CN117264818B - 一种口腔细菌生物膜培养基及其应用 - Google Patents
一种口腔细菌生物膜培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种口腔细菌生物膜培养基及其应用，属于微生物培养基技术领域。本申请的口腔细菌生物膜培养基，包括人工唾液和特异营养因子；所述特异营养因子包括胎牛血清、蔗糖、维生素、氯化血红素、精氨酸和N‑乙酰胞壁酸中的至少一种。本申请通过采集人唾液作为菌种来源，通过比较目前文献所报道的培养基培养的口腔细菌生物膜的量及其与人类混合唾液在物种丰度和物种构成上的相似度，对培养基进行初步筛选，再对这些培养基进行改良、优化，进一步筛选得到的培养基所富集得到的口腔细菌生物膜与采集得到的人口腔混合唾液在物种丰度和物种构成上相似程度较高，并且生物膜形成量较其他培养基高。
Description
技术领域
本申请涉及微生物培养基技术领域，尤其涉及一种口腔细菌生物膜培养基及其应用。
背景技术
人类约60％细菌性疾病是由生物膜引起的，细菌形成生物膜后极大的增强了对外界环境的抵抗能力。口腔内细菌生物膜是导致龋病、牙周病等常见口腔疾病的致病因素。龋病和牙周病并非由单一或几种细菌组成，而是由复杂的菌群共同致病，目前全部致病菌并未明确。此外，口腔内细菌有超过700多种，但目前现有的体外培养技术很难培养出全部口腔微生物。现已报道的口腔多菌种生物膜的培养方法均会导致原始口腔生物膜中微生物物种不同程度的丢失，且各研究结果之间的差异较大。因此，如何能更好的还原口腔微生物组成是口腔微生物领域的难点，对疾病体外病原学的研究具有重要意义。
发明内容
本申请的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种能够模拟人口腔原始菌群组成、细菌物种结构接近原始唾液丰度的口腔细菌生物膜培养基及其应用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种口腔细菌生物膜培养基，包括人工唾液和特异营养因子；所述特异营养因子包括胎牛血清、蔗糖、维生素、氯化血红素、精氨酸和N-乙酰胞壁酸。
本申请通过采集人唾液作为菌种来源，通过比较目前文献所报道的培养基培养的口腔细菌生物膜的量及其与人类混合唾液在物种丰度和物种构成上的相似度，对培养基进行初步筛选，再对这些培养基进行改良、优化，进一步筛选得到的培养基所富集得到的口腔细菌生物膜与采集得到的人口腔混合唾液在物种丰度和物种构成上相似程度较高，并且生物膜形成量较其他培养基高。
本申请通过将人工唾液和特异营养因子搭配，制备为口腔细菌生物膜培养基，能够模拟口腔环境，用于富集口腔细菌生物膜，所得口腔细菌生物膜与人口腔唾液的物种丰度和物种构成相近。特异营养因子包括胎牛血清、蔗糖、维生素、氯化血红素、精氨酸和N-乙酰胞壁酸，胎牛血清含有多种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物，能够促进细胞生长；维生素、蔗糖、氯化血红素、精氨酸和N-乙酰胞壁酸的加入能够促进口腔细菌的生长，使口腔细菌的种群密度快速提高，刺激细菌发生群体感应，从而提高生物膜的形成量。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述维生素包括维生素K、维生素D和维生素A中的至少一种。本申请通过实验发现在培养基中不同种类的维生素均提高口腔细菌生物膜的形成量，能够进一步提高细菌物种丰度。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述维生素为维生素K。本申请通过实验发现在培养基中加入维生素K富集得到的口腔细菌生物膜最多。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述口腔细菌生物膜培养基包括以下组分：1-20v/v％胎牛血清、0.1-2wt％蔗糖、0.0001wt％维生素、0.0005wt％氯化血红素、0.0174wt％精氨酸、0.001wt％N-乙酰胞壁酸，人工唾液补足至总体积为1L。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述口腔细菌生物膜培养基包括以下组分：5-20v/v％胎牛血清、0.5-2wt％蔗糖、0.0001wt％维生素、0.0005wt％氯化血红素、0.0174wt％精氨酸、0.001wt％N-乙酰胞壁酸，人工唾液补足至总体积为1L。在优选配比范围下，本申请口腔细菌生物膜培养基所富集得到的口腔细菌生物膜形成量更高。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述口腔细菌生物膜培养基包括以下组分：10v/v％胎牛血清、1wt％蔗糖、0.0001wt％维生素、0.0005wt％氯化血红素、0.0174wt％精氨酸、0.001wt％N-乙酰胞壁酸，人工唾液补足至总体积为1L。在优选配比范围下，本申请口腔细菌生物膜培养基所富集得到的口腔细菌生物膜形成量最高。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述特异营养因子还包括动物血，所述动物血的体积占生物膜培养基总体积的5％。本申请通过实验发现加入动物血的培养基所富集得到的口腔细菌生物膜量更高，这是因为动物血中含有多种营养因子，能够促进口腔细菌的生长。
作为本申请所述培养基的优选实施方式，所述动物血包括羊血、牛血和马血中的至少一种。
第二方面，本申请提供了上述培养基在富集口腔细菌生物膜中应用。
第三方面，本申请提供了一种富集口腔细菌生物膜的方法，包括以下步骤：
S1、对采集得到的口腔唾液进行离心，所得上清液为混合唾液，将混合唾液转入细胞培养板中，得到唾液涂层；
S2、对步骤S1所得唾液涂层进行干燥，然后紫外线消毒，得到含唾液涂层的细胞培养板；
S3、将步骤S1所得混合唾液接种至步骤S2所得含唾液涂层的细胞培养板中，在37℃、厌氧条件下培养，得到富集后的口腔细菌生物膜；所述含唾液涂层的细胞培养板中含有上述口腔细菌生物膜培养基。
作为本申请所述方法的优选实施方式，步骤S1中，所述离心为在室温、2600g条件下离心10min；
步骤S2中，所述干燥为在37℃条件下打开细胞板盖晾干1h；
步骤S2中，所述紫外线消毒的时间为1h；
步骤S3中，所述处理后的唾液与口腔细菌生物膜培养基的体积比为处理后的唾液：口腔细菌生物膜培养基＝0.1:1；
步骤S3中，所述厌氧条件为培养环境中的气体由85％氮气、5％二氧化碳和10％氢气组成。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
本申请通过采集人唾液作为菌种来源，通过比较目前文献所报道的培养基培养的口腔细菌生物膜的量及其与人类混合唾液在物种丰度和物种构成上的相似度，对培养基进行初步筛选，再对这些培养基进行改良、优化，进一步筛选得到的培养基所富集得到的口腔细菌生物膜与采集得到人口腔混合唾液在物种丰度和物种构成上相似程度较高，并且生物膜形成量较其他培养基高。
附图说明
图1为实验例1中BHIs、PG、BMM、AS、TSB、SHI和RPMI培养基富集得到的口腔细菌生物膜量的测定结果；
图2为实验例1中BHIs、PG、AS和SHI培养基富集得到的口腔细菌生物膜与原始混合唾液(Sa)的OTUs分析结果；
图3为实验例1中BHIs、PG、AS和SHI培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa的Shannon指数分析结果；
图4为实验例1中BHIs、PG、AS和SHI培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa在属水平上的物种构成分析结果；
图5为实验例1中BHIs、PG、AS、SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到的口腔细菌生物膜量测定结果；
图6为实验例1中BHIs、PG、AS、SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa的OTUs分析结果
图7为实验例1中BHIs、PG、AS、SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa的Shannon指数分析结果；
图8为实验例1中BHIs、PG、As、SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa在属水平上的物种构成分析结果；
图9为实验例1中BHIs、PG、AS、SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa的相关性分析结果；
图10为实验例1中BHIs、PG、AS、SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到的口腔细菌生物膜与Sa的群落差异PCA分析结果；
图11为实验例2中不同浓度胎牛血清的口腔细菌生物膜培养基富集口腔细菌生物膜量的测定结果；
图12为实验例2中不同浓度蔗糖的口腔细菌生物膜培养基富集口腔细菌生物膜量的测定结果；
图13为实验例2中不同种类维生素及其用量的口腔细菌生物膜培养基富集口腔细菌生物膜量的测定结果；
图14为实验例2中不同种类动物血及其用量的口腔细菌生物膜培养基富集口腔细菌生物膜量的测定结果；
图15为实验例3中SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到口腔细菌生物膜死活菌染色结果，其中A为激光共聚焦显微镜(CLSM)观察结果，B为相应的COMSTAT2软件分析统计结果；
图16为为实验例3中SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到口腔细菌生物膜胞外多糖(EPS)染色结果，其中A为CLSM观察结果，B为相应的的COMSTAT2软件分析统计结果；
图17为实验例3中SHI、MBHIs、MPG和MAS培养基富集得到口腔细菌生物膜扫描电镜观察结果，放大倍数为5000及25000倍。
具体实施方式
为更好地说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
实施例、对比例、实验例所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
脑心浸液肉汤培养基(BHI)、RPMI-1640培养基(RPMI)、胰蛋白胨液体培养基(TSB)、BMM培养基均由Solarbio提供；
人工唾液由Phygene提供，货号为PH1843；
羊血、牛血和马血均由Solarbio提供，货号分别为TX0030、TX0010、TX0040；
QIAamp DNA提取试剂盒、QIAquick PCR纯化试剂盒由Qiagen提供；
LIVE/DEAD BacLightTM细菌活力染色试剂盒、Alexa Fluor 647标记的葡聚糖缀合物由Thermo Fisher Scientific提供。
实施例1～8
实施例1～8分别提供了一种口腔细菌生物膜培养基，其组分及其用量见表1。
表1实施例1～8的口腔细菌生物膜培养基组分及其用量
实施例9～12
实施例9～12的口腔细菌生物膜培养基与实施例1相似，不同之处为特异营养因子中的维生素种类和动物血种类不同、用量相同，具体种类见表2，其余组分及其用量相同。
表2实施例9～12的口腔细菌生物膜培养基部分组成
对比例1-3
对比例1-3的口腔细菌生物膜培养基与实施例1相似，不同之处为特异营养因子的部分组分用量不同，具体用量见表3。
表3对比例1～3的口腔细菌生物膜培养基的部分组成及用量
对比例4
对比例4提供了一种口腔细菌培养基MPG，包括以下组分：36g/L BHI干粉、5g/L酵母提取物、10g/L蔗糖、0.4g/L L-盐酸半胱氨酸、5mg/L氯化血红素、1mg/L维生素K、0.174g/L精氨酸、10v/v％胎牛血清。
对比例5
对比例5提供了一种口腔细菌培养基MBHIs，包括以下组分：37g/L BHI干粉、10g/L蔗糖、5mg/L氯化血红素、1mg/L维生素K、0.174g/L精氨酸、10v/v％胎牛血清。
对比例6
对比例6提供了一种口腔细菌培养基SHI，包括以下组分：10g/L蛋白胨、5g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、2.5g/L氯化钾、5g/L蔗糖、5mg/L氯化血红素、1mg/L维生素K、0.06g/L尿素、0.174g/L精氨酸、2.5g/L粘蛋白(Ⅲ型，猪胃)、5v/v％羊血、10mg/L N-乙酰胞壁酸。
实验例1口腔细菌生物膜培养基的筛选与改良
为了获得更适合口腔细菌形成生物膜的培养基，本实验对现有的口腔细菌培养基进行筛选、改良，具体方案如下：
一、从现有培养基中筛选培养所得生物膜物种丰度最高的培养基
1、通过系统性查找pubmed数据库，总结目前研究中用于培养口腔细菌生物膜的培养基分别为BHIs、SHI、PG、AS、BMM、TSB和RMPI，其中RPMI、TSB、BMM和BHI均为市售培养基，SHI培养基配方见对比例6，BHIs、PG和AS培养基的配方见表4。
表4不同培养基配方
2、将上述培养基用于富集口腔细菌生物膜，具体步骤如下：
S1、采集6名志愿者的口腔唾液，每人收集5mL唾液，将所得唾液样品合并，在2600g下离心10min，所得上清液为混合唾液，取200μL混合唾液加入24孔细胞培养板中，得到唾液涂层；
S2、打开24孔细胞培养板，在37℃下放置1h使S1所得唾液涂层干燥，然后采用紫外线消毒1h，得到含有唾液涂层的细胞培养板；
S3、取10μL步骤S1所得混合唾液接种到步骤S2所得含有唾液涂层的细胞培养板中，孔中含有步骤1所述的培养基(BHIs、SHI、PG、AS、BMM、TSB或RMPI)，在37℃、厌氧条件(85％氮气、5％二氧化碳、10％氢气)下培养24h，得到富集后的口腔细菌生物膜。
上述志愿者在采集前3个月内不接受任何系统性疾病治疗，不服用任何处方药或非处方药，并且在捐献唾液前2h不吃任何食物或饮料。本研究经中山大学口腔医院伦理委员会批准(意见号KQEC-2021-71-01)。
3、去除培养24h后细胞板中的培养基，磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次，甲醇固定15min，去除甲醇后干燥15min，0.1wt％结晶紫溶液染色15min，去除结晶紫溶液，PBS冲洗2次，每孔加入300μL 95％乙醇混匀，在600nm处测量光密度以评估各组生物膜量。统计结果见图1。
如图1所示，BHIs、SHI、PG和AS培养基培养得到的细菌生物膜量较多，BMM、TSB和RMPI培养基培养得到的细菌生物膜量较少，因此后续选择BHIs、SHI、PG和AS培养基与原始混合唾液进行比较。
4、按照试剂盒步骤分别提取步骤2所得BHIs、SHI、PG和AS培养基的口腔细菌生物膜DNA，以口腔细菌生物膜DNA作为模板进行16S rRNA基因片段的PCR扩增，采用试剂盒纯化PCR扩增片段，在Illumina Miseq平台上进行16S rRNA基因测序，得到测序结果。
5、将步骤4所得测序结果使用mothur和QIIME程序进行生物信息学分析，使用Usearch程序执行操作分类单元(OTU)聚类，通过使用Silva数据库中的序列对序列进行比对和分类分配。为避免因不同测序深度造成的偏差，OTU表被精简为每个样本的最低序列数。分析在I-Sanger云平台上进行。对于α多样性，Shannon指数是在OTU级别计算的；对于β多样性，在OTU级别进行主成分分析(PCA)，并使用基于Bray-Curtis距离的相似性分析(ANOSIM)来检查群落差异。分析结果见图2-4。
如图2-4所示，原始混合唾液(Sa)测序获得170个OTUs，而BHIs、SHI、PG和AS培养基培养得到的生物膜只能获得60-90个OTUs，并且BHIs、SHI、PG和AS培养基的生物膜Shannon指数、物种丰度均低于Sa，表明现有文献中的口腔细菌生物膜培养基均无法在体外模拟口腔细菌生物膜的物种丰度。
在BHIs、SHI、PG和AS培养基中，AS培养基的生物膜OTUs和Shannon指数较高，在属水平上的物种相对丰度较高，表明AS培养基中培养的生物膜更接近Sa物种的相对丰度。
二、对BHIs、SHI、PG和AS培养基进行改良
在上述研究中发现BHIs、SHI、PG和AS培养基对口腔细菌生物膜形成量较高，在此基础上对BHIs、PG和AS培养基进行改良，SHI由于组分较多未进行改良，改良后的培养基分别命名为MPG(对应对比例4)、MBHIs(对应对比例5)、MAS(对应实施例1)。
将采集得到的口腔唾液分别接种至SHI(对比例6)、MPG(对比例4)、MBHIs(对比例5)、MAS(实施例1)、BHIs、PG和AS培养基中，并测定不同培养基所得口腔细菌生物膜量及其物种丰度，培养方法和检测方法与步骤一的相同，结果见图5-10。
如图5-10所示，在实施例1、对比例4-6、BHIs、PG和AS中，实施例1的培养基所得口腔细菌生物膜量最高，16S rRNA基因测序结果也显示实施例1的OTUs和Shannon指数更高，表示实施例1的培养基富集得到的口腔细菌生物膜具有更高的物种丰度，且在属水平上分析认为实施例1培养基富集得到的口腔细菌生物膜物种构成与原始唾液更接近，而其余培养基与原始唾液相似度较低，因此采用MAS培养基(实施例1)作为口腔细菌生物膜培养基进行后续实验。
实验例2口腔细菌生物膜培养基的优化
为了进一步提高口腔细菌生物膜培养基富集生物膜的能力，本实验通过对实施例1的口腔细菌生物膜培养基的组分及其用量进行优化。
将采集得到的口腔唾液接种至实施例1-12、对比例1-3的口腔细菌生物膜培养基中，测定富集得到的口腔细菌生物膜量，培养方法和测定方法与实验例1的相同，结果见图11-14。
如图11所示，与对比例2相比，实施例1-4的生物膜量均显著提高，表明胎牛血清的加入能够显著提高口腔细菌生物膜的形成量；如图12所示，与对比例1相比，实施例1、实施例5-7的生物膜量均显著提高，表明蔗糖的加入能够显著提高口腔细菌生物膜的形成量；如图13所示，与对比例3相比，实施例1、实施例9-10的生物膜量显著提高，表明不同种类维生素的加入能够显著提高口腔细菌生物膜的形成量；如图14所示，实施例1、实施例8、实施例11-12的生物膜量无显著差异，但是添加羊血的生物膜量略高于不添加动物血的，表明添加动物血能够进一步提高口腔细菌生物膜的形成量。
实验例3口腔细菌生物膜的表征
为了探究不同培养基富集得到的口腔细菌生物膜之间的差异，采用实施例1、对比例4-6的培养基富集口腔细菌生物膜，并通过激光共聚焦显微镜(CLSM)和扫描电镜观察口腔细菌生物膜，富集口腔细菌生物膜方法与实验例1的相同。
激光共聚焦显微镜观察口腔细菌生物膜具体操作如下：
对培养24h后的口腔细菌生物膜用PBS冲洗3次，使用LIVE/DEAD BacLightTM细菌活力染色试剂盒标记生物膜，用CLSM观察；在生物膜形成之初，用Alexa Fluor647标记的葡聚糖缀合物标记EPS基质，培养24h后用PBS洗涤3次，采用CLSM观察。观察结果见图15-16。
扫描电镜观察口腔细菌生物膜具体操作如下：
在24孔细胞板中放入细胞爬片，培养口腔生物膜24h后用PBS冲洗，2.5％戊二醛固定，置于4℃冰箱过夜，PBS洗净，采用30％、50％、70％、90％系列浓度乙醇分别在4℃下脱水15min，100％乙醇脱水2次，每次15min。冷冻干燥喷金镀膜后采用扫描电镜观察。观察结果见图17。
如图15-16所示，与对比例4-6相比，实施例1的口腔细菌生物膜量更高，且胞外多糖分泌量更高。
如图17所示，从5000倍放大结果可见，实施例1、对比例4-6的培养基均能形成致密的生物膜，其中实施例1的生物膜致密程度更高；从25000倍放大结果可见，实施例1的细菌表明有较多的胞外基质，与CLSM的观察结果相同。
以上结果表明，本申请的口腔细菌生物膜培养基能够有效提高口腔细菌的生物膜形成量，和促进细菌胞外多糖的分泌。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种口腔细菌生物膜培养基，其特征在于，所述口腔细菌生物膜培养基的组成为以下组分：1-20v/v%胎牛血清、0.1-2wt%蔗糖、0.0001wt%维生素、0.0005wt%氯化血红素、0.0174wt%精氨酸、0.001wt% N-乙酰胞壁酸，人工唾液补足至总体积为1L；
所述维生素包括维生素K、维生素D和维生素A中的至少一种。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述维生素为维生素K。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述口腔细菌生物膜培养基的组成为以下组分：5-20v/v%胎牛血清、0.5-2wt%蔗糖、0.0001wt%维生素、0.0005wt%氯化血红素、0.0174wt%精氨酸、0.001wt% N-乙酰胞壁酸，人工唾液补足至总体积为1L。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述口腔细菌生物膜培养基的组成为以下组分：10v/v%胎牛血清、1wt%蔗糖、0.0001wt%维生素、0.0005wt%氯化血红素、0.0174wt%精氨酸、0.001wt% N-乙酰胞壁酸，人工唾液补足至总体积为1L。
5.一种口腔细菌生物膜培养基，其特征在于，所述口腔细菌生物膜培养基的组成为1-20v/v%胎牛血清、0.1-2wt%蔗糖、0.0001wt%维生素、0.0005wt%氯化血红素、0.0174wt%精氨酸、0.001wt% N-乙酰胞壁酸和动物血，人工唾液补足至总体积为1L，所述动物血的体积占口腔细菌生物膜培养基总体积的5%；
所述维生素包括维生素K、维生素D和维生素A中的至少一种。
6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述动物血包括羊血、牛血和马血中的至少一种。
7.如权利要求1~6任一项所述的培养基在富集口腔细菌生物膜中应用。
8.一种富集口腔细菌生物膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、对采集得到的口腔唾液进行离心，所得上清液为混合唾液，将混合唾液转入细胞培养板中，得到唾液涂层；
S2、对步骤S1所得唾液涂层进行干燥，然后采用紫外线消毒，得到含唾液涂层的细胞培养板；
S3、将步骤S1所得混合唾液接种至步骤S2所得含唾液涂层的细胞培养板中，在37℃、厌氧条件下培养，得到富集后的口腔细菌生物膜；所述含唾液涂层的细胞板中为权利要求1~6任一项所述口腔细菌生物膜培养基、唾液涂层和混合唾液。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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