CN108048359A - 一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用 - Google Patents

一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及口腔护理产品抗菌功效评价技术领域，具体为一种牙菌斑生物膜模型的培养方法、优化的生物膜活菌计数法及快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法。本发明提供的牙菌斑生物膜模型的培养方法通过优化培养条件，能培养形成可提高对口腔护理产品抗菌功效评价准确度的牙菌斑生物膜模型。本发明提供的优化的生物膜活菌计数法可提高活菌计数结果，更加接近真实的生物膜上活体细菌的数目。本发明提供的快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，不仅检测结果较游离菌法更接近消费者实际使用后的评价结果，还能大幅减少口腔产品的功效评价耗时，从而可为快速区分口腔产品功效提供数据支持，并且重复性强，结果稳定性好；成本较低，培养条件容易满足。

Description

一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数 法及应用
技术领域
本发明涉及口腔护理产品抗菌功效评价技术领域，具体涉及一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法，以及利用牙菌斑生物膜模型评价口腔护理产品的杀菌功效和抑菌功效的方法。
背景技术
口腔里生存着多种多样的微生物，包括细菌、真菌、病毒、支原体、原虫等，其存在形式包括游离态和聚集态，游离态的微生物称为浮游微生物，聚集态的微生物主要以牙菌斑生物膜的形式存在于人的口腔。与游离态相比，以生物膜形式存在的微生物群具有以下特点：
(1)微生物之间相互积聚和定殖，具有空间和环境的多样性；
(2)活性强，能够抵御苛刻的环境而存活；
(3)耐受性强，对抗菌剂敏感性下降；
(4)能表达不同于浮游细菌的表型。
牙菌斑生物膜中微生物的生存能力、抗药性、代谢效率均显著高于浮游微生物；两者呈现完全不同的生理特征。
口腔里众多的微生物彼此之间处于一种平衡状态，一旦这种平衡被打破，就将导致龋齿，牙龈炎，牙周炎和口源性口臭病等口腔多微生物疾病的发生。牙菌斑是一种经典的生物膜，是粘附在牙齿表面或口腔其他软组织上的微生物群，这些微生物大多为兼性厌氧菌或者严格厌氧菌，其代谢活性强，比菌斑生物膜外的微生物更难被杀灭或祛除，从而大大增加了龋病和牙周病等口腔疾病发生的几率。因此是否能够有效预防和抑制牙菌斑成为了评价口腔护理产品的一个重要指标之一。
长期以来，牙膏、漱口水等口腔护理产品的抗菌功效体外检测主要是通过对游离菌的抗菌功效来评价。目前的体外检测方法主要采用菌悬液抗菌测试法、微量肉汤稀释法检测最小抑菌浓度MIC等试验来检验口腔护理产品对口腔游离细菌的抗菌作用。显然，口腔护理产品对于游离菌的抗菌效能和对生物膜的抗菌效能不能等同视之。例如，口腔护理产品对游离菌的效果是以悬液法测定产品的抑菌率(Inhibition Rate,IR)来评价，大部分样品的结果为＞99.9％。口腔中大多数的致病菌是存在于牙菌斑生物膜中，导致生物膜中的微生物远比游离菌难被杀灭，口腔护理产品中的抗菌剂必须渗透到生物膜内部才能发挥作用。因此，针对游离菌的悬液法抗菌测试难以反映口腔护理产品对于口腔内微生物真实的杀灭/抑制效果。
综上所述，游离菌的抗菌测试方法(或称游离菌法)不能获得真实情况下口腔产品抗菌效能评价数据，难以指引相关产品的开发和优化。为了获得更加接近真实情况的结果，牙膏、漱口水等口腔护理产品对生物膜的抗菌功效的评价目前主要是通过临床试验来完成。临床试验是一种较为真实和客观地评价产品对生物膜抗菌效能的方法，其结果相对可靠又有代表性，但也存在一些明显的缺点：(1)耗时长，约需1周；(2)费用高；(3)受测个体差异性大；(4)需要受测个体的高度配合。口腔护理产品的前期配方研究需要对大量不同浓度的抗菌原料进行筛选，临床试验不利于口腔护理产品的前期大量配方的筛选工作。
因此，建立一种快速、重复性强、结果可信的抗菌功效测试与评价方法，对于口腔护理产品的开发和配方筛选是非常必要的。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种可靠的且可提高对口腔护理产品抗菌功效评价准确度的牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法，以及可快速高效、重复性强的评价口腔护理产品抗菌功效的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，包括以下步骤：
S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；
S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；
S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型；
所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；
所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；
所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。
更优选的，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.2％。
优选的，所述口腔致病菌包含血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。
优选的，所述无氧气氛是指由体积比为80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳构成的气体环境。
优选的，所述恒温的温度为36℃。
优选的，所述成膜介质为牙齿、玻片、羟磷灰石片或塑料片。
更优选的，所述成膜介质为TC处理的细胞培养板。
一种优化的生物膜活菌计数法，所述生物膜为以上所述的牙菌斑生物膜模型，所述优化的生物膜活菌计数法包括以下步骤：
S201消化分散：牙菌斑生物膜模型使用TC处理的24孔细胞培养板培养形成时，牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液后转移至无菌离心管中；
S202超声分散：将装有生物膜菌悬液的离心管置于超声波清洗仪中并在25℃下超声6min；
S203计数：用活菌计数法测定生物膜菌悬液中的细菌数目，即为牙菌斑生物膜中的活菌数目。
一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，包括以下步骤：
S301、沿以上所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；
S302、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入与样品溶液等体积的以上所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；
S303、重复步骤S302两次；
S304、用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定经步骤S303处理的牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NS；
S305、在以上所述且未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S302和S303，然后用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定该孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NC；
S306、口腔护理产品的对牙菌斑生物膜模型的相对杀菌率BRSR为或LgNc-LgNs。
另一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，包括以下步骤：
S401、沿以上所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；
S402、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入等体积以上所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；
S403、重复步骤S402两次；
S404、向牙菌斑生物膜模型的孔中加入1mL的BHI富集培养基，并将牙菌斑生物膜模型置于无氧气氛及恒温的环境培养4～8小时；
S405、吸取并弃去经步骤S404处理的牙菌斑生物膜模型孔中的菌悬液，以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养后的活菌数目，记为NS’；
S406、在以上所述且未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S402和S403，然后用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养后的活菌数目，记为NC’；
S407、口腔护理产品对牙菌斑生物膜模型的相对抑菌率BRIR为或LgNc'-LgNs'。
再一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，包括以上所述的两种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法的步骤，即通过上述两种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法的步骤分别测试获得口腔护理产品对牙菌斑生物膜模型的相对杀菌率BRSR和相对抑菌率BRIR。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，通过优化培养条件，在特定的培养条件下培养形成可靠的且可提高对口腔护理产品抗菌功效评价准确度的牙菌斑生物膜模型，尤其是通过加入一定含量的碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂，可保证后续对口腔护理产品评价准确度的情况下有效缩短牙菌斑生物膜模型的培养时间。
本发明提供的优化的生物膜活菌计数法，先通过0.25％的胰酶溶液对牙菌斑生物膜模型进行消化分散，再对形成生物膜菌悬液进行超声分散，然后采用活菌计数法计算细菌数目，细菌团分散效果明显，可提高活菌计数结果，更加接近真实的生物膜上活体细菌的数目。
本发明提供的快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，不仅检测结果较游离菌法更接近消费者实际使用后的评价结果，还能大幅减少口腔产品的功效评价耗时，从而可为快速区分口腔产品功效提供数据支持，并且重复性强，结果稳定性好；成本较低，培养条件容易满足。
附图说明
图1是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率(BRSR，％)结果分析图；
图2是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率(BRSR，KL)结果分析图；
图3是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对抑制率(BRIR，％)结果分析图；
图4是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对抑制率(BRIR，KL)结果分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书的公开内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。
除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总重量计算的。除非另外指明，有关所列成分的所有重量均给予活性物质的含量，因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“重量含量”可用符号“％”表示。
除非另外指明，在本文中所有溶液配制发生在25℃的环境，所有的细菌培养及样品测试发生在36℃无氧气氛。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
生物膜
本发明涉及的生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌聚集群体。
牙菌斑生物膜
本发明涉及的牙菌斑生物膜是指牙面上或牙周袋内的多种多样微生物构成的生态系，各种细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。
生物膜附着力
本发明涉及的生物膜附着力和牙菌斑生物膜附着力是完全等同的，两者不作区分。生物膜附着力是指生物膜在成膜介质上粘附能力。生物膜附着力太弱，生物膜容易在物理作用(如液体冲刷)下脱落，导致相关结果偏低，影响方法的可信度。
游离菌的抗菌测试方法(游离菌法)
本发明涉及的游离菌法是指通过对游离菌的抗菌功效来评价口腔护理产品的功效，是体外检测方法的一种。目前的体外检测方法主要采用菌悬液抗菌测试法、微量肉汤稀释法检测最小抑菌浓度MIC等试验来检验口腔护理产品对口腔游离细菌的抗菌作用。
生物膜的抗菌测试方法(生物膜法)
本发明涉及的生物膜法是通过对牙菌斑生物膜的抗菌功效来评价口腔护理产品的功效，是体外检测方法的一种。
口腔厌氧菌
牙菌斑生物膜中的细菌以口腔厌氧细菌为主，包括兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌。兼性厌氧细菌在有氧和无氧环境均能生长，严格厌氧细菌只能在无氧环境中生长。
口腔致病菌
口腔致病菌是指在一定条件下导致如龋齿、牙龈炎、牙周炎和口源性口臭病等口腔疾病的微生物，尤其是细菌，包括好氧细菌、兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌。
口腔厌氧致病菌
本发明涉及的口腔厌氧致病菌选自血链球菌(Streptococcus sanguisATCC49295)，变异链球菌(Streptococcus mutans ATCC25175)，粘性放线菌(Actinomycesviscosus ATCC27044)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosusATCC7469)，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis ATCC33277)，具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum ATCC25586)。
牙菌斑生物膜
本发明涉及的牙菌斑生物膜模型是指体外的牙菌斑生物膜。牙菌斑生物膜和牙菌斑生物膜模型在本文中不作区分。具体是指在特定的培养气氛下，以培养介质对口腔致病菌培养一段时间后，在成膜介质上生长一段时间，然后进行浮游微生物的去除，最后在成膜介质的表面获得牙菌斑生物膜。
培养气氛和无氧气氛
本发明涉及的培养气氛是指整个生物膜模型装置的气体环境。本发明采用的培养气氛为无氧气氛，其具体组成为体积比80％氮气，10％氢气，10％二氧化碳。培养气氛通过厌氧工作站来实现的。本发明中使用的厌氧工作站是ELECTROTEK公司的300SG型号。
成膜介质
本发明涉及的成膜介质是指在牙菌斑生物膜模型中生物膜生长粘附的材料。成膜介质是牙菌斑生物膜模型的必要组成部分，用于替代活人牙齿作为生物膜生长粘附的底物。成膜介质可以是牙齿、玻片、羟磷灰石片、塑料等硬性材料。本发明中选择TC处理的细胞培养板(表面亲水改性处理)作为成膜介质，TC全称为Tissue culturetreated，TC处理表示该器皿经过表面的改性处理，适合贴壁细胞的培养。改性后的细胞培养板特征在于对细胞吸附能力、与蛋白结合能力较改性前有大幅提升。细胞培养板为聚苯乙烯材质。
培养介质和厌氧菌培养基
口腔致病菌在体外培养并聚集形成牙菌斑生物膜这一过程需要外界为其提供营养环境。该营养环境在本发明中称为培养介质。本发明选用厌氧菌培养基作为培养介质。
本发明涉及的厌氧菌培养基是指脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基和胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)补加培养基。
脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基是指每升脑心浸出液肉汤(BHI)培养基含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。
胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)补加培养基是指每升胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素、1毫克维生素K1。
附着力促进剂
本发明采用了在牙菌斑生物膜培养液(仅指BHI富集培养基)中添加碳酸钙悬浊液作为牙菌斑生物膜的附着力促进剂，培养液中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％，该附着力促进剂能够有效减少牙菌斑生物膜培养液酸碱度对牙菌斑生物膜菌种的生长抑制及酸蚀，增加牙菌斑生物膜在成膜介质上的附着能力。
牙菌斑生物膜的制备方式
本发明涉及的牙菌斑生物膜的制备方式如下：
S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；
S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；
S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型。
口腔护理产品
本发明涉及的口腔护理产品，具体是指牙膏，漱口水，口腔喷雾等。
测试样液
以下实施例和对比例中所用的口腔护理产品为牙膏，涉及到的测试样液是指用硬水将牙膏配制成重量体积比(g/mL)为50％的悬浊液(如将5g牙膏与硬水配制成10mL悬浊液)。硬水是指硬度以碳酸钙计为300～450mg/L的水。
抗菌
抗菌是指采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程，是杀菌和抑菌的统称。
活菌计数法
本发明涉及的活菌计数法是指将游离菌悬液或牙菌斑生物膜重悬液经一系列10倍稀释，然后选择2-4个稀释度的菌液，分别取0.2～1mL放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)补加培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，在无氧气氛、恒温36℃的环境培养，培养48小时长出菌落后，计数，计算出每毫升原菌液活菌数目。
口腔护理产品对游离口腔细菌的抑菌率
本发明涉及的口腔护理产品对游离口腔细菌的抑制率(IR)，是用于评价口腔护理产品对于游离菌抑制效能的常规方法。
本发明涉及的口腔护理产品对游离口腔厌氧菌的抑菌率IR，按下式(1)计算：
NYS：经过口腔护理产品处理的菌悬液中活菌数目；
NYC:没有经过口腔护理产品处理的对照菌悬液中活菌数目。
游离口腔细菌抑菌率测试步骤：
S001、分别将每种口腔致病菌独立地在无氧气氛、恒温36℃的环境中在TSA补加培养基平板上划线培养2至6天，直至平板上出现大量菌苔；
S002、分别将每种培养后的口腔致病菌接种到BHI富集培养基，在无氧气氛、恒温36℃的环境中培养1至3天，直到培养基浑浊，表示菌悬液培养成熟；
S003、吸取成熟的菌悬液0.2mL，加入预先制备的10mL测试样液中，迅速混匀，保留30秒至3分钟；
S004、用活菌计数法测定上述菌悬液中的细菌数目，即为经过口腔护理产品处理的菌悬液中活菌数目。
S005、重复步骤S001、、S002；吸取成熟的菌悬液0.2mL，加入10mL BHI富集培养基中，迅速混匀，保留30秒至3分钟；用活菌计数法测定菌悬液中的细菌数目，即为未经口腔护理产品处理的菌悬液中初始细菌数目。
常规生物膜活菌计数法
本发明涉及的常规生物膜活菌计数法是指对牙菌斑生物膜采用活菌计数法进行细菌数目测试。在测试过程中，不使用胰酶进行消化分散和超声分散。
改良和优化生物膜活菌计数法
牙菌斑生物膜中的细菌通过各种蛋白粘结素牢固地聚集在一起，用移液器吹打生物膜悬液无法将细菌团完全吹散为游离个体，在对牙菌斑生物膜进行活菌计数时会造成极大误差。改良和优化生物膜活菌计数法是采用胰蛋白酶对牙菌斑生物膜进行作用能水解细胞间的蛋白质，促进生物膜中细菌个体之间的分散；另外超声波清洗仪是利用超声波通过液体介质进行振荡将物质分开等，也能有效促进生物膜中细菌个体之间的分散。
改良的生物膜活菌计数法
本发明涉及的改良的生物膜活菌计数法，具体为包括可选步骤(1)，可选步骤(2)和必选步骤(3)。使用改良的生物膜活菌技术法时，可选步骤(1)和可选步骤(2)中至少要执行一项，必选步骤(3)则必须执行。
可选步骤(1)用胰酶对牙菌斑生物膜进行消化分散。向牙菌斑生物膜孔中加入100～200μL含量为0.25％的胰酶溶液(0.25％Trypsin-EDTA)，作用5至15分钟后，沿孔壁向小孔中加入BHI富集培养基至总体积1mL，将其中的生物膜吹打混匀重悬后转移至1.5mL无菌离心管中。
可选步骤(2)用超声波清洗仪进行超声分散。若牙菌斑生物膜未经步骤(1)处理，先沿孔壁向小孔中加入BHI富集培养基至总体积1mL，将其中的生物膜吹打混匀重悬后转移至1.5mL无菌离心管中。将装有生物膜菌悬液的离心管放置入泡沫浮板中，在超声波清洗仪(SB-4200D，宁波新芝生物)中25℃下超声2至8分钟。
必选步骤(3)对牙菌斑生物膜进行活菌计数。用活菌计数法测定小孔中的细菌数目，即为牙菌斑生物膜中的活菌数目。
优化的生物膜活菌计数法
牙菌斑生物膜中的细菌通过各种蛋白粘结素牢固地聚集在一起，用移液器吹打生物膜悬液无法将细菌团完全吹散为游离个体，在对牙菌斑生物膜进行活菌计数时会造成极大误差。采用胰蛋白酶对牙菌斑生物膜进行作用能水解细胞间的蛋白质，促进生物膜中细菌个体之间的分散。超声波清洗仪是利用超声波通过液体介质进行振荡将物质分开等，也能有效促进生物膜中细菌个体之间的分散。
本发明涉及的优化生物膜活菌计数法，具体为先用胰酶对牙菌斑生物膜进行消化分散，再用超声波清洗仪进行超声分散，最后用活菌计数法对牙菌斑生物膜进行活菌计数。包含以下操作步骤：
S201消化分散：牙菌斑生物膜模型使用TC处理的24孔细胞培养板培养形成时，向牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液后转移至无菌离心管中；
S202超声分散：将装有生物膜菌悬液的离心管置于超声波清洗仪中并在25℃下超声6min；
S203计数：用活菌计数法测定生物膜菌悬液的细菌数目，即为牙菌斑生物膜中的活菌数目。
口腔护理产品的抗菌功效
本发明涉及的口腔护理产品的抗菌功效，具体是指口腔护理产品对牙菌斑生物膜的杀灭效能和抑制效能。杀灭效能，具体是通过计算口腔护理产品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率来评价，相对杀菌率越高，口腔护理产品对牙菌斑生物膜的杀灭效能越强。抑制效能，具体是通过计算口腔护理产品对牙菌斑生物膜的相对抑菌率来评价，相对抑制率越高，口腔护理产品对牙菌斑生物膜的抑制效能越强。
口腔产品的生物膜相对杀菌率
本发明涉及的口腔产品的生物膜相对杀菌率(BRSR)，按照下式(2)或下式(3)计算：
BRSR(％)：口腔护理产品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率，以百分比表示；
NS：经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目；
NC：没有经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目；
BRSR(KL)＝LgNc-LgNs
(3)
BRSR(KL)：口腔护理产品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率，以对数值表示。
生物膜相对杀菌率测试步骤：
S301、沿以上所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；
S302、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入与样品溶液等体积的以上所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；
S303、重复步骤S302两次；
S304、用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定步骤S303牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NS；
S305、在以上所述未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S302和S303，然后用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定该孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NC；
S306、按照式(2)或式(3)进行生物膜相对杀菌率BRSR的计算。
口腔产品的生物膜相对抑菌率
本发明涉及的口腔产品的生物膜相对抑菌率(BRIR)，按下式(4)或下式(5)计算相对抑菌率：
BRIR(％)：口腔护理产品对牙菌斑生物膜的相对抑菌率，以百分比表示；
NS’：经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养4～8小时后的活菌数目；
NC’:没有经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养4～8小时后的活菌数目。
BRIR(IL)＝LgNc'-LgNs'
(5)
BRIR(IL)：口腔护理产品对牙菌斑生物膜的相对抑菌率，以对数值表示。
生物膜相对抑菌率的测试步骤：
S401、沿以上所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；
S402、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入等体积以上所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；
S403、重复步骤S402两次；
S404、向牙菌斑生物膜模型的孔中加入1mL的BHI富集培养基，并将牙菌斑生物膜模型置于无氧气氛及恒温的环境培养4～8小时；
S405、吸取并弃去步骤S404牙菌斑生物膜模型孔中的菌悬液，以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养后的活菌数目，记为NS’；
S406、在以上所述未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S402和S403，然后用以上所述的优化的生物膜活菌计数法测定牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养后的活菌数目，记为NC’；
S407、按照式(4)或式(5)进行生物膜相对抑制BRIR率的计算。
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员使用以上所述即可最大限度地使用本发明。下面的实施例目的在于进一步介绍和展示在本发明范围内的具体实施方案。因此，实施例应理解为仅用于更详细地展示本发明，而不以任何方式限制本发明的内容。
以下实施例中，除非另外指明，所有的含量均是重量百分含量，有关所列成分的含量是经过换算的活性物质的含量。
在所述实施例中，将使用下面的牌号和缩写。
(1)菌种
血链球菌Streptococcus sanguis ATCC49295；
变异链球菌Streptococcus mutans ATCC25175；
粘性放线菌Actinomycesviscosus ATCC27044；
鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus ATCC7469；
牙龈卟啉单胞菌Porphyromonasgingivalis ATCC33277；
具核梭杆菌Fusobacteriumnucleatum ATCC25586；
以上菌种均购于广东省微生物菌种保藏中心。
(2)试剂
脑心浸出液肉汤(BHI)培养基；胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基；蔗糖；葡萄糖；D-甘露糖；酵母提取物；L-半胱氨酸氨酸盐酸盐；氯化血红素；维生素K1；0.25％胰酶溶液(0.25％Trypsin-EDTA，Gibco)。
(3)厌氧菌培养基制备
厌氧菌培养基的制备步骤如下：
1)溶液制备
0.5g/mL L-半胱氨酸盐酸盐水溶液：将0.5克L-半胱氨酸盐酸盐溶解于1毫升去离子水中，经0.22μm滤膜过滤，保留滤液，储存温度为4℃；
5g/L氯化血红素水溶液：将氯化血红素0.5克和1.74克磷酸氢二钾，溶解于100毫升去离子水中，0.22μm滤膜过滤，保留滤液，盛载滤液的容器以锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃；
5g/L维生素K1乙醇溶液：将50毫克维生素K1溶解于10毫升无水乙醇中，盛载溶液的容器锡箔纸包裹外表面并避光储存，储存温度为4℃。
2)脑心浸出液肉汤(BHI)富集培养基制备
称取37克脑心浸出液肉汤(BHI)培养基干粉、1克蔗糖、1克葡萄糖和1克D-甘露糖，加入1升去离子水，115℃高压灭菌15分钟。灭菌后的培养基冷却至50℃以下后加入1毫升0.5g/L的L-半胱氨酸氨酸盐酸盐溶液、1毫升5g/L氯化血红素溶液和0.2毫升5g/L维生素K1溶液。
3)胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)补加培养基制备
称取40克胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基干粉、0.5克酵母提取物，加入1升去离子水，121℃高压灭菌15分钟。灭菌后的培养基冷却至50℃以下后加入1毫升0.5g/L的L-半胱氨酸氨酸盐酸盐溶液、1毫升5g/L氯化血红素溶液和0.2毫升5g/L维生素K1溶液。
测试样品
本文中的实施例和对比例的测试样品为牙膏。编号为牙膏1，牙膏2，牙膏3。三个牙膏的配方组成完全相同，区别是抗菌剂(三氯生)含量不同。牙膏1的三氯生含量较低；牙膏2和牙膏3的三氯生含量相近，牙膏3中的三氯生含量高于牙膏2。
本发明涉及的牙菌斑生物膜的制备方式如下：
1)分别将每种口腔致病菌独立地在无氧气氛、恒温36℃的环境中在TSA补加培养基平板上划线培养2至6天，直至平板上出现大量菌苔；2)分别将每种培养后的口腔致病菌接种到BHI富集培养基，在无氧气氛、恒温36℃的环境中培养1至3天，直到培养基浑浊，表示菌悬液培养成熟；3)将成熟的菌悬液按照体积比2％～8％的比例混合到添加有附着力促进剂的BHI富集培养基中，在无氧气氛、恒温36℃的环境接种到TC处理细胞培养板的小孔中，在细胞培养板底部形成牙菌斑生物膜；培养时间为14小时至18小时。
分别采用上文所述常规生物膜活菌计数法、改良生物膜活菌计数法和优化的生物膜活菌计数法测试以上培养形成的牙菌斑生物膜(模型)，各种测试方法的检测结果如下表1所示。
生物膜活菌计数方法的对比
表1不同生物膜活菌计数方法对牙菌斑生物膜的测试结果
如表1所示，常规生物膜活菌计数法测得生物膜的活菌含量1.7E+08cfu/孔。按下式(6)计算，不同方法对测试结果的影响。
A1：常规生物膜活菌计数法的测试结果，单位cfu/孔；
A2：改良的生物膜活菌计数法或优化生物膜活菌计数法的测试结果，单位cfu/孔。
由式(6)可知，增长率越高，说明测定样品的活菌数目越多，更加接近真实的生物膜上活体细菌的数目。可见，计数对比例的增长率都低于200％，普遍在100％以下。胰酶和超声波单独作用时活菌计数结果增加。而实施例的增长率全部都在200％以上。牙菌斑生物膜经过胰酶和超声波处理后其中的细菌团分散效果明显。当二者复合作用时，活菌计数结果有了进一步的提升。
上述结果说明，采用常规生物膜活菌计数法和改良的生物膜活菌计数法有可能产生较低的活菌数目，直接影响测试的结果，继而影响口腔产品的功效判断。而本发明的技术方案采用优化的生物膜活菌计数法，增长率全部都在200％以上，活菌量大，更加接近真实的牙菌斑生物膜上活体细菌的数目。
生物膜法和游离菌法的对比
采用生物膜法、游离菌法的测试结果和市场调研的结果进行对比。
市场调研方法
在广州市荔湾区某社区抽取34名年龄在25～50岁的牙膏试用志愿者进行牙膏样品的市场调研。要求调研人群每天刷牙两次，试用周期10天，在10天内，每款牙膏早上使用的总次数不少于3次，每款牙膏晚上使用的总次数不少于3次，以此进行牙膏刷牙后清洁口腔和清新口腔方面的功效评价。评价内容分为清洁口腔和清除口气/口腔异味两个方面，评分采用5分制，1分效果最差，5分效果最好。总体评价结果以均值表示，均值的计算方法如下：各评分等级中的志愿者百分比乘以对应评分等级的分值，得到相应评分等级的转化值；各评分等级的转化值之和即为均值。均值越高说明样品在清洁口腔或清除口气/口腔异味的表现越好。
游离菌法(对比例1)
具体包括以下步骤：
1)口腔致病菌的培养
本发明选择培养气氛为无氧气氛、恒温36℃的环境中在无菌TSA补加培养基平板上划线培养2至6天，直至平板上出现大量菌苔。从平板上挑取菌苔接种至TSB补加培养基中培养2至6天，当菌液明显混浊时该步骤完成。
2)口腔护理产品对游离口腔厌氧菌的抑菌测试
游离口腔厌氧菌抑菌率测试步骤：
吸取制备好的口腔细菌菌悬液0.2mL，加入预先制备的10mL测试样液中，迅速混匀，保留30秒至3分钟(本对比例的测试样液为牙膏样品的测试样液，测试保留时间为3分钟)；用活菌计数法测定样品菌悬液中的细菌数目，即为经过口腔护理产品处理的菌悬液中活菌数目；用活菌计数法测定未经口腔护理产品(未加入测试样液)处理的菌悬液中细菌数目，即为菌悬液中初始活菌数目。3)口腔护理产品对游离口腔厌氧菌的抑菌功效的评价
计算口腔护理产品样品对游离口腔厌氧菌的抑菌率(IR)，对口腔护理产品对牙菌斑生物膜的抑菌功效进行评价。
生物膜法(实施例1)
具体包括以下步骤：
1)牙菌斑生物膜的培养
按照牙菌斑生物膜模型的制备例中的步骤在TC处理的24孔细胞培养板中培养牙菌斑生物膜。添加碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂，培养时间为16小时。
2)利用牙菌斑生物膜进行口腔护理产品的抗菌测试
吸取TC处理细胞培养板两个小孔中的菌悬液，弃去；沿孔壁加入0.2mL～1mL一定浓度的口腔护理产品样品(本实施例的测试样液为牙膏样品的测试样液)，保留3分钟，吸取样品，弃去；立刻沿孔壁向小孔中加入等体积的BHI富集培养基，吸取BHI富集培养基，弃去；再两次沿孔壁向小孔中加入等体积的BHI富集培养基，吸取BHI富集培养基，弃去；在两个小孔中各加入1mLBHI富集培养基，将其中一个小孔中的生物膜吹打混匀重悬，用优化生物膜活菌计数法计算生物膜菌悬液中的活菌含量，将另外一个小孔的生物膜在无氧气氛、恒温36℃的环境继续培养4～8小时，利用优化生物膜活菌计数法计算生物膜中的活菌含量；未经样品作用的对照孔用厌氧菌培养基作相同的处理。
3)口腔护理产品对牙菌斑生物膜的抗菌功效的评价
利用优化生物膜活菌计数法对经过口腔护理产品样品处理的牙菌斑生物膜中的活菌含量进行分析。计算口腔护理产品样品对牙菌斑生物膜的生物膜相对杀菌率BRSR(％)或BRSR(KL)，对口腔护理产品对牙菌斑生物膜的杀菌功效进行评价；
利用优化生物膜活菌计数法对经过口腔护理产品样品处理后继续培养4～8小时的牙菌斑生物膜中的总含菌量进行分析，计算口腔护理产品样品对牙菌斑生物膜的生物膜相对抑菌率BRIR(％)或BRIR(IL)，对口腔护理产品对牙菌斑生物膜的抑菌功效进行评价。
表2列出了市场调研的结果。可以看出，牙膏2和牙膏3的清洁口腔和清除口气方面的效果优于牙膏1。在清除口气/口腔异味方面，牙膏3略好于牙膏2，好于牙膏1。
评分采用5分制，1分效果最差，5分效果最好。
表2牙膏测试样品的市场调研结果
表3列出了对比例1中3个牙膏样品对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌游离菌的抑菌率(IR)结果。3个牙膏样品对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌游离菌的抑菌率检测结果一致，均为100.0％(同＞99.9％)，无差异性，无法区分其抗菌功效的强弱。
表3游离菌法的测试结果
表4、表5列出了实施例1中3个牙膏样品的测试结果。表5是牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率(BRSR)和相对抑菌率(BRIR)。在实施例1中，培养牙菌斑生物膜过程中在培养基中添加0.2％碳酸钙悬浊液作为生物膜附着力促进剂，三种牙膏对牙菌斑生物膜的相对抑制率(BRIR，％)分别为99.793％，99.906％，100.000％(同>99.999％)；三种牙膏对牙菌斑生物膜的抑菌对数值(BRIR，IL)分别为2.68，3.03，5.33；两种方法的测试结果趋势完全一致。牙膏3对牙菌斑生物膜具有最强的抑菌功效，其次为牙膏2，牙膏1对牙菌斑生物膜的抑菌效果最弱。
表4生物膜法(实施例1)的抗菌测试结果
表5生物膜法(实施例1)的抗菌测试结果(相对杀菌率(BRSR)和相对抑菌率(BRIR))
表6对比了市场调研结果，对比例1，实施例1的结果。可见，采用生物膜法的实施例1对牙膏样品的抗菌效能具有较高的区分性，三种牙膏的排序与市场调研完全一致。而采用游离菌法的对比例则无法区分三种牙膏样品的抗菌效能，与市场调研的结果区别很大。从以上对比可以看出，采用本发明的技术方案的生物膜法能有效区分具有不同抗菌效能的牙膏样品，更接近消费者使用的真实情况。
表6市场调研结果和对比例1，实施例1测试结果对比
采用本发明技术方案的生物膜法和其它生物膜法的关于耗时的对比
对比例2和3的制备步骤同实施例1，仅在培养牙菌斑生物膜过程中是否添加附着力促进剂碳酸钙悬浊液以及生物膜的培养时间上有所差别。具体区别见表7。
表7采用本发明技术方案的生物膜法和其它生物膜法对比
表8、表9为实施例1和对比例的杀菌测试的结果。牙膏样品和牙菌斑生物膜的作用时间为3分钟。表10为市场调研结果和对比例2、对比例3及实施例1的对比。
从表10可知，对比例2的测试结果无法区分三种牙膏样品的效能，和市场调研的结果区别很大。对比例3的测试结果虽然也能有效区分三种牙膏样品的效能，但需要的时间比较长，比实施例1耗时多8小时。因此，在牙菌斑生物膜培养过程中添加碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂能够有效的减少用于牙膏抗抑菌功效评价的牙菌斑生物膜培养时间。
从表8来看，不论牙膏样品作用与否，对比例2和3的活菌数目都比实施例的活菌数目要小。由于对比例2和3中没有添加附着力促进剂，导致生物膜附着力弱，生物膜中的总活菌数较少。
从以上对比可以看出，采用本发明的技术方案的生物膜法能有效区分具有不同效能的牙膏样品，而且具有耗时较短的优点。采用碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂能保证评价准确度的情况下有效缩短生物膜培养时间。
表8实施例1和对比例2、对比例3的杀菌测试结果
表9实施例1和对比例2/3的杀菌测试结果(相对杀菌率(BRSR))
表10市场调研结果和对比例及实施例杀菌测试结果对比
表11、表12为实施例1和对比例2和3的抑菌测试的结果。牙膏样品和牙菌斑生物膜的作用时间为3分钟后继续培养8小时。表13为市场调研结果和对比例2、对比例3及实施例1的对比。
可见，抑菌测试的结果和杀菌测试的结果类似。采用本发明的技术方案的生物膜法能有效区分具有不同效能的牙膏样品，而且具有耗时较短的优点。采用碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂能有效提升生物膜的附着，能保证评价准确度的情况下有效缩短生物膜培养时间。
表11实施例1和对比例2、对比例3的抑菌测试结果
表12实施例1和对比例2、对比例3的抑菌测试结果(相对抑菌率(BRIR))
表13市场调研结果和对比例及实施例抑菌测试结果对比
采用本发明技术方案的生物膜法的重复性
实施例2、3、4的制备步骤同实施例1。区别只是碳酸钙悬浊液的添加量不同。具体如表14所示。
表14实施例1～4中的牙菌斑生物膜培养信息及样品作用信息
表15至表18列出了实施例1和2的杀菌和抑菌测试结果。表19为市场调研结果和实施例1、实施例2的对比。
从表格数据可见，三种牙膏对牙菌斑生物膜的生物膜相对杀菌率，杀灭对数值，生物膜相对抑制率和抑制对数值结果接近，三种牙膏对牙菌斑生物膜的杀菌功效和抑菌功效评价结果一致，牙膏3对牙菌斑生物膜具有最强的杀菌效果和抑菌效果，牙膏1对牙菌斑生物膜的杀菌功效和抑菌功效均为最弱。采用碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂，用量在0.1％至0.5％时，抗菌测试结果具有良好的区分性，碳酸钙悬浊液用量为0.2％时最优。
说明本发明的技术方案能够非常有效的对不同牙膏的抗抑菌功效进行评价与对比，并且具有结果重复性高的优点。
表15实施例1～4的杀菌测试结果
表16实施例1～4的杀菌测试结果(相对杀菌率)
表17实施例1～4的抑菌测试结果
表18实施例1～4的抑菌测试结果(相对抑菌率)
表19市场调研结果和实施例1～4抑菌测试结果对比
综上所述，对于利用游离菌法检测难以区分抗抑菌功效的口腔护理产品(上文以牙膏1-3为例)，利用培养过程中添加0.2％碳酸钙悬浊液作为附着力促进剂的16小时牙菌斑生物膜进行牙膏抗菌功效评价的方法重复性高，结果可靠，是一种快速、重复性强、结果可信的抗菌功效测试与评价方法，能够有效应用于口腔护理产品的开发和配方筛选；本批测试样品中，牙膏3是三个牙膏样品中对牙菌斑生物膜的抗菌功效最优的配方。
上述对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率和相对抑制率的分析对比如图1-4所示。图1是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率(BRSR，％)结果分析图；图2是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对杀菌率(BRSR，KL)结果分析图；图3是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对抑制率(BRIR，％)结果分析图；图4是对比例2～3和实施例1～4中3个牙膏样品对牙菌斑生物膜的相对抑制率(BRIR，KL)结果分析图。
本文所公开的量纲和数值不应理解为所述精确值的严格限制。除非另外说明，每个这样的量纲旨在表示所述值和围绕该值的功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
在发明内容中引用的所有文件都在相关部分中以引用方式纳入本文中。对于任何文件的引用不应当解释为承认其是有关本发明的现有技术。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；
S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；
S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型；
所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；
所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；
所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。
2.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.2％。
3.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述口腔致病菌包含血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。
4.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述无氧气氛是指由体积比为80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳构成的气体环境。
5.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述恒温的温度为36℃。
6.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于：所述成膜介质为TC处理细胞培养板。
7.一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述生物膜为权利要求1所述的牙菌斑生物膜模型，所述优化的生物膜活菌计数法包括以下步骤：
S201消化分散：牙菌斑生物膜模型使用TC处理的24孔细胞培养板培养形成时，向牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液后转移至无菌离心管中；
S202超声分散：将装有生物膜菌悬液的离心管置于超声波清洗仪中并在25℃下超声6min；
S203计数：用活菌计数法测定生物膜菌悬液的细菌数目，即为牙菌斑生物膜中的活菌数目。
8.一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S301、沿权利要求1所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；
S302、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入与样品溶液等体积的如权利要求1所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；
S303、重复步骤S302两次；
S304、用权利要求7所述的优化的生物膜活菌计数法测定经步骤S303处理的牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NS；
S305、在权利要求1所述且未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S302和S303，然后用权利要求7所述的优化的生物膜活菌计数法测定该孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为NC；
S306、口腔护理产品对牙菌斑生物膜模型的相对杀菌率为或LgNc-LgNs。
9.一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S401、沿权利要求1所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；
S402、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入等体积的如权利要求1所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；
S403、重复步骤S402两次；
S404、向牙菌斑生物膜模型的孔中加入1mL的BHI富集培养基，并将牙菌斑生物膜模型置于无氧气氛及恒温的环境培养4～8小时；
S405、吸取并弃去经步骤S404处理的牙菌斑生物膜模型孔中的菌悬液，用权利要求7所述的优化的生物膜活菌计数法测定牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养后的活菌数目，记为NS’；
S406、在权利要求1所述且未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S402和S403，然后用权利要求7所述的优化的生物膜活菌计数法测定牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜继续培养后的活菌数目，记为NC’；
S407、口腔护理产品对牙菌斑生物膜模型的相对抑菌率为或LgNc'-LgNs'。
10.一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，其特征在于：包括权利要求8和权利要求9所述的方法。
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