培养基中氟的浓度。
本发明的技术效果和优点：本发明的目的是提供一种微生态模型检测口腔清洁用品功效的方法，该方法快速、简便、成本低，灵敏度高，可以对口腔清洁用品功效进行快速有效的筛查并能广泛应用。
附图说明
图1为本发明的牙菌斑生物膜培养3周后用不同品牌抗菌漱口水处理结果图；
图2为本发明的处理前后生物膜的面积变化效果观察图；
图3为本发明的显示粘附后生物膜中主要细菌的活菌的数量效果观察图；
图4为本发明的显示处理后的活菌的数量效果观察图；
图5为本发明的不同品牌漱口水处理后的生物膜免疫原位杂交效果观察图；
图6为本发明的牙菌斑生物膜培养3周后用不同牙膏稀释溶液处理结果观察图；
图7为本发明的显示处理后的活菌的数量观察图；
图8为本发明的不同牙膏处理生物膜前后菌群测序结果变化观察图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，包括如下步骤：
S1、羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片制备，人或牛牙齿釉质/牙本质厚片大小约为4mm×7mm，厚度为1，2-1，5mm，垂直悬挂于24孔培养平板培养液中，(羟基磷灰石市售有9，65mmdiameter×1，52mm，用胶原包被后备用)腔菌群流动相唾液和固定相牙菌斑经过接种形成生物膜；
S2、微生态生物膜生成，直接通过志愿者口腔唾液，牙菌斑取样，厌氧培养后形成；
S3、口腔/牙菌斑菌群取样，收集500μl唾液，用500μl还原转移液稀释，牙菌斑用无菌刮子收集后用1mL还原转移液稀释；样本6000rpm离心10秒，后震荡混匀20秒，再超声20秒；200μl负80度保存用于测序，800μl用于生物膜设置；
S4、志愿者唾液的收集和处理，收集志愿者唾液，至少在饭后或则喝水或牙齿清洁的1，5小时后的唾液才能收集，收集后用含蛋白酶抑制剂的吸收缓冲液1:1稀释，再离心10min，4℃，3800xg，取上清过滤后待用；
S5、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片放置在过滤过的唾液中，于37摄氏度以60rpm慢速搅拌半小时；
S6、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至合适的培养基+1％蔗糖中，置于37摄氏度厌氧培养6-8小时作为细菌粘附阶段；
S7、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至新鲜的培养基培养过夜；
S8、每天8次，每次3分钟暴露于含5％蔗糖的溶液中，暴露后用生理盐水冲洗后置于新鲜的培养基；
S9、重复以上操作5天(人或牛牙齿釉质)，如是牙本质，则重复4次；受试物如是牙膏，1比3稀释搅拌，或其他口腔清洗液体，一日两次，每次在暴露于蔗糖之前将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片暴露于受试液体中1分钟，再放回培养基前用用生理盐水冲洗；
S10、测试结束后，可选择通过扫描电镜、生物膜面积、生物膜中死菌数量、生物膜中活菌数量、牙釉中矿物质丢失数量和微生物菌群等参数进行观察和分析。
具体的，所述口腔微生态检测主要是对口腔的微生物群落进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析口腔中微生物群体的构成机构，以及相关基因的功能，借助在口腔清洁用品使用前后微生物菌落的构成分析差异，从而分析微生物与口腔环境以及宿主免疫系统的相互关系，从而寻找健康/疾病状态标志性菌群或特定功能的基因。
具体的，所述步骤S4中针对志愿者的取样要求：志愿者三天内未用过抗生素，一天内未饮酒，三小时内未进食未刷牙，未使用口腔清洁用品前以及使用一段时间后。
具体的，所述清洁用品使用前后微生态生物膜的收取：(1)gDNA抽提和测序文库建立；(2)数据预处理：原始数据质控，数据优化，数据提交，数据统计；(3)OUT分析；(4)样本差异分析：差异性分析，beta多样性分析，聚类分析以及功能差异分析。
具体的，所述生物膜的分析方法还包括：整体影像学检查，如扫描电镜分析；生物膜的超声波去粘附后活菌数量分析(获得CFU数据)；生物膜中死菌数量检测，生物膜中蛋白质浓度的测定；生物膜的干重和检测细胞外可溶性和不溶性多糖的浓度。
具体的，所述步骤S1中对于培养液的分析包括：每次换液，新旧培养液pH值；每次换液，新旧培养液钙离子值；培养基中细菌因代谢糖而产生的酸性物质；如含氟物质被使用，则测定培养基中氟的浓度。
请参照图1-图5，为抗菌漱口水祛牙菌斑效果观察结果包括以下五种：
牙菌斑生物膜培养3周后用不同品牌抗菌漱口水处理结果，结果为扫描电镜的低像素(左边)，高像素(右边)结果，请参照图1；
牙菌斑生物膜培养3周后用不同品牌抗菌漱口水处理结果，处理前后生物膜的面积变化(um3)，请参照图2；
牙菌斑生物膜培养3周后用不同品牌抗菌漱口水处理结果，显示粘附后生物膜中主要细菌的活菌的数量，请参照图3，其中，粘附15分钟后菌落数。SS:表兄链球菌；So:口腔链球菌；Vd:殊异韦荣球菌；Fn:核梭形杆菌，An:内氏放线菌；
牙菌斑生物膜培养3周后用不同品牌抗菌漱口水处理结果，显示处理后的活菌的数量，请参照图4；
不同品牌漱口水处理后的生物膜免疫原位杂交：A为所有菌EUB338mix(green，allbacteria)，B为LGC354mix(blue，Firmicutes)，C为Bac303(red，Bacteroidaceae，somePorphyromonadaceae，and Prevotellacea).D为三者混合，请参照图5。
实施例2
请参照图6-图8，对牙膏祛斑效果观察结果包括以下三种：
牙菌斑生物膜培养3周后用不同牙膏稀释溶液处理结果，图示处理前后生物膜中死菌的比例，请参照图6；
牙菌斑生物膜培养3周后用不同品牌牙膏稀释溶液处理结果，显示处理后的活菌的数量，请参照图7；
不同牙膏处理生物膜前后菌群测序结果变化，请参照图8。
综上所述：本发明的目的是提供一种微生态模型检测口腔清洁用品功效的方法，该方法快速、简便、成本低，灵敏度高，可以对口腔清洁用品功效进行快速有效的筛查并能广泛应用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同替换、改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片制备，人或牛牙齿釉质/牙本质厚片大小约为4mm×7mm，厚度为1，2-1，5mm，垂直悬挂于24孔培养平板培养液中，(羟基磷灰石市售有9，65mmdiameter×1，52mm，用胶原包被后备用)腔菌群流动相唾液和固定相牙菌斑经过接种形成生物膜；
S2、微生态生物膜生成，直接通过志愿者口腔唾液，牙菌斑取样，厌氧培养后形成；
S3、口腔/牙菌斑菌群取样，收集500μl唾液，用500μl还原转移液稀释，牙菌斑用无菌刮子收集后用1mL还原转移液稀释；样本6000rpm离心10秒，后震荡混匀20秒，再超声20秒；200μl负80度保存用于测序，800μl用于生物膜设置；
S4、志愿者唾液的收集和处理，收集志愿者唾液，至少在饭后或则喝水或牙齿清洁的1，5小时后的唾液才能收集，收集后用含蛋白酶抑制剂的吸收缓冲液1:1稀释，再离心10min，4℃，3800xg，取上清过滤后待用；
S5、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片放置在过滤过的唾液中，于37摄氏度以60rpm慢速搅拌半小时；
S6、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至合适的培养基+1％蔗糖中，置于37摄氏度厌氧培养6-8小时作为细菌粘附阶段；
S7、将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片移至新鲜的培养基培养过夜；
S8、每天8次，每次3分钟暴露于含5％蔗糖的溶液中，暴露后用生理盐水冲洗后置于新鲜的培养基；
S9、重复以上操作5天(人或牛牙齿釉质)，如是牙本质，则重复4次；受试物如是牙膏，1比3稀释搅拌，或其他口腔清洗液体，一日两次，每次在暴露于蔗糖之前将羟基磷灰石/人或牛牙齿釉质/牙本质厚片暴露于受试液体中1分钟，再放回培养基前用用生理盐水冲洗；
S10、测试结束后，可选择通过扫描电镜、生物膜面积、生物膜中死菌数量、生物膜中活菌数量、牙釉中矿物质丢失数量和微生物菌群等参数进行观察和分析。
2.根据权利要求1所述的一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，其特征在于：所述口腔微生态检测主要是对口腔的微生物群落进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析口腔中微生物群体的构成机构，以及相关基因的功能，借助在口腔清洁用品使用前后微生物菌落的构成分析差异，从而分析微生物与口腔环境以及宿主免疫系统的相互关系，从而寻找健康/疾病状态标志性菌群或特定功能的基因。
3.根据权利要求1所述的一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，其特征在于：所述步骤S4中针对志愿者的取样要求：志愿者三天内未用过抗生素，一天内未饮酒，三小时内未进食未刷牙，未使用口腔清洁用品前以及使用一段时间后。
4.根据权利要求1所述的一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，其特征在于：所述清洁用品使用前后微生态生物膜的收取：(1)gDNA抽提和测序文库建立；(2)数据预处理：原始数据质控，数据优化，数据提交，数据统计；(3)OUT分析；(4)样本差异分析：差异性分析，beta多样性分析，聚类分析以及功能差异分析。
5.根据权利要求1所述的一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，其特征在于：所述生物膜的分析方法还包括：整体影像学检查，如扫描电镜分析；生物膜的超声波去粘附后活菌数量分析(获得CFU数据)；生物膜中死菌数量检测，生物膜中蛋白质浓度的测定；生物膜的干重和检测细胞外可溶性和不溶性多糖的浓度。
6.根据权利要求1所述的一种利用口腔微生态生物膜模型检测口腔用品功效的方法，其特征在于：所述步骤S1中对于培养液的分析包括：每次换液，新旧培养液pH值；每次换液，新旧培养液钙离子值；培养基中细菌因代谢糖而产生的酸性物质；如含氟物质被使用，则测定培养基中氟的浓度。
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