CN114381535A - 一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，步骤如下：(1)提取口腔生物膜样品的微生物基因组DNA；(2)制备质粒标准品；(3)标准曲线建立；(4)定量分析；(5)计算待测生物膜样品目标基因片段的总拷贝数N＝10(Ct‑b)/a。本发明方法能够快速、准确、灵敏地定量出口腔生物膜中总细菌的数量以及5种主要属细菌的丰度和比例，避免了测序耗时、耗费成本的问题和传统的细菌培养数据不可靠的弊端，对研究体外口腔生物膜的物种组成和功能具有重要作用，且操作方便、快捷、经济。本发明所建立的标准曲线具有较高的线性相关(R2＞0.99)，数据精准度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法。
背景技术
口腔中定植着700多种细菌。在健康的口腔环境中，微生物处于动态平衡，一旦这种平衡被打破会导致龋齿、牙周炎和白色念珠菌病等各种口腔疾病。生活在口腔中的微生物群大多数以生物膜的形式存在。多年来，各种体外口腔生物膜模型被开发出来，旨在模拟口腔环境，在体外复制类似于体内环境的微生物组成结构和功能。因此，研究体外口腔生物膜的微生物组成和结构对于理解各种口腔疾病的病因机制和各种活性物质和抗菌剂等对口腔微生物的影响以及微生物之间的相互作用是十分重要的。
目前，用于检测生物膜中口腔细菌的方法包括细菌培养、聚合酶链式反应(PCR)、高通量测序等。传统的细菌培养不能鉴定那些不可培养的物种，因此可能会低估一些重要菌株的数量，而且从型、亚型、株、甚至分子水平上去认识口腔微生物变得越来越重要；多数研究采用高通量测序来分析口腔生物膜的微生物组成和功能，虽然精准度高，然而，依赖于测序的分析通常需要耗费大量时间，并且经济成本很高；PCR技术具有快速、方便、特异性高的特点，然而，普通的PCR技术难以对细菌的数量进行定量，实时荧光定量PCR是一项定量技术，相较于大多数研究采用测序的方法，这项技术在快速性和经济成本方面有很大的优势。
体外口腔生物膜通常在37℃，厌氧环境中进行培养，经由大量文献汇总分析，本申请人发现链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、假单胞菌属和梭杆菌属是目前体外口腔生物膜培养所能够得到的主要微生物类型。基于此，本申请人认为利用实时荧光定量PCR技术鉴定并定量口腔生物膜中总细菌、链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、假单胞菌属和梭杆菌属的数量，可以方便、快速地反映口腔生物膜的生物量和主要微生物结构，这项技术在快速性和经济成本方面有很大的优势。
通过检测，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，步骤如下：
(1)提取口腔生物膜样品的微生物基因组DNA；
(2)制备标准品：利用6组引物对BF-F1/BF-R1、BF-F2/BF-R2、BF-F3/BF-R3、BF-F4/BF-R4、BF-F5/BF-R5、BF-F6/BF-R6对唾液样品基因组DNA进行常规PCR扩增；得到的目的片段与pMD-19T载体连接，以获得含有总细菌、韦荣球菌属、普氏菌属和梭杆菌属的16s rRNA编码基因片段、链球菌属tuf基因片段、假单胞菌属sucD基因片段的6个质粒标准品，利用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为质粒标准品；
(3)标准曲线建立：将6个质粒标准品进行10倍梯度稀释后进行实时荧光定量PCR扩增，以质粒标准品拷贝数的对数为横坐标，得到的循环数Ct值为纵坐标绘制标准曲线，y＝ax+b，其中y为循环数Ct值，x为质粒标准品拷贝数的对数，a为斜率，b为截距；
(4)将待测生物膜样品与质粒标准品相同的扩增体系和扩增条件进行扩增，得到的Ct值代入标准曲线直线方程中，即可进行定量分析；
(5)计算待测生物膜样品目标基因片段的总拷贝数N＝10(Ct-b)/a。
进一步地，所述步骤(1)中提取生物膜样品微生物基因组DNA为通过试剂盒来提取。
进一步地，所述试剂盒为Fast DNA Spin Kit for Soil。
进一步地，所述步骤(2)中制备6个质粒标准品时所用的菌为大肠杆菌感受态细胞JM109。
进一步地，所述6组引物对为：
总细菌标准品：
BF-F1:SEQ ID NO.1：5’-CGGTGAATACGTTCTCGG-3’
BF-R1:SEQ ID NO.2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
链球菌属标准品：
BF-F2:SEQ ID NO.3：5’-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3’
BF-R2:SEQ ID NO.4：5’-ACGTTCGATTTCATCACGTTG-3’
韦荣球菌属标准品：
BF-F3:SEQ ID NO.5：5’-ACCAACCTGCCCTTCAGA-3’
BF-R3:SEQ ID NO.6：5’-CGTCCCGATTAACAGAGCTT-3’
普氏菌属标准品：
BF-F4:SEQ ID NO.7：5’-CCAGCCAAGTAGCGTGCA-3’
BF-R4:SEQ ID NO.8：5’-TGGACCTTCCGTATTACCGC-3’
假单胞菌属标准品：
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梭杆菌属标准品：
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BF-R6:SEQ ID NO.12：5’-TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3’。
进一步地，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR的扩增体系为：DNA模板2μL,10μM上游引物0.8μL，10μM下游引物0.8μL，2×TB Green PrimerEx TaqⅡ10μL，Rox 0.4μL，ddH2O6μL，总反应体系为20μL。
进一步地，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s；54℃(韦荣球菌属标准品)、57℃(总细菌标准品)、58℃(链球菌属标准品、梭杆菌属标准品)、60℃(假单胞菌属标准品)、61℃(普氏菌属标准品)退火20s、72℃延伸30s，总共40个循环，溶解曲线分析温度范围为：60℃-95℃。
进一步地，所述步骤(4)中的结果判定方法为：阈值以上有扩增曲线的样本即为阳性样本，根据阳性样本的Ct值和标准曲线直线方程，即可计算出生物膜样品总细菌的数量和链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、假单胞菌属和梭杆菌属的数量。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明方法能够快速、准确、灵敏地定量出口腔生物膜中总细菌的数量以及主要5种属的丰度和比例，避免了测序耗时、耗费成本的问题和传统细菌培养数据不可靠的弊端，对研究体外口腔生物膜的物种组成和功能具有重要作用，且操作方便、快捷、经济。本发明所建立的标准曲线具有较高的线性相关(R2＞0.99)，数据精准度高。
2、本发明方法提供了一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌以及5种主要属链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、梭杆菌属和假单胞菌属数量的方法。解决了细菌培养方法不能获得真实可靠的细菌数量、测序方法耗时、成本高以及普通PCR技术只能定性不能定量的问题。本发明采用基因克隆技术将总细菌、韦荣球菌属、普氏菌属和梭杆菌属的16s核糖体RNA(16s rRNA)编码基因片段、链球菌属tuf基因片段、假单胞菌属sucD基因片段插入到载体pMD19-T中，获得含有这些基因片段的重组质粒，以此作为标准品。
3、本发明方法不依赖于传统测序方法，快速准确地定量出口腔生物膜中总细菌以及5种主要属细菌的数量。
附图说明
图1为本发明中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1.总细菌(123bp)；2.假单胞菌属(283bp)；3.普氏菌属(151bp)；M:DL500 DNA Marker；4.梭杆菌属(100bp)5.韦荣球菌属(343bp)；6.链球菌属(197bp)；
图2为本发明中总细菌标准品荧光定量PCR标准曲线(直线方程：Y＝-3.422X+38.92)；
图3为本发明中链球菌属标准品荧光定量PCR标准曲线(直线方程：Y＝-3.558X+38.84)；
图4为本发明中韦荣球菌属标准品荧光定量PCR标准曲线(直线方程：Y＝-4.011X+38.69)；
图5为本发明中普氏菌属标准品荧光定量PCR标准曲线(直线方程：Y＝-3.438X+35.25)；
图6为本发明中假单胞菌属标准品荧光定量PCR标准曲线(直线方程：Y＝-3.539X+36.09)；
图7为本发明中梭杆菌属标准品荧光定量PCR标准曲线(直线方程：Y＝-4.494X+43.60)；
图8为本发明中总细菌标准品扩增曲线和熔解曲线；其中，上图为扩增曲线，下图为溶解曲线；
图9为本发明中链球菌属标准品扩增曲线和熔解曲线；其中，上图为扩增曲线，下图为扩增曲线；
图10为本发明中韦荣球菌属标准品扩增曲线和熔解曲线；其中，上图为扩增曲线，下图为扩增曲线；
图11为本发明中普氏菌属标准品扩增曲线和熔解曲线；其中，上图为扩增曲线，下图为扩增曲线；
图12为本发明中假单胞菌属标准品扩增曲线和熔解曲线；其中，上图为扩增曲线，下图为扩增曲线；
图13为本发明中梭杆菌属标准品扩增曲线和熔解曲线；其中，上图为扩增曲线，下图为扩增曲线。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，步骤如下：
(1)提取口腔生物膜样品的微生物基因组DNA；
(2)制备标准品：利用6组引物对BF-F1/BF-R1、BF-F2/BF-R2、BF-F3/BF-R3、BF-F4/BF-R4、BF-F5/BF-R5、BF-F6/BF-R6对唾液样品基因组DNA进行常规PCR扩增；得到目的片段与pMD-19T载体连接，以获得含有总细菌、韦荣球菌属、普氏菌属和梭杆菌属的16s rRNA编码基因片段、链球菌属tuf基因片段、假单胞菌属sucD基因片段的6个质粒标准品，利用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为质粒标准品；
(3)标准曲线建立：将6个质粒标准品进行10倍梯度稀释后进行实时荧光定量PCR扩增，以质粒标准品拷贝数的对数为横坐标，得到的循环数Ct值为纵坐标绘制标准曲线，y＝ax+b，其中y为循环数Ct值，x为质粒标准品拷贝数的对数，a为斜率，b为截距；
(4)将待测生物膜样品与质粒标准品用相同的扩增体系和扩增条件进行扩增，得到的Ct值代入标准曲线直线方程，即可进行定量分析；
(5)计算待测生物膜样品目标基因片段的总拷贝数N＝10(Ct-b)/a。
较优地，所述步骤(1)中提取生物膜样品微生物基因组DNA为通过试剂盒来提取。
较优地，所述试剂盒为Fast DNA Spin Kit for Soil。
较优地，所述步骤(2)中制备6个质粒标准品时所用的菌为大肠杆菌感受态细胞JM109。
较优地，所述6组引物对为：
总细菌标准品：
BF-F1:SEQ ID NO.1：5’-CGGTGAATACGTTCTCGG-3’
BF-R1:SEQ ID NO.2：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT--3’
链球菌属标准品：
BF-F2:SEQ ID NO.3：5’-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3’
BF-R2:SEQ ID NO.4：5’-ACGTTCGATTTCATCACGTTG--3’
韦荣球菌属标准品：
BF-F3:SEQ ID NO.5：5’-ACCAACCTGCCCTTCAGA-3’
BF-R3:SEQ ID NO.6：5’-CGTCCCGATTAACAGAGCTT-3’
普氏菌属标准品：
BF-F4:SEQ ID NO.7：5’-CCAGCCAAGTAGCGTGCA-3’
BF-R4:SEQ ID NO.8：5’-TGGACCTTCCGTATTACCGC-3’
假单胞菌属标准品：
BF-F5:SEQ ID NO.9：5’-CGTCCTGATCAATAAAGACACC-3’
BF-R5:SEQ ID NO.10：5’-GATGCAGACGATCAGCTTG-3’
梭杆菌属标准品：
BF-F6:SEQ ID NO.11：5’-CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3’
BF-R6:SEQ ID NO.12：5’-TGGTCCTCACTGATTCACACAGA-3’。
较优地，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR的扩增体系为：DNA模板2μL，10μM上游引物0.8μL，10μM下游引物0.8μL，2×TB Green PrimerEx TaqⅡ10μL，Rox 0.4μL，ddH2O6μL，总反应体系为20μL。
较优地，所述步骤(3)中实时荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s；54℃(韦荣球菌属标准品)、57℃(总细菌标准品)、58℃(链球菌属标准品、梭杆菌属标准品)、60℃(假单胞菌属标准品)、61℃(普氏菌属标准品)退火20s、72℃延伸30s，总共40个循环，溶解曲线分析温度范围为：60℃-95℃。
较优地，所述步骤(4)中的结果判定方法为：阈值以上有扩增曲线的样本即为阳性样本，根据阳性样本的Ct值和标准曲线直线方程，即可计算出生物膜样品总细菌的数量和链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、假单胞菌属和梭杆菌属的数量。
具体地，相关制备及检测如下：
实施例1待测生物膜样品基因组DNA的提取
本实施例采用的生物膜接种自健康志愿者的唾液样本，生物膜在37℃、AAA模型(购自荷兰阿姆斯特丹)、三种条件(好氧环境、厌氧环境、好氧转厌氧环境)下生长96h。培养生物膜的培养基为SHI培养基，基质为12mm的玻璃盖玻片，每天更新培养基2次，然后将生物膜涡旋震荡，超声分散在3ml的PBS中，提取微生物基因组DNA。
具体操作步骤如下：
1)将12mm的玻璃盖玻片组装到AAA模型中，然后进行121℃，高温高压灭菌；
2)按照唾液：SHI培养基＝1:50的比例制备接种物，在24孔板中每个孔添加1.5ml的接种物，在三种条件下培养生物膜96h：好氧环境、厌氧环境、好氧转厌氧环境(先在好氧条件下培养24h，然后转移到厌氧环境培养，直至96h)，在培养过程中，每天2次更新新鲜的SHI培养基；
3)利用手术刀片机械刮擦玻璃盖玻片表面将生物膜收获在10ml的离心管中，其中含有3ml的PBS，然后涡旋震荡1min，超声1h，将生物膜分散在PBS中；
4)利用Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒提取三种不同条件生物膜的微生物基因组DNA作为待测生物膜样品的基因组DNA。
实施例2质粒标准品的构建
以健康志愿者口腔唾液基因组DNA为模板，分别用6组引物对BF-F1/BF-R1-BF-F6/BF-R2扩增各自目的基因片段。对扩增的PCR片段进行纯化，将纯化后的6种目的基因片段分别与pMD-19T载体连接以构建质粒标准品。利用琼脂糖凝胶电泳对质粒标准品进行验证，结果如图1所示，通道1为总细菌标准品，大小为123bp；通道2为假单胞菌属标准品，大小为283bp；通道3为普氏菌属标准品，大小为151bp；通道M为DL 500DNA Makker；通道5位梭杆菌属标准品，大小为100bp；通道6为韦荣球菌属标准品，大小为343bp；通道7为链球菌属标准品，大小为197bp。
实施例3实时荧光定量PCR扩增反应
1、实时荧光定量PCR扩增体系如下表1所示：
表1实时荧光定量PCR扩增体系
2、采用三步法进行扩增，扩增条件为：95℃30s；95℃10s；54℃(韦荣球菌属标准品)、57℃(总细菌标准品)、58℃(链球菌属标准品、梭杆菌属标准品)、60℃(假单胞菌属标准品)、61℃(普氏菌属标准品)20s、72℃30s，总共40个循环，溶解曲线分析温度范围为：60℃-95℃。
实施例4标准曲线绘制
1、用分光光度计分别测定6个质粒标准品的浓度，计算重组质粒的拷贝数。
拷贝数(copy/μL)＝(L×C)/(N×M×109)
其中L：阿伏加德罗常数(Avogadro’s constant)，为6.02×1023/mol，
C：测得的质粒浓度(单位：ng/μL)，
N：质粒的长度，即目标基因与克隆载体的长度之和，
M：DNA碱基对的平均分子量，即660g/mol。
2、然后用灭菌的RNase-Free ddH2O对质粒标准品进行10倍梯度稀释，选择1010～102copies/μL之间的6个浓度进行实时荧光定量PCR扩增，扩增完成后，以Ct值为纵坐标，质粒标准品拷贝数的对数为横坐标，制作标准曲线，如图2～7所示。直线方程分别为：总细菌Y＝-3.422X+38.92，链球菌属Y＝-3.558X+38.84，韦荣球菌属Y＝-4.011X+38.69，普氏菌属Y＝-3.438X+35.25，假单胞菌属Y＝-3.539X+36.09，梭杆菌属Y＝-4.494X+43.60，R2均＞0.99，表明建立的6种质粒标准品的标准曲线都具有良好的线性相关。
3、灵敏性实验
如图8～13所示，6种质粒标准品的扩增曲线圆滑平整。总细菌、链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、假单胞菌属和梭杆菌属的最低检测限度为：1.4490×104copies/μL、4.1802×103copies/μL、6.0347×102copies/μL、1.3327×103copies/μL、7.212×102copies/μL和5.7792×102copies/μL。
实施例5待测生物膜样品定量实验和特异性实验
1、以好氧生物膜Aer、厌氧生物膜Ana、好氧转厌氧生物膜Aer-Ana、6种质粒标准品和灭菌的RNase-Free ddH2O为模板按照上述的扩增体系和条件进行实时荧光定量PCR实验，结果如表2-7。检测结果显示，仅厌氧生物膜Ana中出现了总细菌和5种主要属的扩增，好氧生物膜Aer和好氧转厌氧生物膜Aer-Ana没有关于韦荣球菌属和梭杆菌属的扩增，因为韦荣球菌和梭杆菌是严格的厌氧菌，在氧气存在的条件下无法生存，且6种质粒标准品的溶解曲线为单一峰，如图8～13所示。证明该方法可特异性地检测并定量口腔生物膜中总细菌和主要5种属细菌的数量。
2、重复性实验
以1010～102copies/μL之间的6个浓度以及不同的生物膜样品作为模板进行实时荧光定量PCR重复性实验，结果如表2～7。由表可知，质粒标准品的荧光定量Ct值变异系数在0.15％～2.62％之间，对于生物膜样品，样品检测结果变异系数均小于2％，表明建立的荧光定量PCR方法具有良好的重复性。
表2总细菌标准品和生物膜样品重复性实验
表3链球菌属标准品和生物膜样品重复性实验
表4韦荣球菌属标准品和生物膜样品重复性实验
表5普氏菌属标准品和生物膜样品重复性实验
表6假单胞菌属标准品和生物膜样品重复性实验
表7梭杆菌属标准品和生物膜样品重复性实验
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> BF-F1(Unknown)
<400> 1
cggtgaatac gttctcgg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> BF-R1(Unknown)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> BF-F2(Unknown)
<400> 3
gtacagttgc ttcaggacgt atc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> BF-R2(Unknown)
<400> 4
acgttcgatt tcatcacgtt g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> BF-F3(Unknown)
<400> 5
accaacctgc ccttcaga 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> BF-R3(Unknown)
<400> 6
cgtcccgatt aacagagctt 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> BF-F4(Unknown)
<400> 7
ccagccaagt agcgtgca 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> BF-R4(Unknown)
<400> 8
tggaccttcc gtattaccgc 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> BF-F5(Unknown)
<400> 9
cgtcctgatc aataaagaca cc 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> BF-R5(Unknown)
<400> 10
gatgcagacg atcagcttg 19
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> BF-F6(Unknown)
<400> 11
cgcagaaggt gaaagtcctg tat 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> BF-R6(Unknown)
<400> 12
tggtcctcac tgattcacac aga 23
Claims (8)
1.一种不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)提取口腔生物膜样品的微生物基因组DNA；
(2)制备标准品：利用6组引物对BF-F1/BF-R1、BF-F2/BF-R2、BF-F3/BF-R3、BF-F4/BF-R4、BF-F5/BF-R5、BF-F6/BF-R6对唾液样品基因组DNA进行PCR扩增；得到目的片段与pMD-19T载体连接，以获得含有总细菌、韦荣球菌属、普氏菌属和梭杆菌属的16srRNA编码基因片段、链球菌属tuf基因片段、假单胞菌属sucD基因片段的6个质粒标准品，利用分光光度计测定质粒浓度，定量后作为质粒标准品；
(3)标准曲线建立：将6个质粒标准品进行10倍梯度稀释后进行实时荧光定量PCR扩增，以质粒标准品拷贝数的对数为横坐标，得到的循环数Ct值为纵坐标绘制标准曲线，y＝ax+b，其中y为循环数Ct值，x为质粒标准品拷贝数的对数，a为斜率，b为截距；
(4)将待测生物膜样品与质粒标准品相同的扩增体系和扩增条件进行扩增，得到的Ct值代入标准曲线直线方程中，即可进行定量分析；
(5)计算待测生物膜样品目标基因片段的总拷贝数N＝10(Ct-b)/a。
2.根据权利要求1所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中提取生物膜样品微生物基因组DNA为通过试剂盒来提取。
3.根据权利要求2所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述试剂盒为Fast DNA Spin Kit for Soil。
4.根据权利要求1所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中制备6个质粒标准品时所用的菌为大肠杆菌感受态细胞JM109。
5.根据权利要求1所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述6组引物对为：
总细菌标准品：
BF-F1:SEQ ID NO.1；
BF-R1:SEQ ID NO.2；
链球菌属标准品：
BF-F2:SEQ ID NO.3；
BF-R2:SEQ ID NO.4；
韦荣球菌属标准品：
BF-F3:SEQ ID NO.5；
BF-R3:SEQ ID NO.6；
普氏菌属标准品：
BF-F4:SEQ ID NO.7；
BF-R4:SEQ ID NO.8；
假单胞菌属标准品：
BF-F5:SEQ ID NO.9；
BF-R5:SEQ ID NO.10；
梭杆菌属标准品：
BF-F6:SEQ ID NO.11；
BF-R6:SEQ ID NO.12。
6.根据权利要求1所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中实时荧光定量PCR的扩增体系为：DNA模板2μL,10μM上游引物0.8μL，10μM下游引物0.8μL，2×TB Green Primer Ex Taq Ⅱ 10μL，Rox 0.4μL，ddH2O 6μL，总反应体系为20μL。
7.根据权利要求1所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中实时荧光定量PCR的扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s；54℃(韦荣球菌属标准品)、57℃(总细菌标准品)、58℃(链球菌属标准品、梭杆菌属标准品)、60℃(假单胞菌属标准品)、61℃(普氏菌属标准品)退火20s、72℃延伸30s，总共40个循环，溶解曲线分析温度范围为：60℃-95℃。
8.根据权利要求1至7任一项所述的不基于测序的快速检测口腔生物膜中总细菌及5种主要属细菌数量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的结果判定方法为：阈值以上有扩增曲线的样本即为阳性样本，根据阳性样本的Ct值和标准曲线直线方程，即可计算出生物膜样品总细菌的数量和链球菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、假单胞菌属和梭杆菌属的数量。
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