CN115040163A - 一种鼠口腔内微生物的采样方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠口腔内微生物的采样方法及应用，包括如下步骤：在鼠的口腔内部表面擦拭，从舌头开始，然后是颊部、上牙龈、上颚，最后是下门牙的牙龈及唇部，共计30s；结束后快速将采样后的棉签放入无菌EP管中或含有无菌Pbw溶液的EP管中，用剪刀切割棉签柄，长度不低于EP管长度的1/2；扣盖后立即将管放在干冰上；收集所有样品后，直接放入EP管中的样品存储在‑80℃。本发明方法中采样过程中不会对鼠口腔内部表面造成损伤，避免了侵入性采样对口腔产生的创伤，适合鼠口腔内部微生物采样使用。同时，本发明方法收集到的生物量较大，后续最终获得的菌量、总DNA浓度及质量能够达到要求。
Description
技术领域
本发明属于微生物采样技术领域，尤其是一种鼠口腔内微生物的采样方法及应用。
背景技术
口腔是连接外界和生物体消化道、呼吸道的器官，其内部部位中定植着大量微生物。这些微生物在维持口腔微生态平衡和保持口腔健康方面具有重要的作用。口腔微生物组的失衡会导致口腔疾病、系统性疾病，甚至肿瘤。因此，对口腔微生物进行准确有效的采集成为了进一步发掘和研究口腔微生物中具有应用价值的基因及口腔微生物群落内部、微生物与环境间相互关系的重要环节。
动物实验(Animal Experiment)是在实验室内，为了获得有关生物学、医学等方面的新知识或解决具体问题而使用动物进行的科学研究方法，是体内实验的重要手段。采用鼠类动物进行体内实验是最常用、方便的实验模型方法。
目前动物微生物采集对象大多数都是采集肠道微生物，采样方式也多针对肠道微生物的采集，口腔微生物的采样方法还未建立。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中还没有具体的动物实验口腔微生物的采样方法的不足之处，提供一种鼠口腔内微生物的采样方法及应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种鼠口腔内微生物的采样方法，包括如下步骤：
用75％乙醇清洁工作表面、机架、剪刀，紫外灭菌30min；抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，先用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发，准备好无菌耳鼻口专用棉签，在鼠的口腔内部表面擦拭，从舌头开始，然后是颊部、上牙龈、上颚，最后是下门牙的牙龈及唇部，共计30s；结束后快速将采样后的棉签放入无菌EP管中或含有无菌Pbw溶液的EP管中，用剪刀切割棉签柄，长度不低于EP管长度的1/2；扣盖后立即将管放在干冰上；
收集所有样品后，直接放入EP管中的样品存储在-80℃，用于核酸和代谢分析；放入含有Pbw溶液的EP管存储在4℃，用于微生物分析，直到后续处理。
进一步地，所述EP管在使用前在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
进一步地，所述Pbw溶液在使用前，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟，随后在超净台分装。
进一步地，每1LPbw溶液的配制方法为：
蒸馏水中添加蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g，调整pH值至7.4后，混合溶解后定容至1000mL，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
进一步地，抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发进行消毒，擦拭3-5s；在鼠的口腔内部表面擦拭3-5s；擦拭舌头时擦拭3-5s；擦拭颊部、上牙龈、上颚时分别擦拭3-5s；擦拭下门牙的牙龈、下唇部时分别擦拭3-5s，共计30s。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明方法中采样过程中不会对鼠口腔内部表面造成损伤，避免了侵入性采样对口腔产生的创伤，适合鼠口腔内部微生物采样使用。同时，本发明方法收集到的生物量较大，后续最终获得的菌量、总DNA浓度及质量能够达到要求。
2、本发明方法建立了鼠口腔内部微生物采样方法，弥补了此方法的空缺。
3、本发明方法所采用的材料价廉易得，且该方法高效、简便。
附图说明
图1为本发明中经过所述的口腔采样方法各大鼠的口腔中的口腔样本在稀释梯度下平板中微生物的生长情况图；其中，A、B、C、D、E分别代表5只大鼠，稀释梯度从前到后均依次为10-1、10-2、10-3；
图2为本发明中大鼠的口腔中的口腔样本DNA琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，1、2、4-9为实验组1，3为实验组2，10为实验组3；其中，实验组1：采用本发明采样步骤对大鼠口腔进行采样，实验组2：采用实验组1的采样步骤对大鼠口腔进行采样，但不擦拭舌头，颊部，牙龈，上颚，实验组3：采用实验组1的采样步骤对大鼠口腔进行采样，但擦拭各部位时间为2s；
图3为本发明中16s rDNA测序物种Circos图；
图4为本发明中16s rDNA测序物种Heatmap图(即属水平上的群落热图分析)。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种鼠口腔内微生物的采样方法，包括如下步骤：
用75％乙醇清洁工作表面、机架、剪刀，紫外灭菌30min；抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，先用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发，准备好无菌耳鼻口专用棉签，在鼠的口腔内部表面擦拭，从舌头开始，然后是颊部、上牙龈、上颚，最后是下门牙的牙龈及唇部，共计30s；结束后快速将采样后的棉签放入无菌EP管中或含有无菌Pbw溶液的EP管中，用剪刀切割棉签柄，长度不低于EP管长度的1/2；扣盖后立即将管放在干冰上；
收集所有样品后，直接放入EP管中的样品存储在-80℃，用于核酸和代谢分析；放入含有Pbw溶液的EP管存储在4℃，用于微生物分析，直到后续处理。
较优地，所述EP管在使用前在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
较优地，所述Pbw溶液在使用前，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟，随后在超净台分装。
较优地，每1LPbw溶液的配制方法为：
蒸馏水中添加蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g，调整pH值至7.4后，混合溶解后定容至1000mL，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
较优地，抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发进行消毒，擦拭3-5s；在鼠的口腔内部表面擦拭3-5s；擦拭舌头时擦拭3-5s；擦拭颊部、上牙龈、上颚时分别擦拭3-5s；擦拭下门牙的牙龈、下唇部时分别擦拭3-5s，共计30s。
具体地，相关的制备及检测如下：
大鼠口腔内微生物组采样及保存：
将EP管、配制好的Pbw溶液在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟，随后在超净台分装。Pbw溶液配制方法：取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，添加蒸馏水，调整pH 值至7.4后，混合溶解后定容至1000mL，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
对大鼠口腔进行采样。用75％乙醇清洁工作表面，机架，剪刀，紫外灭菌30min。抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，先用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发消毒3-5s，准备好无菌耳鼻口专用棉签，在鼠的口腔内部表面擦拭，从舌头开始擦拭5s，然后是颊部，牙龈，上颚，最后是下门牙的牙龈及唇部各部位各5s，共计30s，结束后快速将棉签放入无菌EP管中或含有无菌Pbw溶液的EP管中，用剪刀切割棉签柄，但不要太短，长度不低于EP管长度的1/2。扣盖后立即将管放在干冰上。收集所有样品后，直接放入管中的样品存储在-80℃，用于核酸和代谢分析，直到后续处理。同时，对大鼠进行采样，放入含有Pbw溶液的EP管存储在4℃，用于微生物分析，直到后续处理。
实施例1：CFU计数法
(1)平板培养基的制备：BHI培养基的配置方法为：脑心浸液肉汤3.7％，琼脂1.5％， pH调至6.8-7.2。将配制好的BHI培养基溶液高温在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟，随后在超净台浇注在平板培养皿上。
(2)配制不同稀释梯度的样本匀液：提前用无菌移液枪取450μL PBS缓冲液于1.5mL EP管中，并做上记号。无菌移液枪吸取50μL存储在4℃的口腔拭子样品，将其竖直打入盛有450μL PBS缓冲液或生理盐水的1.5mL EP管中，充分吹吸混匀，制成1:10(10-1)的样品匀液，再吸取50μL1:10的样品匀液竖直悬空打入盛有450μL PBS缓冲液或生理盐水的1.5mL EP管中，充分吹吸混匀，制成1:100(10-2)的样品匀液，以此类推稀释到1:1000(10-3)的样品稀释液。将稀释好的不同浓度的样品匀液各吸取50μL滴加到倒好BHI培养基的平板培养基中，用涂布器涂布至平板表面干涩为止。
(3)培养：做好标记，倒置放入37℃厌氧箱中培养，48h后取出平板计数。
如表1和图1所示，采用本发明所述的口腔采样方法，各大鼠的口腔中的口腔样本经过培养后的平板都有微生物生长的情况，说明此采样方法可以收集到大鼠口腔中的微生物。图1是各大鼠的口腔中采集的口腔样本在稀释梯度下平板中微生物的生长情况。
表1各组口腔样本中微生物的CFU计数结果
实施例2：口腔内微生物DNA的提取及验证
(1)实验分组
实验组1：采用所述采样步骤对大鼠口腔进行采样
实验组2：采用所述采样步骤对大鼠口腔进行采样，但不擦拭舌头，颊部，牙龈，上颚
实验组3：采用所述采样步骤对大鼠口腔进行采样，但擦拭各部位时间为2s
(2)提取DNA：置于-80℃的棉拭子直接使用Fast DNA SPIN Kit for Soil基因组DNA 提取试剂盒提取总DNA，将提取的DNA储存在-20℃的冰箱中，待用。
(3)PCR扩增：细菌的20μL PCR反应体系为：2μL提取的DNA，1μL引物ccsF (5’-CGGTGAATACGTTCTCGG-3’)，1μL引物ccsR(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)， 6μL灭菌超纯水，10μL GoldStar TaqMan Mixture酶
(4)PCR反应条件为：先95℃预变性10min；然后94℃30s，56℃30s，72℃8s，共35 个循环；最后72℃延伸5min，10℃保温结束反应。
(5)琼脂糖凝胶电泳：根据所要检测DNA样品的大小，配制合适浓度的琼脂糖凝胶，将6μL PCR扩增后的混合样品添加至点样孔中，当指示剂达到凝胶的2/3时停止电泳，凝胶在EB溶液中浸泡约1min后，用水缓慢冲洗，观察、分析并记录UV凝胶成像仪的电泳结果。
如图2所示，各组的DNA样本经过PCR扩增后电泳跑胶，其结果不同，根据本发明所述的口腔采样方法对多只大鼠进行口腔样本的采集，所得到的DNA样本电泳结果均与目的条带一致，说明该口腔采样方法收集到的DNA样本均有扩增产物生成，此采样方法获得生物量较大。但实验组2和实验组3面对采样位置或采样时间的不全面，其DNA样本的电泳结果为未出现目的条带或目的条带过暗，说明两组的采样方法收集到的DNA含量较少，获得的生物量较小，而本发明的口腔采样方法可以有效的收集鼠口腔中的微生物，并可获得足够量的目标DNA。
另外，目前现有技术中没有鼠口腔内微生物的详细、具体的采样方法，同时目前大都是简单的口腔采样，一般也就是类似实验组2或实验组3所述的方法进行采样，采样量小，有时不能满足实际的使用需求。
实施例3：16s rDNA测定细菌口腔内微生物菌群多样性及变化
将按照本发明方法采集的口腔样本或从样本中提取好的DNA送至测序公司进行16s rDNA测序，对结果进行分析。
如图3、图4所示，经过本发明所述口腔采样方法后的样本进行16s rDNA测序，得到的细菌物种分布图，该采样方法可用于宏基因组组学分析。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学，天科本真（天津）生物科技有限公司
<120> 一种鼠口腔内微生物的采样方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (5)
1.一种鼠口腔内微生物的采样方法，其特征在于：包括如下步骤：
用75％乙醇清洁工作表面、机架、剪刀，紫外灭菌30min；抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，先用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发，准备好无菌耳鼻口专用棉签，在鼠的口腔内部表面擦拭，从舌头开始，然后是颊部、上牙龈、上颚，最后是下门牙的牙龈及唇部，共计30s；结束后快速将采样后的棉签放入无菌EP管中或含有无菌Pbw溶液的EP管中，用剪刀切割棉签柄，长度不低于EP管长度的1/2；扣盖后立即将管放在干冰上；
收集所有样品后，直接放入EP管中的样品存储在-80℃，用于核酸和代谢分析；放入含有Pbw溶液的EP管存储在4℃，用于微生物分析，直到后续处理。
2.根据权利要求1所述的鼠口腔内微生物的采样方法，其特征在于：所述EP管在使用前在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
3.根据权利要求1所述的鼠口腔内微生物的采样方法，其特征在于：所述Pbw溶液在使用前，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟，随后在超净台分装。
4.根据权利要求1所述的鼠口腔内微生物的采样方法，其特征在于：每1LPbw溶液的配制方法为：
蒸馏水中添加蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g，调整pH值至7.4后，混合溶解后定容至1000mL，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
5.根据权利要求1至4任一项所述的鼠口腔内微生物的采样方法，其特征在于：抓住鼠，拉颈部皮肤，固定鼠的前肢，用沾有75％乙醇的棉球擦拭鼠口腔附近的毛发进行消毒，擦拭3-5s；在鼠的口腔内部表面擦拭3-5s；擦拭舌头时擦拭3-5s；擦拭颊部、上牙龈、上颚时分别擦拭3-5s；擦拭下门牙的牙龈、下唇部时分别擦拭3-5s，共计30s。
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- 2022-04-26 CN CN202210443221.0A patent/CN115040163A/zh active Pending
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