CN111996233A - 一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，步骤如下：⑴使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；⑵在无菌室内，按照受试者左脸颊、右脸颊和额头的顺序采集样品，取步骤⑴所得棉签在每个区域打圈50次；⑶将步骤⑵所得采样后的棉签放入无菌Pbw溶液中，4℃下保存备用。本发明中采样过程不会对受试者皮肤表面造成损伤，避免了侵入性采样对皮肤造成的刺激，安全性更高，适合面部皮肤采样使用。后续微生物群落测序验证了本发明与其他皮肤微生物采样方法相比，能够更好地还原皮肤真实的微生态。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法及应用。
背景技术
人体皮肤定殖着多种微生物并保持动态平衡，维持其独特的皮肤微生态。宏基因组(Metagenome)是以环境中所有微生物基因组为研究对象，通过对环境样品中的全基因组DNA进行高通量测序，获得单个样品的饱和数据量，基于denovo组装进行微生物群落结构多样性，微生物群体基因组成及功能，特定环境相关的代谢通路等分析，从而进一步发掘和研究具有应用价值的基因及环境中微生物群落内部、微生物与环境间的相互关系。
目前大多数人体微生物群落特征分析都是围绕肠道微生物研究设计的，皮肤与肠道的结构千差万别，错误的皮肤采样方法会导致样品被污染、微生物生物量低，加大微生物的定性和定量的偏差，为微生物研究造成障碍。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法及应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，步骤如下：
⑴使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
⑵在无菌室内，按照受试者左脸颊、右脸颊和额头的顺序采集样品，取步骤⑴所得棉签在每个区域打圈50次；
⑶将步骤⑵所得采样后的棉签放入无菌Pbw溶液中，4℃下保存备用。
而且，所述步骤⑴中消毒为使用75％酒精消毒，所述无菌生理盐水为：体积分数为0.9％生理盐水在121℃下，进行高压蒸汽灭菌15分钟制得。
而且，所述步骤⑵中无菌室为整洁的无菌室，使用消毒水擦拭桌面及桌面以上30cm的玻璃后，再使用75％酒精擦拭一次，紫外灭菌一小时后的无菌室。
而且，所述步骤⑵中受试者洗脸前后间隔1h以上进行采样，清水洗脸，避免化妆和使用个人卫生用品。
而且，所述步骤⑵中采集样品的区域大小为3cm×3cm。
而且，所述步骤⑶中无菌Pbw溶液的制备方法为：
取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000g，调整pH值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
如上所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法在皮肤微生物采样方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明中采样过程不会对受试者皮肤表面造成损伤，避免了侵入性采样对皮肤造成的刺激，安全性更高，适合面部皮肤采样使用。后续微生物群落测序验证了本发明与其他皮肤微生物采样方法相比，能够更好地还原皮肤真实的微生态。
2、本发明方法收集到的生物量较大，后续最终获得的总DNA浓度及质量能够达到微生物群落分析测序的要求。
3、本发明方法所采用的材料价廉易得，且该方法高效、简便。
4、通过16s rDNA测序、18s rDNA测序和实时荧光定量PCR验证本发明方法能够更大限度地涵盖到皮肤表面种类广、数量多的微生物。
附图说明
图1为本发明中16s rDNA测序物种Krona饼图；
图2为本发明中18s rDNA测序物种Krona饼图；
图3为本发明中细菌实时荧光定量PCR结果图；
图4为本发明中真菌实时荧光定量PCR结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，步骤如下：
⑴使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
⑵在无菌室内，按照受试者左脸颊、右脸颊和额头的顺序采集样品，取步骤⑴所得棉签在每个区域打圈50次；
⑶将步骤⑵所得采样后的棉签放入无菌Pbw溶液中，4℃下保存备用。
较优地，所述步骤⑴中消毒为使用75％酒精消毒，所述无菌生理盐水为：体积分数为0.9％生理盐水在121℃下，进行高压蒸汽灭菌15分钟制得。
较优地，所述步骤⑵中无菌室为整洁的无菌室，使用消毒水擦拭桌面及桌面以上30cm的玻璃后，再使用75％酒精擦拭一次，紫外灭菌一小时后的无菌室。
较优地，所述步骤⑵中受试者洗脸前后间隔1h以上进行采样，清水洗脸，避免化妆和使用个人卫生用品。
较优地，所述步骤⑵中采集样品的区域大小为3cm×3cm。
较优地，所述步骤⑶中无菌Pbw溶液的制备方法为：
取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000g，调整pH值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
如上所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法能够应用在皮肤微生物采样方面中。
具体地，相关制备及检测如下：
1、进行受试者面部皮肤微生物采样
选取年龄段在21～28岁的健康受试者。受试者排除标准：明显的皮肤病、吸烟、激素紊乱、一个月内进行过激素治疗、服用抗生素、服用抗真菌类药物等。受试者洗脸后间隔一小时以上才能进行上述采样步骤，清水洗脸，并避免化妆和使用护肤品等个人卫生用品。
(1)皮肤表面微生物的采集
1.1使用一次性医用消毒棉签蘸取适量的无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
1.2在无菌室内，按照受试者左脸颊、右脸颊和额头的顺序采集样品，取步骤1.1所得棉签以适当压力在每个区域打圈50次，将未与皮肤接触过的1.1所得棉签作为阴性对照；
无菌室指的是整洁的无菌室，使用消毒水擦拭桌面及桌面以上30cm的玻璃后，再使用75％酒精擦拭一次，紫外灭菌一小时后的无菌室；
1.3将1.2所得棉签放入无菌Pbw溶液中，4℃下保存备用。
所述Pbw溶液的制备为:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000g，调整pH值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
(2)样品预处理
将步骤(1)所得Pbw溶液及棉签在涡旋振荡器上进行振荡2min后，取出棉签，高速离心机离心1min，速度14000r/min，离心后弃掉上清液，下层菌液保存备用。
(3)提取不同皮肤样品的DNA
根据DNA提取试剂盒的操作说明分别提取细菌DNA和真菌DNA，将提取的DNA储存在-20℃的冰箱中，待用。
(4)PCR扩增
细菌的20μLPCR反应体系为：1μL步骤(3)提取的DNA，1μL引物ccsF(5’-CGGTGAATACGTTCTCGG-3’)，1μL引物ccsR(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，7μL灭菌超纯水，10μLGoldStar TaqMan Mixture酶
反应条件为：先95℃预变性10min；然后94℃30s，55℃30s，72℃8s，共40个循环；最后72℃延伸5min，10℃保温结束反应。
真菌的20μLPCR反应体系为：1μL步骤(3)提取的DNA，1μL引物
ccsF(5’-AAGGAAGGCAGCAGGCG-3’)，1μL引物
ccsR(5’-CACCAGACTTGCCCTCTAAT-3’)，7μL灭菌超纯水，10μLGoldStar TaqManMixture酶
反应条件为：先95℃预变性10min；然后94℃30s，56℃30s，72℃7s，共40个循环；最后72℃延伸5min，10℃保温结束反应。
(5)测序
将步骤(4)得到的PCR产物送至测序公司进行16s rDNA和18s rDNA测序，所得部分结果如图1、图2所示。
图1示出了经过本发明所述皮肤采样方法后进行16s rDNA测序，得到的细菌物种分布图；
图2示出了经过本发明所述皮肤采样方法后进行18s rDNA测序，得到的细菌物种分布图。
二、皮肤样品中微生物的实时荧光定量PCR测定
细菌的20μL的荧光定量PCR反应体系为：2μL步骤(3)提取的DNA，10μLTB GreenPremix Ex Taq ii酶，0.8μL引物ccsF(5’-CGGTGAATACGTTCTCGG-3’)，0.8μL引物ccsR(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，6μL灭菌超纯水，0.4μLRox Reference Dye染料。
真菌的20μL的荧光定量PCR反应体系为：2μL步骤(3)提取的DNA，10μLTB GreenPremix Ex Taq ii酶，0.8μL引物ccsF(5’-AAGGAAGGCAGCAGGCG-3’)，0.8μL引物ccsR(5’-CACCAGACTTGCCCTCTAAT-3’)，6μL灭菌超纯水，0.4μLRox Reference Dye染料。
真菌及细菌荧光定量PCR反应条件均为：先升温至95℃保持30s；然后95℃10s，55℃30s，55℃20s，72℃30s，共40个循环；最后进入溶解曲线阶段，95℃15s，60℃60s，95℃15s。
不同受试者皮肤表面微生物分析结果如图3、图4所示，不同拭子均有扩增产物生成，获得生物量较大。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA/RNA
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<400> 4
caccagactt gccctctaat 20
Claims (7)
1.一种基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，其特征在于：步骤如下：
⑴使用一次性医用消毒棉签蘸取无菌生理盐水，在一次性灭菌规格板规定的区域内进行采样；
⑵在无菌室内，按照受试者左脸颊、右脸颊和额头的顺序采集样品，取步骤⑴所得棉签在每个区域打圈50次；
⑶将步骤⑵所得采样后的棉签放入无菌Pbw溶液中，4℃下保存备用。
2.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，其特征在于：所述步骤⑴中消毒为使用75％酒精消毒，所述无菌生理盐水为：体积分数为0.9％生理盐水在121℃下，进行高压蒸汽灭菌15分钟制得。
3.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，其特征在于：所述步骤⑵中无菌室为整洁的无菌室，使用消毒水擦拭桌面及桌面以上30cm的玻璃后，再使用75％酒精擦拭一次，紫外灭菌一小时后的无菌室。
4.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，其特征在于：所述步骤⑵中受试者洗脸前后间隔1h以上进行采样，清水洗脸，避免化妆和使用个人卫生用品。
5.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，其特征在于：所述步骤⑵中采集样品的区域大小为3cm×3cm。
6.根据权利要求1所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法，其特征在于：所述步骤⑶中无菌Pbw溶液的制备方法为：
取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000g，调整pH值至7.4后，在121℃下进行高压蒸汽灭菌15分钟。
7.如权利要求1至6任一项所述的基于宏基因组学的面部皮肤表面的微生物采样方法在皮肤微生物采样方面中的应用。
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