CN1858200A - 一种口腔生物膜动态模型装置及其形成口腔生物膜的方法 - Google Patents

Abstract

一种口腔生物膜动态模型装置，含有碱液罐(1)、培养基罐(2)、发酵罐(3)、恒流培养室(4)和加样瓶(7)。其特征在于恒流培养室(4)为多个竖式标准圆柱形恒流培养室串联连接，碱液罐(1)通过蠕动泵P1与发酵罐(3)连接，培养基罐(2)通过蠕动泵P2与发酵罐(3)连接，发酵罐(3)通过过滤器F2和蠕动泵P4引入惰性气体N₂和CO₂，发酵罐(3)通过蠕动泵P5和过滤器F1向外排出废液、废气，发酵罐(3)通过蠕动泵P6和恒流培养室(4)连接，每个恒流培养室(4)通过蠕动泵P7和过滤器F3向外排出废液、废气，培养基罐(2)和加样瓶(7)分别通过蠕动泵P2、P3与多个恒流培养室(4)并联连接。

Description

一种口腔生物膜动态模型装置及其形成口腔生物膜的方法

一、技术领域

本发明涉及一种口腔生物膜动态模型装置及其形成口腔生物膜的方法，属于生物膜口腔医疗模型器械或者口腔医学领域。

二、背景技术

作为单细胞的生命形式，细菌在长期以来的研究中始终以游离于液体培养基中的单细胞状态作为研究对象，这样在最大程度上简化了外界环境的影响，也获得了大量的研究成果，为现代微生物学奠定了基础。然而在自然状态下，细菌很少以这种游离于纯培养中的形式而存在。生物膜是细菌最常见的生存形式，是指在固态的有机或无机介质表面，大量微生物集聚于胞外多糖构成的基质内并互相交联而形成的微生物生态环境。

在医学领域中，生物膜病占据了80％以上的微生物感染性疾病。生物膜通过其理化屏障的作用，给致病菌提供了抵御外部刺激的优良生态环境，而在其中发展的基因传导与接合，也有利于不同微生物间对耐药基因的水平传递从而对传统的抗生素疗法造成很大的困难。危害人类口腔健康的主要疾病龋病，其主要致病因素也是以变形链球菌为主构成的致龋性生物膜(牙菌斑)。

在龋病的细菌学研究中，由于口腔生态环境的复杂性，要在体内研究某种或某些细菌与龋病的关系是非常困难的，因此，建立起能模拟口内环境的口腔生物膜模型，有利于在体外进行高可信度的口腔微生物学研究，获得比传统细菌学实验更加准确和全面的结果。生物膜模型能在体外创造一种与体内近似的生态环境，调控细菌的生长代谢条件，使之既具有与天然环境的一致性，又具有标准化和可调控性的显著优点，用生物膜模型来进行口腔生物学实验与简单的体外实验相比，可信度更高，可重复性更好，是一种很有潜力的实验手段。

生物膜模型系统主要目的在于尽可能地模拟出口腔内生态环境，以及将这一人工环境维持于稳定的状态。目前国内刘正等报道的相关生物膜模型(中华口腔医学杂志.1996；31(2)：110-112.)仅为简易的恒化器细菌培养系统，虽能满足基本的微生物连续培养要求，但其结构庞杂，核心部件为发酵罐连续静态培养，仍不能有效模拟出口腔内部唾液等营养液持续不断的流动环境，且对于污染的控制欠佳；而国外的同类产品，如Sissons等于Journal of Dental Research，1991，70(11)：1409-16报道多工作站人工口腔系统(MAM)与Kinniment等建立的恒厚生物膜模型(Microbiology，1996，142，631-638)，尽管对环境条件的控制精度高，但其结构复杂，对外围设备的精度要求相应也高，故其价格昂贵，应用成本居高不下，尽管对口腔环境模拟良好但仍无法获得推广应用。

本发明者在前期研究中建立了由变形链球菌、血液链球菌、唾液链球菌、内氏放线菌等组成的多菌系生物膜模型，中国专利03135320.7题为《口腔生物膜模型装置及其口腔生物膜形成的方法》，实验证明该模型具有较好的可靠性与可重复性，能够用于对口腔生物膜的各项体外研究。然而，在实验当中我们也发现该模型也存在一些缺陷，首先，该生物膜模型仅能对模型中特定并唯一时间点的生物膜形成状况进行观察，所得数据有限，难以实现对实验性生物膜形成过程的全程实时检测。其次是该模型的核心部件恒流培养室为不规则外形，难以作到标准化，在实验中难以控制各恒流培养室的清除率达到一致，使得各恒流培养室难以作到真正意义的平行可比。因此，本发明者对已有生物膜模型的恒流培养室进行了一定的改造，改用标准外形的器件，并根据需要在其顶部设置了多个开口，可以放置多个固定标本的加样器，同时也可以安装多种检测装置(如pH记录仪，氧化还原电势记录仪)的探头。在此基础之上开发出了一种口腔生物膜动态模型装置及形成口腔生物膜的方法，实现了对人工菌斑生物膜的连续实时检测，得到了大量有意义的实验结果，为龋病的病因和发病机制、筛选防龋药物、评估药物防龋效能和研究药物作用机制提供了有力的技术平台，经检索未见有类似的文献报道。

三、发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种可以对人工菌斑生物膜进行连续检测的口腔生物膜动态模型装置及其形成口腔生物膜的方法，其特点是将多个羟磷灰石片(HA Discs)置于含有定量实验菌株的连续培养系统中，定时给以蔗糖溶液以提供实验细菌无氧酵解所需的底物，使细菌在羟磷灰石表面形成实验性生物膜即人工菌斑，然后在生物膜形成过程中的不同时期取出羟磷灰石片，检测其表面形成生物膜的各项生物学指标，以对实验性生物膜的形成过程进行全面的检测，实现对各种防龋药物干预实验性生物膜及龋病形成的全程实时检测，进而确定防龋药物的作用效果和作用机制。

本发明的目的由以下技术措施实现：

口腔生物膜动态模型装置含有碱液罐、培养基罐、发酵罐、恒流培养室和加样瓶。其中恒流培养室为多个竖式标准圆柱形培养室串联连接，碱液罐通过蠕动泵与发酵罐连接，培养基罐通过蠕动泵与发酵罐连接，发酵罐通过过滤器和蠕动泵引入惰性气体N₂和CO₂，发酵罐通过蠕动泵和过滤器向外排出废液、废气，发酵罐通过蠕动泵和恒流培养室连接，每个恒流培养室通过蠕动泵和过滤器向外排出废液、废气，培养基罐和加样瓶分别通过蠕动泵与多个恒流培养室连接。

发酵罐为夹层，夹层内设循化水浴进口和出口，罐内置pH控制电极，发酵罐置于电磁搅拌器上。

恒流培养室为竖式标准圆柱形，恒流培养室顶部设有多个加样器，根据实验要求在多个加样器上放置多个固定标本，固定标本为羟磷灰石，加样器垂直放置于恒流培养室内部，恒流培养室内设多通道pH记录仪电极和废液、废气排出口，恒流培养室放置在恒温培养箱内恒温孵育，由电磁搅拌器提供30rpm左右的搅拌速度以模拟口腔环境内唾液流动的动态环境。

羟磷灰石片由四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室材料研究室提供。

口腔生物膜的形成方法

1、动态模型装置无菌连接完成之后，将发酵罐置于电磁搅拌器上，获得30-100ppm的搅拌速度，温度由循环水浴箱维持在37℃左右，碱液罐提供碱性溶液使发酵罐内菌悬液的液相pH值维持在7.0左右，碱性溶液的加入由pH控制器和蠕动泵调节，待各菌生长稳定后备用。

2、培养基罐内盛有人工唾液培养基BM-5作为实验菌的主要营养来源，由蠕动泵向发酵罐和恒流培养室内恒速加入。

3、加样瓶内盛有防龋药物和蔗糖溶液，由分配器和蠕动泵控制向恒流培养室内加入，以提供实验生物膜致龋的底物蔗糖以及所研究的防龋药物，根据研究目的可以采用不同的药物和药物浓度。

4、恒流培养室置于密封的恒温培养箱内，由电磁搅拌器提供30ppm左右的搅拌速度以模拟口腔环境内唾液流动的动态环境。

5、根据实验要求，在恒流培养室内放置多个加样器，在实验过程中，按照要求的时间间隔，连续取出加样器，检测加样器上羟磷灰石表面形成的生物膜的各项生物学指标，直到全部加样器取尽为止，从而实现了对实验性生物膜形成过程的纵向连续实时监测。

本发明具有如下优点：

1、能有效模拟口内生态环境并稳定地形成实验性生物膜，已通过大量研究验证了其在龋病学与口腔材料学的应用效能。

2、采用多通道并联培养技术，能同时比较不同生物膜处理措施的差别，也极大地简化了工作流程，更便于使用。

3、可以在实验过程中的多个时间点连续取出标本，检测标本表面生物膜的形成状况。根据实验要求设置标本的数量，可以实现对实验性生物膜的全程实时监测。

4、选用的主要设备均为市场上常用产品，成本控制良好，与国际同类产品比较，具有相当好的价格优势。

5、采用密闭培养方式从而有效地控制了污染在模型内的发生。

四、附图说明

图1为口腔生物膜动态模型装置示意图

1、碱液罐2、培养基罐3、发酵罐4、竖式标准圆柱形恒流培养室5、羟磷灰石片6、加样器7、加样瓶8、电磁搅拌器9、恒温水浴箱10、多通道pH测量仪11、电磁搅拌器12、废液出口13、废气出口

P1-P7为蠕动泵

F1-F3为滤器

图2为竖式标准圆柱形恒流培养室结构示意图

图3为恒流培养室液相各处理组pH的动态变化

图4为不同时间各处理组羟磷灰石表面生物膜各菌生长曲线

a、不同时间处理组HAdisc表面生物膜S.mutans生长曲线

b、不同时间处理组HAdisc表面生物膜S.sanguis生长曲线

c、不同时间处理组HAdisc表面生物膜A.naeslundii生长曲线

d、不同时间处理组HAdisc表面生物膜L.rhamnosusi生长曲线

图5为不同时间各处理组羟磷灰石表面生物膜各菌构成图

a、不同时间25mM蔗糖组HAdisc表面生物膜细菌计数

b、不同时间4000ppm五倍子组HAdisc表面生物膜细菌计数

c、不同时间蒸馏水组HAdisc表面生物膜细菌计数

图6为实验组生物膜形态的荧光显微镜观FM×200

A：24小时，B：48小时，C：72小时，D：96小时，E：120小时

图7为阴性对照组生物膜形态的荧光显微镜观FM×200

A：24小时，B：48小时，C：72小时，D：96小时，E：120小时

图8为空白组生物膜形态的荧光显微镜观FM×200

A：24小时，B：48小时，C：72小时，D：96小时，E：120小时

五、具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例：

口腔生物膜动态模型装置如图1-2所示，含有碱液罐1、培养基罐2、发酵罐3、恒流培养室4和加样瓶7。碱液罐1通过蠕动泵P1与发酵罐3连接，其中，恒流培养室为多个竖式标准圆柱形恒流培养室串联连接。培养基罐2通过蠕动泵P2与发酵罐3连接，发酵罐3通过滤器F2和蠕动泵P4引入惰性气体N₂和CO₂，发酵罐3通过蠕动泵P5和滤器F1排出废液、废气，发酵罐3通过蠕动泵P6与多个并联恒流培养室4连接，每个恒流培养室4通过蠕动泵P7和过滤器F3向外排出废液、废气，培养基罐2和加样瓶7分别通过蠕动泵P2、P3与多个恒流培养室4并联连接。发酵罐3通过循环水浴保持罐内温度为37℃，罐内放置pH控制器，维持液相pH值在7.0左右，发酵罐3置于电磁搅拌器8上。每个恒流培养室4内垂直放置有多个加样器6，每个加样器6上固定有羟磷灰石片5，恒流培养室4内同时安装有多通道pH测量记录仪电极10和废液排出口12、废气排出口13，恒流培养室4放置于恒温培养箱9内37℃恒温孵育，由电磁搅拌器11提供30rpm左右的搅拌速度模拟口腔环境内唾液的流动循环。恒流培养室和加样器可用玻璃、塑料或金属制作。羟磷灰石片由四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室材料研究室制作提供。

口腔生物膜的形成方法：

1、动态模型装置无菌连接完成之后，将发酵罐3置于电磁搅拌器8上，获得30-100ppm的搅拌速度，温度由循环水浴箱维持在37℃左右，碱液罐1提供碱性溶液使发酵罐内菌悬液的液相pH值维持在7.0左右，碱性溶液的加入由pH控制器和蠕动泵P1调节，待各菌生长稳定后备用。

2、培养基罐2内盛有人工唾液培养基BM-5作为实验菌的主要营养来源，由蠕动泵P2向发酵罐3和每个恒流培养室4内恒速加入。

3、加样瓶7内盛有防龋药物和蔗糖溶液，由分配器和蠕动泵P3控制向每个恒流培养室4内加入，以提供实验生物膜致龋的底物蔗糖以及所研究的防龋药物，根据研究目的可以采用不同的药物和药物浓度。

4、恒流培养室4置于密封的恒温培养箱内，由电磁搅拌器11提供30ppm左右的搅拌速度以模拟口腔环境内唾液流动的动态环境。

5、根据实验要求，在恒流培养室内放置多个加样器6，在实验过程中，按照要求的时间间隔，连续取出加样器6，检测加样器上羟磷灰石5表面形成的生物膜的各项生物学指标，直到全部加样器取尽为止，从而实现了对实验性生物膜形成过程的纵向连续实时监测。

以下为本模型装置在龋病学研究中的应用实例：

1.实验菌株

变形链球菌  Streptococcus mutans ATCC 25175

血链球菌    Streptococcus sanguis ATCC 10556

内氏放线菌  Actinomyces naeslundii WVU 627

乳酸杆菌    Lactobacillus rhamnosus AC 413

以上菌株均由华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室提供。

2.培养条件

2.1发酵罐培养条件

温度：37℃由循环水浴箱维持；

搅拌：低速，由磁力搅拌器8控制，使发酵罐中菌悬液混匀；

厌氧环境：95％N₂，5％CO₂，流速10ml/min，由蠕动泵P4控制；

pH：用0.1N NaOH溶液维持在0.7左右，由Ph控制仪与蠕动泵P1调节；

清除滤：D＝0.1/hr由蠕动泵P5控制。

2.2恒流培养室培养条件

温度：37℃由循环水浴箱维持

搅拌：低速，由磁力搅拌器11控制，提供生物膜形成过程中需要的剪切力

清除率：D＝0.75/hr由蠕动泵P7控制

给样：恒流培养室内各实验菌生长达到稳定后，每12小时给样1次，每次给样量为生物膜连续培养系统总容积的1/10，加样由蠕动泵P3及分配器控制。

3.实验流程

本实验为模拟牙齿表面菌斑生物膜的形成，采用羟磷灰石片(HA Discs)置于含有实验混合菌株的连续培养系统中，以在其表面形成多菌系生物膜。模型中的发酵罐为实验混合菌的储库，而与发酵罐相连的数个平行的恒流培养室为实验生物膜形成的场所。

实验开始时，将在TPY固体培养基中复苏的变形链球菌、乳酸杆菌、血链球菌与内氏放线菌传代，经过生化鉴定后接种到发酵罐的人工唾液培养基中进行连续培养，其pH值由pH控制器控制平衡，新鲜人工唾液培养基由蠕动泵连续加入。基础连续培养达到稳定之后，将发酵罐中的混合菌悬液通过蠕动泵加入到各个平行的恒流培养室中，同时向各恒流培养室中加入新鲜的人工唾液培养基，细菌与新鲜培养基的比例为1∶9(v/v)，24小时后停止接种细菌，继续加入新鲜人工唾液至各恒流培养室中进行连续培养。每日对恒流培养室液相环境中的细菌进行生长检测，待各恒流培养室中的混合菌连续培养达到稳定之后(连续三日无显著差异)，在各恒流培养室中插入多个固定有HA Discs的加样器，使HA Discs完全浸入混合菌悬液中，同时将处理溶液加入恒流培养室中(1次/12小时，每次加入体积为恒流培养室溶液体积的1/10)，此后，按照24小时的时间间隔连续从恒流培养室中取出一个加样器，对HA Discs表面形成的生物膜进行细菌计数、结构观察，直至恒流培养室中的加样器取尽为止。

4.人工唾液

本实验采用的人工唾液配方为生物膜改良培养基BM-5：

III型猪胃粘蛋白(Hog gastric mucin，Type III，Sigma)  2.50g/l

肽胨(Proteose peptone，Fluka)  2.00g/l

胰酶分解酪蛋白胨(Peptone from casein，tryptic digest，Fluka)  1.00g/l

酵母提取物(Yeast extract，Oxoid)  1.00g/l

氯化钾(KCl)  2.50g/l

葡萄糖(Glucose)  0.50g/l

胱氨酸盐酸盐(Cystiene-Hydrochloride，Sigma)  0.10g/l

氯化血红素(Heamin，上海东风生化技术公司)  1.00mg/l

四川大学博士学位论文14

磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)  0.114g/l

磷酸二氢钾(KH2PO4)  0.20g/l

以1N NaOH溶液调整其pH值为7.5，121℃，15psi，消毒70min。

5.实验结果示例

本例为研究天然药物五倍子对实验生物膜的影响

A实验分组

根据对恒流培养室中加样的不同，分为以下各组：

阴性对照组：25mM蔗糖溶液，加入恒流培养室中的终浓度为2.5mM。

空白对照组：不含任何糖类的蒸馏水作为空白对照。

实验组：含4mg/ml的五倍子提取物的25mM蔗糖溶液，加入恒流培养后药物终浓度为0.4mg/ml。

B恒流培养室液相各处理组pH的动态变化

如图3所示，在8次加药的过程中，阳性对照组加入浓度为25mmol/L的蔗糖溶液后pH值出现了周期性波动，在3个小时左右达到最低点，最低pH下降至4.5以下，随着时间的推移，pH逐渐上升，大约3个小时以后恢复到加糖前的水平。在实验组，同样反映出相似的pH变化规律。随着五倍子的加入，pH出现缓慢下降，于3小时左右达到最低点，随后缓慢上升，6小时后恢复到加药前的水平，约pH7.0左右。整个连续培养过程中，蒸馏水组pH未见明显波动，维持在pH7.5左右。

C恒流培养室中HAdic表面实验生物膜活菌计数

在生物膜培养周期内，不同药物处理对不同时间，不同种类的生物膜细菌定植的影响不同。五倍子组表现出同蒸馏水组和蔗糖组相似的细菌定植稳定期(约72小时)，24小时生物膜细菌计数和120小时生物膜细菌计数有显著性差异(P＜0.05)，对各实验菌株而言，五倍子组表现出对乳酸杆菌明显的抑制作用，整个培养周期其细菌计数均较低，对变形链球菌也有一定的抑制，对内氏放线菌、血液链球菌抑制不明显。对120小时生物膜，五倍子组与蔗糖组相比，乳酸杆菌被明显抑制(P＜0.05)，变形链球菌也在一定程度上被抑制，内氏放线菌、血液链球菌抑制不明显。对生物膜细菌构成，虽然各实验菌在生物膜黏附数量上有着一定的差异，但各组在细菌构成上未见有显著变化(P＞0.05)。

D各处理组实验生物膜形态的荧光显微镜观察

生物膜的FM观察发现，随着连续培养时间的增加，各组生物膜均表现出细菌及胞外多糖基质的增加，但各处理组表现为完全不同的生物膜形态外观。同蔗糖组相比，即使在120小时生物膜，五倍子组也未见大量成团、成片的致密细菌多糖基质团块，生物膜呈现较为疏松的外观。

Claims (4)

1、一种口腔生物膜动态模型装置，含有碱液罐(1)、培养基罐(2)、发酵罐(3)、恒流培养室(4)和加样瓶(7)，其特征在于恒流培养室(4)为多个竖式标准圆柱形培养室串联连接，碱液罐(1)通过蠕动泵P1与发酵罐(3)连接，培养基罐(2)通过蠕动泵P2与发酵罐(3)连接，发酵罐(3)通过过滤器F2和蠕动泵引入惰性气体N₂和CO₂，发酵罐(3)通过蠕动泵P5和过滤器F1向外排出废液、废气，发酵罐(3)通过蠕动泵P6和恒流培养室(4)连接，每个恒流培养室(4)通过蠕动泵P7和过滤器F3向外排出废液、废气，培养基罐(2)和加样瓶(7)分别通过蠕动泵P2、P3与多个恒流培养室(4)并联连接。

2、如权力要求1所述口腔生物膜动态模型装置，其特征在于发酵罐(3)为夹层，夹层内设循环水浴进口和出口，罐内置pH控制电极，发酵罐(3)置于电磁搅拌器(8)上。

3、如权力要求1所述口腔生物膜动态模型装置，其特征在于恒流培养室(4)为竖式标准圆柱形，每个恒流培养室(4)的顶部设有多个加样器(6)，根据实验要求可在多个加样器上放置多个固定标本，固定标本为羟基磷灰石，加样器(6)垂直放置于恒流培养室(4)内部，恒流培养室(4)内设多通道pH记录仪(10)电极，废液排出口(12)、废气排出口(13)，恒流培养室(4)放置在恒温培养箱内恒温孵育，由电磁搅拌器(11)提供30rpm左右的搅拌速度以模拟口腔环境内唾液的动态流动环境。

4、如权力要求1～3之所述口腔生物膜动态模型装置形成口腔生物膜的方法，其特征在于该方法含有以下步骤：

1)动态模型装置连接完成之后，将发酵罐(3)置于电磁搅拌器(8)上，获得30～100rpm的转速，温度由循环水浴保持在37℃左右，碱液罐(1)提供碱液使发酵罐内的pH＝7.0左右，由pH控制器和蠕动泵P1调节，待各菌生长稳定后备用。

2)培养基罐(2)内盛有人工唾液培养基BM-5，作为实验菌的主要营养来源，由蠕动泵P2向发酵罐(3)和每个恒流培养室(4)内恒速加入。

3)加样瓶(7)内盛有药物和蔗糖溶液，向每个恒流培养室(4)内实验生物膜提供致龋的底物蔗糖以及所需研究的防龋药物，根据研究目的的差别可采用不同的药物和浓度。

4)恒流培养室(4)置于密封的横流培养箱内，由电磁搅拌器(11)提供30rpm左右的搅拌速度以模拟口腔环境内唾液流动的动态环境。

5)根据实验要求，在每个恒流培养室(4)内放置多个加样器(6)，在实验过程中，按照要求的时间间隔连续取出加样器(6)，检查加样器(6)上羟磷灰石表面形成的生物膜的各项生物学指标，直到全部加样器(6)取尽为止，从而实现了对实验性生物膜形成过程的纵向连续实时监测。

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