CN112574886A - 一种牙周炎致病菌的分离方法 - Google Patents

一种牙周炎致病菌的分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112574886A
CN112574886A CN202011471632.8A CN202011471632A CN112574886A CN 112574886 A CN112574886 A CN 112574886A CN 202011471632 A CN202011471632 A CN 202011471632A CN 112574886 A CN112574886 A CN 112574886A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacteria
culture medium
anaerobic
liquid
pathogenic bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011471632.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112574886B (zh
Inventor
高社干
谷变利
李钟杰
郑月月
孔金玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology filed Critical First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology
Priority to CN202011471632.8A priority Critical patent/CN112574886B/zh
Publication of CN112574886A publication Critical patent/CN112574886A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112574886B publication Critical patent/CN112574886B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物培养技术领域，公开了一种牙周炎致病菌的分离方法，包括以下步骤：细菌的采样：采用无菌牙线棒从人体的牙缝进行取样，制得原始样本悬液；分离培养基的配制：按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L‑半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，灭菌降温后，按比例加入血红素、维生素K和无菌脱纤维绵羊血，倒平板，冷却，获得分离培养基；细菌的培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，37℃厌氧条件下经过所述分离培养基的培养产生特征性单克隆。本发明提供的取样方法简单、快捷，不会加剧牙龈出血和感染风险，并且提供的分离培养基的特异性高，缩短原代分离牙周炎致病菌的培养周期。

Description

一种牙周炎致病菌的分离方法
技术领域
本发明涉及一种微生物培养技术领域，尤其涉及一种牙周炎致病菌的分离方法。
背景技术
牙周病是一种慢性感染性疾病，牙周组织损伤与多种口腔微生物有关。其中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是口腔常见疾病的主要致病菌之一，也是公认的牙周疾病最重要的可疑致病菌之一；普雷沃氏菌属(Prevotella spp)是引起牙周疾病的病原菌之一，主要寄生在人类口腔中，是严格厌氧革兰氏阴性菌。流行病学研究表明，在牙周病患者及牙周健康者的牙周袋、龈沟、舌面、牙龈部位均可检测到多种致病菌。
目前，牙龈卟啉单胞菌等厌氧菌相关的研究，多围绕少数几种已建立的国际标准菌株开展，如ATCC 33277、W50、ATCC 53977、W83等。然而，由于牙龈卟啉单胞菌本身的遗传多样性，标准菌株的致病性、产生的临床症状等，其代表性都十分有限，如ATCC 53977、W83感染引起的机体免疫反应，与ATCC 33277相比，具有显著不同。利用测序技术进行的研究表明，即使是同一个牙周炎患者，其口腔中的牙龈卟啉单胞菌也具有明显的遗传多样性，这些差异可能是导致牙龈卟啉单胞菌各菌株致病能力及机制不同的原因。因此，对中国人群口腔牙龈卟啉单胞菌临床菌株分离对于进一步研究其生物学特性及致病机理意义重大。国内外有关人类普雷沃氏菌属的研究较少，最近的研究多集中在宏基因组学测定分布变化以及普雷沃氏菌属与牙龈卟啉单胞菌在疾病发生中的协同作用等方面。
体外培养是研究普雷沃氏菌属与牙龈卟啉单胞菌等厌氧细菌致病性及致病机理的重要手段。目前，国内外研究中，一般采用纸尖吸附法、龈下刮治器收集法采集龈沟液，进行培养；标准菌株常采用牛脑心浸出液(Brain Heart Infusion，BHI)或胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)琼脂培养基添加脱纤维绵羊血；接种步骤常采用梯度稀释结合涂布法，对原始获取样本悬液进行连续稀释，使用三角涂棒均匀涂布于琼脂平板上，37℃专性厌氧条件(5％H2、10％CO2、85％N2)下培养5～7乃至14天不等。待长出特征性菌落，挑取可能的目标菌株，鉴定为阳性目标菌后，进行反复划线传代直至获得纯菌株。整个分离筛选纯化周期，往往需要2～3个月时间，甚至更长。
上述分离培养方法，其中样本采集存在以下问题：1)样本采集需要借助特定的设备；(2)基本针对牙周炎患者，无法实现对没有牙周袋或牙周袋不明显的健康个体取样；(3)操作有创，易造成受试者的痛苦和不适；(4)可能加剧牙龈出血，从而加剧感染。常用的两种培养基在原代分离普雷沃氏菌属与牙龈卟啉单胞菌等厌氧细菌时，存在的问题有：营养丰富，在分离苛养细菌时缺乏针对性，非目标杂菌容易生长过盛，影响目标菌的分离。涂布法进行的梯度稀释，操作繁琐，对严格厌氧细菌的分离效果较差，不利于单个目标菌菌落的形成，延长分离筛选周期。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牙周炎致病菌的分离方法，以解决现有技术中取样受样本状态限制、取样繁琐以及培养基特异性差等问题。
本发明的目的采用如下技术方案实现：一种牙周炎致病菌的分离方法，包括以下步骤：
细菌的采样：取出无菌牙线棒，将牙线嵌入人体的牙缝间，在牙龈处往返拉动至少两次，取出牙线，将牙线的纤维线浸入至已经过厌氧预平衡处理的TSB液体培养基中，无菌枪头吹打数次，制成原始样本悬液，放入厌氧培养箱中待用；
分离培养基的配制：按重量组分计，将10～20份混合蛋白胨、5～10份酵母浸出粉、1～5份氯化钠、10～15份琼脂、0.5～1.0份葡萄糖、0.2～0.8份碳酸氢钠、0.1～0.5份L-半胱氨酸盐、0.1～0.5份可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，高压锅灭菌后，在高压锅内将温度降至65～75℃时，取出放于60℃水浴锅中缓慢降温；然后加入0.0001～0.0005份血红素、0.00001～0.00005份维生素K和5～10份无菌脱纤维绵羊血，混匀，获得液体的分离培养基；将液体的分离培养基倒平板，冷却，获得固体的分离培养基；
细菌的培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，37℃厌氧条件下经过所述分离培养基的培养产生特征性单克隆。
进一步地，在进行所述细菌的培养之前还需要进行分离培养基的厌氧预平衡处理，具体步骤包括：
将所述分离培养基放入37℃厌氧培养箱中保持24h。
进一步地，所述细菌的培养包括：
细菌的初代培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，无菌接种环沾取适量样本，采用分区连续划线法，划至已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，37℃厌氧条件下培养7～10天；
PCR检测：用无菌枪头挑取黑色圆形凸起的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，取2～4μL进行直接PCR检测；
细菌的传代培养：经PCR检测为阳性后，将剩余菌液用无菌接种环分区连续划线至已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，继续37℃厌氧条件下培养7～10天；
其中，依次重复所述PCR检测步骤和所述细菌的传代培养步骤至少一次，至所述分离培养基上形成单一的墨黑色圆形特征克隆。
进一步地，所述牙周炎致病菌的分离方法还包括细菌的鉴定，具体步骤如下：
挑取墨黑色圆形特征单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，进行直接PCR检测或者革兰氏染色鉴定或者16S rDNA基因测序鉴定中的任意一种或者任意两种或者全部。
进一步地，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的PCR检测中所用的引物包括第一上游引物和第一下游引物；
所述第一上游引物的序列为：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’；
所述第一下游引物的序列为：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。
进一步地，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的PCR检测中的PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002833976910000041
PCR扩增反应程序为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，36个循环；72℃，10min。
进一步地，所述细菌的培养包括：
菌液的稀释：取两份5μL的原始样本悬液，分别以原始样本悬液与TSB液体培养基体积比为1:100和1：10000的比例将TSB液体培养基加入原始样本悬液中对原始样本悬液进行稀释，获得第一稀释菌液和第二稀释菌液；
细菌的初代培养：分别取100μL第一稀释菌液和100μL第二稀释菌液，采用涂布法接种于已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，37℃厌氧培养7～10天，至培养出黑色圆形凸起的单克隆。
进一步地，所述牙周炎致病菌的分离方法还包括细菌的鉴定，具体步骤如下：
挑取黑色圆形凸起的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，进行直接PCR检测或者革兰氏染色鉴定或者16S rDNA基因测序鉴定中的任意一种或者任意两种或者全部。
进一步地，所述细菌的鉴定中的直接PCR检测中所用的引物包括第二上游引物和第二下游引物；
所述第二上游引物的序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
所述第二下游引物的序列为：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
进一步地，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的直接PCR检测中的PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002833976910000051
PCR扩增反应程序为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，1min 20s，36个循环；72℃，10min。
进一步地，将所述牙线嵌入人体的第三磨牙和第四磨牙之间的牙缝中进行细菌的取样；或者，
按重量组分计，将0.5份血红素为，1.74份K2HPO4和100份去离子水混合后高压灭菌，制成血红素储存液以用于配制所述分离培养基；按重量组分计，将0.5份维生素K和100份无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，制成维生素K储存液以用于配制所述分离培养基。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过采用无菌牙线棒从人体的牙缝中直接取样，不受牙周袋状态的限制，也不需要特定器材的予以辅助，在取样过程中不用拨开牙龈使取样部位充分暴露，因此，本发明提供的取样方法简单、快捷，不会加剧牙龈出血，也不会增加感染风险。另外，本发明根据常见牙周炎厌氧致病菌生长所需的营养需求，针对性地进行分离培养基成分的重新配制，提高分离培养基的特异性，有效降低非目标菌的生长，大大缩短原代分离牙周炎致病菌的培养周期，为进一步大范围开展牙周致病菌与肿瘤发生关系的基础研究提供强有力的手段。
附图说明
图1是本发明实施例一对原始样本悬液进行荧光定量PCR的结果图；
图2是本发明实施例三对疑似的原代牙龈卟啉单胞菌进行PCR检测的结果图(M，DL2000 DNA marker；P：阳性对照；N：阴性对照)；
图3是本发明实施例三获得的牙龈卟啉单胞菌单克隆的平板图；
图4A是本发明实施例四涂布第一稀释菌液获得的普雷沃氏菌属单克隆的平板图；
图4B是本发明实施例四涂布第二稀释菌液获得的普雷沃氏菌属单克隆的平板图；
图5是本发明实施例五对原代分离的牙龈卟啉单胞菌进行PCR检测的结果图(M，DL2000 DNA marker；P,阳性对照；N，阴性对照)；
图6是本发明实施例五对普雷沃氏菌属进行PCR检测的结果图(M，DL2000DNAmarker)；
图7A是本发明实施例六对牙龈卟啉单胞菌进行革兰氏染色鉴定的结果图；
图7B是本发明实施例六对普雷沃氏菌属进行革兰氏染色鉴定的结果图；
图8A是本发明实施例七对牙龈卟啉单胞菌部分序列的测序峰图；
图8B是本发明实施例七对普雷沃氏菌属部分序列的测序峰图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例一：
在本实施例中，采用齿间取样法对健康个体的口腔进行牙周炎致病菌的取样，具体步骤如下：
1、取无菌牙线棒一支，使牙线嵌入健康受试者第三磨牙和第四磨牙的牙缝中，在近牙龈处来回拉动3～4次，取出牙线，在超净工作台内用无菌眼科剪剪断两头，使纤维线浸入至已经过厌氧条件(85％N2、5％H2和10％CO2)预平衡的100～200μL TSB液体培养基中，采用无菌枪头吹打数次，使牙线上的细胞及微生物尽可能多地洗脱到培养基中，制成原始样本悬液，标记为Pr-H1。其中，TSB液体培养基由按重量组分计为30份的TSB和5份的酵母提取物加入至1L无菌水配制而成。
2、取2～4μL原始样本悬液，进行菌液qPCR检测，验证原始样本悬液中是否含有牙龈卟啉单胞菌，并将剩余悬液暂放入厌氧培养箱中待用；
3、qPCR检测，具体步骤如下：
3.1、配制qPCR反应体系(总20μL)：
成分 体积(μL)
细菌DNA 2～4
上游引物 0.5
下游引物 0.5
TaqMan荧光探针(10μM) 0.2
AceQ PCR Probe Master Mix(2×) 10
DEPC水 4.8～6.8
其中：
上游引物：5’-ACCTTACCCGGGATTGAAATG-3’
下游引物：5’-CAACCATGCAGCACCTACATAGAA-3’
探针：5’-FAM-ATGACTGATGGTGAAAACCGTCTTCCCTTC-TARMA-3’
其中，AceQ PCR Probe Master Mix(Vazyme，Q112-03)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；所有引物和探针序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
3.2、qPCR扩增：
将配制好的qPCR反应体系瞬时离心后，于BioRad CFX96TM实时PCR系统上进行实时荧光定量PCR扩增分析。
qPCR反应条件设置为：
95℃，10min；
95℃，10s，60℃，60s(采集信号)；40个循环。
4、结果分析：
qPCR扩增完成后，利用CFX MaestroTM software软件分析扩增结果，如图1所示，牙龈卟啉单胞菌扩增为阳性，且定量结果大约为1×105copies/mL。因此，采用本方法可以无创无痛且快速地得到含有牙周炎致病菌的样本。使口腔致病菌的研究对象不止局限于牙周炎患者，更拓宽到包括健康人在内的所有成年人群，为进一步大范围开展牙周炎致病菌，在相关癌种癌前病变中的作用研究，以及口腔厌氧致病菌与肿瘤发生关系的基础研究提供强有力的手段。
实施例二：
在本实施例中，配制用于原代分离筛选牙周炎致病菌的分离培养基。
分离培养基的配制方法，具体包括如下步骤：
1、按重量组分计，将10～20份混合蛋白胨、5～10份酵母浸出粉、1～5份氯化钠、10～15份琼脂、0.5～1.0份葡萄糖、0.2～0.8份碳酸氢钠、0.1～0.5份L-半胱氨酸盐、0.1～0.5份可溶性焦磷酸钠，按比例加入耐热玻璃容器中，定容无菌蒸馏水至1L，充分混匀各组分，得到混合物溶液，加盖、标记，待灭菌；同时，将4℃存放的无菌脱纤维绵羊血，放入42℃水浴锅中预平衡。
2、将上述混合物溶液放入高压蒸汽灭菌锅，设置灭菌条件为121℃、15分钟，待灭菌锅完全停止工作，锅内温度降至70℃左右时，取出混合物溶液放于60℃水浴锅中，使混合物溶液缓慢降温。
3、加入血红素0.0001～0.0005份、维生素K 0.00001～0.00005及42℃预热的无菌脱纤维绵羊血5～10份，轻摇混匀各组分，避免产生大量气泡；倒平板，制成厚度约为10～15cm的血琼脂平板，放于超净工作台中，室温下充分冷却，即为牙周炎致病菌的分离培养基。
其中，在步骤3之前，先制备血红素储存液和维生素K储存液，分别将血红素储存液按照1份/1000份水的量，维生素K储存液按照0.1份/1000份水的量加入到灭菌并降温后的混合物溶液中。血红素储存液的制备方法为：按重量组分计，将0.5份血红素和1.74份K2HPO4加入到100份去离子水中，混匀，121℃灭菌15分钟，获得血红素储存液，室温放置降温，待用；维生素K储存液的制备方法为：按重量组分计，将0.5份维生素K和100份无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液，避光保存，待用。
实施例三：
在本实施例中，采用实施例二配制的分离培养基对口腔样本(即实施例一获取的原始样本悬液Pr-H1)进行牙龈卟啉单胞菌分离培养。
对牙龈卟啉单胞菌进行分离培养的方法，具体包括如下步骤：
1、冷却后的血琼脂平板，在使用前放入37℃厌氧培养箱中(85％N2、5％H2和10％CO2)，预平衡24h。
2、从厌氧培养箱中取出实施例一得到的原始样本悬液Pr-H1，无菌接种环沾取适量样本，采用分区连续划线法，划至已经过厌氧预平衡的血琼脂平板上，标记平板为Pr-H1；37℃厌氧(85％N2、5％H2和10％CO2)培养7～10天。
3、观察菌落形态，用无菌枪头挑取黑色圆形凸起的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，取2～4μL进行直接PCR检测。
PCR检测包括如下步骤：
3.1、配制PCR反应体系(总25μL)：
Figure BDA0002833976910000101
Figure BDA0002833976910000111
其中：
上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’；
下游引物：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’；
其中，所有引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
3.2、PCR扩增：
将配制好的PCR反应体系放于PCR仪上进行PCR扩增。
PCR反应条件设置为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，36个循环；72℃，10min。
3.3、结果分析：
将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，90V，30分钟。在凝胶成像系统中，拍摄电泳图，对应DNA marker DL2000，参考阴性、阳性对照，请参阅图2，结果显示挑取的5个黑色克隆，有3个扩增产物为较强的牙龈卟啉单胞菌特异性404bp条带。
4、经PCR验证牙龈卟啉单胞菌为阳性后，将剩余菌液用无菌接种环分区连续划线至已经过厌氧预平衡处理的血琼脂平板上，标记为Pr-H1.1，继续37℃厌氧培养7～10天；
5、依次重复步骤3和步骤4一次，挑取黑色单克隆，标记为Pr-H1.1.1，37℃厌氧培养7～10天，至平板上形成单一的墨黑色圆形特征克隆，结果如图3所示。
实施例四：
在本实施例中，采用实施例二配制的分离培养基对普雷沃氏菌属进行培养。
对普雷沃氏菌属进行培养的方法，具体包括如下步骤：
1、冷却后的血琼脂平板，在使用前放入37℃厌氧培养箱中(85％N2、5％H2和10％CO2)，预平衡24h。
2、从厌氧培养箱中取出实施例一得到的原始样本悬液Pr-H1，然后单独另吸取体积为5μL的两份原始样本悬液Pr-H1，分别加入TSB液体培养基进行稀释，其中一份按原始样本悬液与TSB液体培养基体积比为1:100的比例稀释，得到第一稀释菌液，标记为Pr-H1a，另一份按原始样本悬液与TSB液体培养基体积比为1:10000的比例稀释，得到第二稀释菌液，标记为Pr-H1b。
3、分别取100μL第一稀释菌液和100μL第二稀释菌液，采用涂布法接种于经过厌氧预平衡处理的血琼脂平板上，37℃厌氧(85％N2、5％H2和10％CO2)培养7～10天。结果如图4A和4B所示，平板上均长出黑色圆形凸起。
实施例五：
在本实施例中，采用PCR法对牙龈卟啉单胞菌单克隆和普雷沃氏菌属单克隆进行检测。
1、对牙龈卟啉单胞菌的PCR检测：
挑取分离培养基上的具有墨黑色圆形特征的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液，用于PCR检测。
PCR反应体系与PCR扩增条件与实施例三中对牙龈卟啉单胞菌的PCR检测相同，在此不再详述。
将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，90V，30分钟。在凝胶成像系统中，拍摄电泳图，对应DNA marker DL2000，参考阴性、阳性对照，请参阅图5，结果显示挑取的15个黑色克隆，扩增产物全部出现明显的404bp条带，即为牙龈卟啉单胞菌特异的404bp条带。
2、对普雷沃氏菌属的PCR检测：
挑取分离培养基上的具有黑色圆形凸起特征的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液，用于PCR检测。
PCR检测包括如下步骤：
2.1、配制PCR反应体系(总25μL)：
成分 体积(μL)
菌落DNA 2～4
上游引物(10μM) 0.5
下游引物(10μM) 0.5
Taq Plus Master Mix(2×) 12.5
DEPC水 7.5～9.5
其中：
上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’；
所有引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成.
2.2、PCR扩增：
将配制好的PCR反应体系放于PCR仪上进行PCR扩增。
PCR反应条件设置为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，1min 20s，36个循环；72℃，10min。
2.3、结果分析：
PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测阳性后，在凝胶成像系统中，拍摄电泳图，结果显示阳性扩增产物约为1450bp条带。如图6所示，挑取的5个黑色克隆，扩增产物全部为普雷沃氏菌属特异的1450bp条带。
实施例六：
在本实施例中，采用革兰氏染色对牙龈卟啉单胞菌单克隆和普雷沃氏菌属单克隆进行检测。
1、对牙龈卟啉单胞菌的革兰氏染色鉴定：
取1μL实施例五已鉴定牙龈卟啉单胞菌为阳性克隆的菌液，涂抹于干净载玻片上，室温晾干，酒精灯上烤干固定，依次进行结晶紫、碘液染色各1min，中间流水冲洗；脱色剂30s左右，至无明显紫色，流水冲洗；复染液复染1min，流水冲洗，甩干水分，晾干后镜检。请参阅图7A，油镜下观察牙龈卟啉单胞菌阳性克隆均染成革兰氏阴性菌特有的颜色(粉色)，牙龈卟啉单胞菌为粉红色的串珠状或短杆状。
2、对普雷沃氏菌属的革兰氏染色鉴定：
取1μL实施例五已鉴定普雷沃氏菌属为阳性克隆的菌液，采用与对牙龈卟啉单胞菌的革兰氏染色鉴定相同的方法对普雷沃氏菌属进行革兰氏染色鉴定，请参阅图7B，油镜下观察普雷沃氏菌属阳性克隆均染成革兰氏阴性菌特有的颜色(粉色)，普雷沃氏菌属为粉红色短杆状。
实施例七：
在本实施例中，采用rDNA测序对牙龈卟啉单胞菌单克隆和普雷沃氏菌属单克隆进行检测。
对实施例五已鉴定牙龈卟啉单胞菌为阳性克隆的菌液和普雷沃氏菌属为阳性克隆的菌液进行16S rDNA基因测序(由天津金唯智生物科技有限公司进行测序)，其中图8A为牙龈卟啉单胞菌部分序列的测序峰图，图8B为普雷沃氏菌属部分序列的测序峰图，从图中可以看到，两种菌测序峰图特异、无杂峰，DNA序列单一，提示产物特异纯净；将测得序列在NCBI网站上进行Blast后，结果显示图8A对应的序列匹配上大部分牙龈卟啉单胞菌亚种，其中排在匹配度列表第一位的是Porphyromonas gingivalis AJW4菌株；图8B的序列匹配上细菌Prevotella nigrescens，其中匹配程度最佳的为Prevotella nigrescens JCM 6322菌株。
通过实施例五至实施例七的鉴定试验，可以看到，通过本发明实施例提供的牙周炎致病菌的分离方法分离筛选的阳性单克隆菌株，DNA序列单一、产物特异纯净，因而从形态学、生化反应以及分子生物学等方面均充分验证本发明实施例提供的牙周炎致病菌的分离方法的有效性。结合实施例一至实施例四，可以看出通过本发明提供的牙周炎致病菌的分离方法分离培养出普雷沃氏菌单菌落，仅需一周时间，分离培养出牙龈卟啉单胞菌单菌落仅需21～30天，大大缩短原代分离牙周炎致病菌的培养周期，为进一步大范围开展牙周致病菌与肿瘤发生关系的基础研究提供强有力的手段。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
细菌的采样：取出无菌牙线棒，将牙线嵌入人体的牙缝间，在牙龈处往返拉动至少两次，取出牙线，将牙线的纤维线浸入至已经过厌氧预平衡处理的TSB液体培养基中，无菌枪头吹打数次，制成原始样本悬液，放入厌氧培养箱中待用；
分离培养基的配制：按重量组分计，将10～20份混合蛋白胨、5～10份酵母浸出粉、1～5份氯化钠、10～15份琼脂、0.5～1.0份葡萄糖、0.2～0.8份碳酸氢钠、0.1～0.5份L-半胱氨酸盐、0.1～0.5份可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，高压锅灭菌后，在高压锅内将温度降至65～75℃时，取出放于60℃水浴锅中缓慢降温；然后加入0.0001～0.0005份血红素、0.00001～0.00005份维生素K和5～10份无菌脱纤维绵羊血，混匀，获得液体的分离培养基；将液体的分离培养基倒平板，冷却，获得固体的分离培养基；
细菌的培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，37℃厌氧条件下经过所述分离培养基的培养产生特征性单克隆。
2.根据权利要求1所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，在进行所述细菌的培养之前还需要进行分离培养基的厌氧预平衡处理，具体步骤包括：
将所述分离培养基放入37℃厌氧培养箱中保持24h。
3.根据权利要求2所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养包括：
细菌的初代培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，无菌接种环沾取适量样本，采用分区连续划线法，划至已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，37℃厌氧条件下培养7～10天；
PCR检测：用无菌枪头挑取黑色圆形凸起的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，取2～4μL进行直接PCR检测；
细菌的传代培养：经PCR检测为阳性后，将剩余菌液用无菌接种环分区连续划线至已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，继续37℃厌氧条件下培养7～10天；
其中，依次重复所述PCR检测步骤和所述细菌的传代培养步骤至少一次，至所述分离培养基上形成单一的墨黑色圆形特征克隆。
4.根据权利要求3所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述牙周炎致病菌的分离方法还包括细菌的鉴定，具体步骤如下：
挑取墨黑色圆形特征单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，进行直接PCR检测或者革兰氏染色鉴定或者16S rDNA基因测序鉴定中的任意一种或者任意两种或者全部。
5.根据权利要求4所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的PCR检测中所用的引物包括第一上游引物和第一下游引物；
所述第一上游引物的序列为：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’；
所述第一下游引物的序列为：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。
6.根据权利要求5所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的PCR检测中的PCR扩增反应体系为：
Figure FDA0002833976900000021
Figure FDA0002833976900000031
PCR扩增反应程序为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，36个循环；72℃，10min。
7.根据权利要求2所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养包括：
菌液的稀释：取两份5μL的原始样本悬液，分别以原始样本悬液与TSB液体培养基体积比为1:100和1：10000的比例将TSB液体培养基加入原始样本悬液中对原始样本悬液进行稀释，获得第一稀释菌液和第二稀释菌液；
细菌的初代培养：分别取100μL第一稀释菌液和100μL第二稀释菌液，采用涂布法接种于已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，37℃厌氧培养7～10天，至培养出黑色圆形凸起的单克隆。
8.根据权利要求7所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述牙周炎致病菌的分离方法还包括细菌的鉴定，具体步骤如下：
挑取黑色圆形凸起的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，进行直接PCR检测或者革兰氏染色鉴定或者16S rDNA基因测序鉴定中的任意一种或者任意两种或者全部。
9.根据权利要求8所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的鉴定中的直接PCR检测中所用的引物包括第二上游引物和第二下游引物；
所述第二上游引物的序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
所述第二下游引物的序列为：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
10.根据权利要求9所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的直接PCR检测中的PCR扩增反应体系为：
Figure FDA0002833976900000041
PCR扩增反应程序为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，1min 20s，36个循环；72℃，10min。
11.根据权利要求1至10任一项所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，将所述牙线嵌入人体的第三磨牙和第四磨牙之间的牙缝中进行细菌的取样；或者，
按重量组分计，将0.5份血红素为，1.74份K2HPO4和100份去离子水混合后高压灭菌，制成血红素储存液以用于配制所述分离培养基；按重量组分计，将0.5份维生素K和100份无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，制成维生素K储存液以用于配制所述分离培养基。
CN202011471632.8A 2020-12-14 2020-12-14 一种牙周炎致病菌的分离方法 Active CN112574886B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011471632.8A CN112574886B (zh) 2020-12-14 2020-12-14 一种牙周炎致病菌的分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011471632.8A CN112574886B (zh) 2020-12-14 2020-12-14 一种牙周炎致病菌的分离方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112574886A true CN112574886A (zh) 2021-03-30
CN112574886B CN112574886B (zh) 2022-03-29

Family

ID=75136208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011471632.8A Active CN112574886B (zh) 2020-12-14 2020-12-14 一种牙周炎致病菌的分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112574886B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101899510A (zh) * 2010-07-09 2010-12-01 江苏大学 一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重pcr试剂盒及使用方法
CN108048359A (zh) * 2017-12-27 2018-05-18 广州立白企业集团有限公司 一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用
CN109731051A (zh) * 2019-03-05 2019-05-10 浙江大学 一种福建水仙茶提取物及其制备方法和在抑制牙周炎致病菌中的应用
CN110819570A (zh) * 2019-11-27 2020-02-21 中秀科技股份有限公司 一种血琼脂平板及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101899510A (zh) * 2010-07-09 2010-12-01 江苏大学 一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重pcr试剂盒及使用方法
CN108048359A (zh) * 2017-12-27 2018-05-18 广州立白企业集团有限公司 一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用
CN109731051A (zh) * 2019-03-05 2019-05-10 浙江大学 一种福建水仙茶提取物及其制备方法和在抑制牙周炎致病菌中的应用
CN110819570A (zh) * 2019-11-27 2020-02-21 中秀科技股份有限公司 一种血琼脂平板及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG MEI等: "Porphyromonas gingivalis and Its Systemic Impact: Current Status", 《PATHOGENS》 *
姚雪芹等: "持续性根尖周炎中牙龈卟啉单胞菌的分离与鉴定", 《中华老年口腔医学杂志》 *
宁喜斌 主编: "《食品微生物检验学》", 28 February 2019 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112574886B (zh) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Møller et al. V factor-dependent members of the family Pasteurellaceae in the porcine upper respiratory tract
Könönen et al. Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, and Other Anaerobic Gram‐Negative Rods
Hyman et al. DNA probes for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae: application in experimentally infected chickens
CN102949714B (zh) 猪链球菌病三价灭活疫苗及制备方法
JPH05507617A (ja) 結核菌の特異的検出
CN112574886B (zh) 一种牙周炎致病菌的分离方法
Turkyilmaz et al. Molecular identification of bacteria isolated from dairy herds with mastitis
CN109913396A (zh) 一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法
CN1861802A (zh) 一种多重pcr反应试剂盒及其检测方法
CN116640828A (zh) 一种从食管癌组织中分离致病厌氧菌的方法及致病厌氧菌菌株和应用
CN111154898A (zh) 鉴定人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗的技术方法
Othman et al. Conventional and molecular detection of Pasteurella multocida in outbreak of respiratory tract infection of sheep and goats in Basrah Province
RU2347806C2 (ru) Штамм бактерий fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных
Ono et al. Novel isolation and identification methods for veillonella species involved in halitosis
Schwarzová et al. Combined infection of Ixodes ricinus with three Borrelia burgdorferi sensu lato genotypes
CN108411013A (zh) 用于奶牛乳房炎病原体快速分型检测的探针组合
Leo Recent developments on the nature of the anaerobic actinomycetes
小野喜徳 Novel isolation and identification methods for Veillonella species involved in halitosis
CN113699084A (zh) 一种口腔幽门螺杆菌的无创分离培养方法与应用
CN115040163A (zh) 一种鼠口腔内微生物的采样方法及应用
CN117965358A (zh) 一株耐受胆汁的致黄菌及其应用
Nikolić-Jakoba et al. Polymerase chain reaction in the identification of periodontopathogens: A reliable and satisfactory method?
Wang et al. Effect of smoking on colonization by Bacteroides forsythus in patients with chronic periodontitis
Yoshihide et al. Isolation and identification methods for Solobacterium moorei involved in halitosis
Kumaraswamy et al. First isolate of Orientia tsutsugamushi from Vellore, South India

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant