CN105189745A - 可延展聚合物内的核酸的检测和定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从粘附于可以在活生物体内延展、尤其是可以在所述活生物体的口腔内延展的聚合物的微生物或哺乳动物细胞提取核酸的方法。本发明还提供了粘附于可延展聚合物例如口香糖的微生物的检测和定量方法。

Description

可延展聚合物内的核酸的检测和定量方法
技术领域
本发明提供了从粘附于可以在活生物体内延展的聚合物、特别是可以在所述活生物体的口腔中延展的聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物或哺乳动物细胞提取核酸的方法。本发明还提供了粘附于可延展聚合物例如口香糖或俘获在其中的微生物的检测和定量方法。
背景技术
关于口香糖首次使用的描述可以追溯到古希腊，在那里人们使用来自于乳香黄连木的树脂来止渴或清新口气。直至19世纪晚期，第一块口香糖才成功上市，在那时，人心果树的橡胶状树汁形成了口香糖的基础。在20世纪晚期，口香糖不仅被当作生活方式的象征，而且也已报道了对认知表现、情绪、警觉性和食欲控制的影响。此外，口香糖已被更多地朝向口腔护理和功能性食品(“营养品”)方向开发，因为它提供了容易应用的药物递送介质，对口腔健康具有潜在益处。高达每人每年2.5kg的高消费率已使其成为数十亿美元的产业。
一般来说，口香糖由被称为胶基的合成弹性体如聚乙酸乙烯酯或聚异丁烯的水不溶性混合物构成。对胶基材料的重要要求是它们在口中不溶解，并且可以被长时间咀嚼而不经历组成变化。在所有可商购的口香糖中，胶基被增补有结构剂、软化剂和调味剂，而目前，糖常常被人造甜味剂例如山梨糖醇、木糖醇或甘露糖醇代替。
据描述，包含木糖醇和其他人造甜味剂能减少牙齿上口腔生物膜的形成。口腔生物膜是世界上最普遍的感染性疾病、即龋齿和牙周病的病因。龋齿由牙釉质的天然存在的去矿化与再矿化之间的失衡造成。当由于糖被牙齿上口腔生物膜的所选成员发酵而造成口腔生物膜的pH下降到低于5.5时，发生去矿化。大多数人造糖不被或几乎不被口腔细菌发酵，因此不降低pH。此外，口香糖引起咀嚼增加，其刺激唾液产生，因此提高了口腔中再矿化所需的钙和磷酸盐的浓度。已向商品化口香糖添加了氟化物，以防止牙釉质去矿化并刺激再矿化。将咀嚼口香糖当作每日口腔卫生程序的补充是有吸引力的，特别是因为古往今来大多数人不能维持预防疾病所需的口腔生物膜控制水平。这导致了向口香糖掺入抗微生物剂例如氯己定和草药提取物，并且事实上已证明口香糖在防止口腔生物膜的重新生长方面是成功的。尽管已知咀嚼口香糖有助于除去齿间残渣(Kakodkar等，DentalResearchJournal7:64–69,2011)，并且已向口香糖添加去污剂例如多磷酸盐以提高它们的清洁力，但尚不清楚咀嚼口香糖是否真正从口腔除去细菌。特别是通过口香糖优先除去引起疾病的生物体例如产酸的变异链球菌(Streptococcusmutans)或被视为牙釉质的初始定植者的物种，使口香糖变成每日口腔卫生程序的有价值的补充。
人类口腔含有不同且大量的菌群，并且胃肠系统和呼吸系统的许多疾病可以在口腔中显现。还存在许多口腔特有的疾病。除了细菌生物体之外，口腔微生物可以包括真菌、原生动物和病毒物种，并且许多这些微生物粘附于牙齿、龈沟、舌和颊粘膜。每个位点具有允许生物体实现驻留的独特方式。许多这些微生物可能粘附于它们在口腔中时接触的聚合物，并且这些聚合物除了包括如上所述的口香糖之外，还包括牙科和牙周器具和组合物。
因此，对于开发检测、鉴定和定量粘附于口腔中的聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物、例如在使用后被捕获在口香糖中的细菌的新方法，存在着需求。
发明内容
已知口香糖对维持口腔健康有贡献；然而，尚不清楚口香糖是否能够实际上从口腔除去细菌和其他微生物。本发明提供了一种使用扩增方法例如定量聚合酶链反应(PCR)来检测和定量来自于微生物的核酸的方法，所述微生物粘附于活生物体口腔内的可延展聚合物例如口香糖的外表面和/或俘获在所述聚合物的内表面中。本文中提供的研究描述了一种定量和定性被捕获在咀嚼后的口香糖中的细菌的数量的方法(体外或体内)。
本发明提供了从可以在活生物体内延展的聚合物提取核酸的方法，所述方法包括：a)将所述聚合物与i)有机溶剂和ii)缓冲溶液相接触，以及b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述聚合物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液内。本发明设想了在所述聚合物与活生物体相接触后执行所述从聚合物提取核酸的方法。所述方法可以在体外或所述活生物体外部执行。
这些方法还可以包括鉴定从所述聚合物提取的核酸的来源的步骤，和/或对从所述聚合物提取的核酸进行定量的步骤。使用扩增方法例如聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等温扩增和基于序列的扩增来进行鉴定步骤或定量步骤。
本发明的方法从可以在活生物体中延展、例如可以在活生物体的口腔中延展的聚合物提取核酸。术语“可以在活生物体中延展”是指在活生物体中的温度和pH下是柔性和韧性的聚合物，但在暴露于由所述生物体施加的不同力和条件(例如温度、pH、酶)时聚合物的组成是稳定的。例如，本发明的方法包括对由生物体施加的力(例如牙齿或牙龈的咀嚼、研磨或咬切)、生物体中的温度(例如生物体口腔的温度)或化学条件(例如由生物体产生的酶、活生物体口腔的pH)做出响应可以延展的聚合物。这些可延展聚合物可能是有机的(具有碳基(carbonbase))，因此这些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。这样的聚合物的实例包括口香糖、泡泡糖或胶基。
在一种实施方式中，在本发明的任何方法中使用的可延展聚合物是弹性体，例如聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物,硅酮、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶(sorva)和巴拉塔树胶(massarandubabalata)或其组合。
在另一种实施方式中，在本发明的任何方法中使用的可延展聚合物在牙科或牙周组合物、器具或装置内。例如，所述可延展聚合物可以是包含在牙髓(牙科)或牙周器械或组合物上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在牙套、填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内嵌体、牙科外嵌体和镶盖中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科装置(例如支架或承载物)、颌面器具例如腭裂板、上颌支架和正畸矫治器上或其中。这些可延展聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶(guttapercha)和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、尼龙和可生物降解聚合物例如聚丙交酯(PLA)或其组合。
在本发明的任一方法中，使用有机溶剂和缓冲溶液从聚合物提取核酸。术语“有机溶剂”是指能够溶解或分散一种或多种其他物质的基于碳的溶剂。可以使用有机溶剂例如氯仿、二甲苯、甲苯、1,2-二氯苯、己烷、四氢呋喃、二氯甲烷或丙酮来进行本发明的任一方法。
术语“缓冲溶液”是指由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物构成以便保持溶液的pH几乎恒定的水性溶液。可以使用分子生物学领域中常规的并且核酸在其中稳定的任何缓冲溶液，例如Tris缓冲液、TBE缓冲液(Tris-硼酸-EDTA)和TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)来进行本发明的任一方法。在特定实施方式中，缓冲溶液是包含三(羟甲基)氨基甲烷的Tris缓冲液。Tris缓冲液也被称为Tris碱、Trizma、Trisamine、THAM、氨丁三醇、氨基丁三醇和缓血酸胺(Tromethane)。
在本发明的任一方法中，所述聚合物可以被有机溶剂部分或完全溶解。
在本发明的任一方法中，从所述聚合物的内表面提取核酸。本发明还提供了从所述聚合物提取核酸的方法，其中至少约99％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约98％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约95％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约90％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约85％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约80％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约75％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约60％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，至少约55％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取，或至少约50％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的核酸被提取。
在一种实施方式中，本发明提供了从粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物、包括俘获在所述聚合物的内表面中的微生物或粘附于所述聚合物的外表面或俘获在所述聚合物的外表面中的微生物提取核酸的方法。例如，本发明提供了其中核酸的来源是细菌、病毒、真菌或原生动物的方法。具体来说，核酸的来源可以是口腔的病原细菌或共生细菌，例如变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆菌(Lactobacillussalivarius)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
在另一种实施方式中，本发明提供了从哺乳动物细胞提取核酸的方法，所述哺乳动物细胞例如人类细胞、犬类细胞、猫类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、牛类细胞、马类细胞、绵羊细胞、山羊细胞、灵长类细胞、来自于水生哺乳动物例如鲸和海豚的细胞以及来自于其他外来哺乳动物的细胞。例如，本发明提供了其中核酸的来源是上皮细胞、鳞状细胞、成纤维细胞、干细胞或角膜细胞的方法。本发明还提供了从癌细胞提取核酸的方法。
本发明的另一方面是粘附于可以在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物的检测方法，所述方法包括：a)将至少一部分所述聚合物溶解在有机溶剂和缓冲溶液中，b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述微生物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液内，以及c)使用至少一种对所述微生物特异的寡核苷酸引物扩增所述核酸。此外，所述方法可以使用两种或更多种引物、三种或更多种引物来进行。在这种方法中，所检测的微生物可能粘附于所述聚合物的外表面或俘获在所述聚合物的外表面中或俘获在所述聚合物的内表面中。本发明设想了在将聚合物与活生物体相接触后执行检测粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的方法。所述方法在体外或所述活生物体的外部进行。这些方法的执行可用于质量控制目的，例如在食品安全、食品腐败和发酵领域中工作，并用于与食品相接触的聚合物例如包装物中的聚合物的微生物风险评估。这些方法的执行也可用于诊断对象口腔的感染、疾病、障碍或病症，用于确定对象发生疾病、障碍或病症的易感性，或用于产生对象的微生物分布情况(profile)。
可以使用本领域中已知的任何方法来进行这些方法的扩增步骤。例如，可以使用聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等温扩增、基于序列的扩增或基于序列的扩增来扩增粘附于聚合物或俘获在聚合物中的微生物的核酸。
这些方法还可以包括对粘附于聚合物或俘获在聚合物中的微生物的数量进行定量的步骤。使用扩增方法例如聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等温扩增或基于序列的扩增来进行鉴定步骤或定量步骤。
本发明提供了粘附于可以在活生物体内延展的聚合物例如口香糖、泡泡糖或胶基或俘获在所述聚合物中的微生物的检测方法。这些可延展聚合物可能是有机的(具有碳基)，因此这些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。在一种实施方式中，所述可延展聚合物是弹性体例如聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、硅酮、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
在另一种实施方式中，微生物粘附或俘获在其中的可延展聚合物可以在牙科或牙周组合物、器具或装置内。例如，可延展聚合物可以是包含在牙髓(牙科)或牙周器械或组合物上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内嵌体、牙科外嵌体和镶盖中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科装置(例如支架或承载物)、颌面器具例如腭裂板、上颌支架和正畸矫治器上或其中。这些可延展聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、硅酮、尼龙和可生物降解聚合物例如聚丙交酯或其组合。
在粘附于可以在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的检测方法中，将所述聚合物溶解在有机溶剂例如氯仿、二甲苯或甲苯以及在分子生物学领域中常规的并且核酸在其中稳定的缓冲溶液例如Tris缓冲液、TBE缓冲液(Tris-硼酸-EDTA)和TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)中。在特定实施方式中，Tris缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷。Tris缓冲液也被称为Tris碱、Trizma、Trisamine、THAM、氨丁三醇、氨基丁三醇和缓血酸胺。
本发明提供了任何类型的微生物(包括细菌、病毒、真菌和原生动物)的检测方法。例如，本发明提供了检测口腔中存在的病原细菌或共生细菌的方法，所述细菌例如变异链球菌(Streptococcusmutans)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tannerellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆菌(Lactobacillussalivarius)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。任选地，所述方法还可以包括通过检测粘附于与哺乳动物对象例如人类对象的口腔相接触的可延展聚合物或俘获在所述聚合物中的细菌的存在，在所述哺乳动物对象中诊断细菌感染的步骤。所述方法还可以任选地包括将口腔中细菌的存在或细菌感染的诊断告知所述人类对象的步骤。
本发明还提供了诊断哺乳动物对象的口腔中的细菌感染的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的细菌，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的细菌指示所述对象的口腔中的细菌感染。
本发明还提供了确定哺乳动物对象在口腔中发生细菌感染的易感性的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的细菌，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的细菌指示在所述对象的口腔中发生细菌感染的增加的易感性，或在所述对象的口腔中发生与细菌的存在相关的疾病、病症或障碍的增加的易感性。
此外，本发明提供了检测口腔中存在的病毒的方法，所述病毒例如人类疱疹病毒(HHV)-1(也称为单纯性疱疹病毒(HSV)-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(也称为水痘-带状疱疹病毒)、HHV-4(Epstein-Barr病毒)、HHV-5(巨细胞病毒)、HHV-6、HHV-7、HHV-8、脊髓灰质炎病毒、A组柯萨奇病毒、B组柯萨奇病毒、埃可病毒和肠道病毒71(EV-71)、人乳头瘤病毒家族(HPV)例如HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-35、腮腺炎病毒、新城疫病毒、人类副流感病毒2型、4a型和4型、副粘病毒、风疹病毒、人类流感病毒A型例如H1N1和H3N3、人类流感病毒B型、人类流感病毒C型、鼻病毒、犬口腔乳头瘤病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒。任选地，所述方法还可以包括通过检测粘附于与哺乳动物例如人类的口腔相接触的可延展聚合物或俘获在所述聚合物中的病毒的存在，在所述哺乳动物对象中诊断病毒感染的步骤。所述方法还可以任选地包括将口腔中病毒的存在或病毒感染的诊断告知所述人类对象的步骤。
本发明还提供了诊断哺乳动物对象的口腔中的病毒感染的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的病毒，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的病毒指示所述对象口腔中的病毒感染。
本发明还提供了确定哺乳动物对象在口腔中发生病毒感染的易感性的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的病毒，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获所述聚合物中的病毒指示在所述对象的口腔中发生病毒感染的增加的易感性，或在所述对象的口腔中发生与病毒的存在相关的疾病、病症或障碍的增加的易感性。
此外，本发明提供了检测口腔中真菌的存在的方法。本发明的方法可以检测真菌，诸如假丝酵母例如白假丝酵母(Candidaalbicans)、曲霉(Aspergillus)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、格特隐球菌(Cryptococcusgattii)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidiodesimmites)和接合菌(Zygomycota)。任选地，所述方法还可以包括通过检测粘附于与哺乳动物例如人类的口腔相接触的可延展聚合物或俘获在所述聚合物中的真菌的存在，在所述哺乳动物对象中诊断真菌感染的步骤。所述方法还可以任选地包括将口腔中真菌的存在或真菌感染的诊断告知所述人类对象的步骤。
本发明还提供了诊断哺乳动物对象的口腔中的真菌感染的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的真菌，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的真菌指示所述对象口腔中的真菌感染。
本发明还提供了确定哺乳动物对象在口腔中发生真菌感染的易感性的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的真菌，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的真菌指示在所述对象的口腔中发生真菌感染的增加的易感性，或在所述对象的口腔中发生与真菌的存在相关的疾病、病症或障碍的增加的易感性。
本发明还提供了检测口腔中原生动物例如龈内阿米巴(Entamoebagingivalis)和口腔毛滴虫(Trichomonastenax)的存在的方法。任选地，所述方法还可以包括通过检测粘附于与哺乳动物例如人类的口腔相接触的可延展聚合物或俘获在所述聚合物中的原生动物的存在，在所述哺乳动物对象中诊断原生动物感染的步骤。所述方法还可以任选地包括将口腔中原生动物的存在或原生动物感染的诊断告知所述人类对象的步骤。
本发明还提供了诊断哺乳动物对象的口腔中的原生动物感染的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的原生动物，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的原生动物指示所述对象口腔中的原生动物感染。
本发明还提供了确定哺乳动物对象在口腔中发生原生动物感染的易感性的体外方法，所述方法包括按照任一前述方法检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的原生动物，其中将所述聚合物与对象的口腔相接触，并且其中存在粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的原生动物指示在所述对象的口腔中发生原生动物感染的增加的易感性，或在所述对象的口腔中发生与原生动物的存在相关的疾病、病症或障碍的增加的易感性。
此外，检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的微生物的方法可用于诊断口腔中与细菌、病毒、真菌或原生动物感染相关的任何疾病。示例性的病症、疾病和障碍包括慢性牙周炎、急性成人牙周炎、牙龈炎例如急性坏死溃疡性牙龈炎、樊尚咽峡炎、龋齿、疱疹病毒感染、原发性疱疹性龈口炎或口腔疱疹(唇疱疹和口溃疡)、生殖器疱疹、水痘-带状疱疹病毒感染例如水痘或带状疱疹、流感、普通感冒、性病、单核细胞增多症、柯萨奇病毒感染例如手足口病、疱疹性咽峡炎、急性淋巴结性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、风疹(德国麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛状白斑症、幼儿急疹、卡波西肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鹅口疮)、急性萎缩性(红斑性)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病、慢性萎缩性(红斑性)念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、副球孢子菌病和接合菌病(毛霉菌病)。
另一方面，本发明提供了对微生物的粘附有抗性的可延展聚合物的鉴定方法，所述方法包括a)将可延展聚合物与微生物在促进附着的条件下相接触，b)将至少一部分所述聚合物溶解在有机溶剂和缓冲溶液中，b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述粘附于聚合物的微生物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液中，以及c)检测所述缓冲溶液中微生物特异性的核酸的存在或不存在，其中所述缓冲溶液中不存在核酸指示对微生物的附着有抗性的聚合物。本发明设想了在体外或活生物体外部执行所述对微生物的粘附有抗性的可延展聚合物的鉴定方法。这些方法的执行可用于质量控制目的。可以使用在活生物体内可延展的任何类型的聚合物来进行前述方法。例如，所述可延展聚合物可以是口香糖、泡泡糖或胶基。此外，这些可延展聚合物可以是有机的(具有碳基)，并且因此这些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。在一种实施方式中，所述可延展聚合物是弹性体例如聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、硅酮、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
在另一种实施方式中，可以在牙科或牙周组合物、器具或装置上或其内的可延展聚合物上进行所述方法。例如，可延展聚合物可以是包含在牙髓(牙科)或牙周器械或组合物上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内嵌体、牙科外嵌体和镶盖中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科装置(例如支架或承载物)、颌面器具例如腭裂板、上颌支架和正畸矫治器上或其中。这些可延展聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、硅酮、尼龙和可生物降解聚合物例如聚丙交酯或其组合。
在前述方法中，将至少一部分所述聚合物溶解在有机溶剂例如氯仿、二甲苯或甲苯以及缓冲溶液例如在分子生物学领域中常规的并且核酸在其中稳定的任何缓冲溶液例如Tris缓冲液、TBE缓冲液(Tris-硼酸-EDTA)和TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)中。在特定实施方式中，所述缓冲溶液是包含三(羟甲基)氨基甲烷的Tris缓冲液。Tris缓冲液也被称为Tris碱、Trizma、Trisamine、THAM、氨丁三醇、氨基丁三醇和缓血酸胺。
本发明提供了对任何类型的微生物例如细菌、病毒、真菌或原生动物的粘附有抗性的可延展聚合物的鉴定方法。例如，本发明提供了其中所试验的微生物是口腔的病原细菌或共生细菌的方法，所述细菌例如变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆菌(Lactobacillussalivarius)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
本发明的另一方面提供了产生哺乳动物对象的口腔的微生物分布情况的方法，所述方法包括a)将可延展聚合物与所述对象的口腔相接触，b)在与所述对象的口腔接触后，检测粘附于或附着于所述可延展聚合物的至少一种微生物的存在和不存在，其中至少一种微生物的存在或不存在决定所述对象的口腔的微生物分布情况。所述微生物分布情况可以包含关于至少一种微生物、至少两种微生物、至少5种微生物、至少10种微生物、至少20种微生物、至少50种微生物、至少100种微生物和至少500种微生物的信息。
这些方法还可以任选地包括将所述哺乳动物对象的微生物分布情况与参比微生物分布情况进行比较的步骤，其中所述参比分布情况指示口腔疾病、障碍或病症的增加的易感性，以及对所述微生物分布情况进行评分以确定所述对象是否对口腔疾病或障碍具有增加的易感性的步骤。此外，这些方法可以任选地包括对粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物进行定量的步骤。
术语“微生物分布情况”是指至少一种微生物的存在或不存在，所述微生物被至少部分鉴定或表征以便可以在任何特定样品中监测所述微生物的存在或不存在。术语“参比微生物分布情况”是指为已知的对照或标准样品产生的微生物分布情况，例如已知具有口腔疾病、障碍或病症的增加的易感性的对象的参比分布情况。
当在对象的微生物分布情况中存在参比分布情况中的一种或多种微生物时，对象的微生物分布情况与参比微生物分布情况相关。为了确定对象的微生物分布情况是否与参比微生物分布情况相关，对分布情况进行评分以将对象的微生物分布情况与参比分布情况进行比较。
产生微生物分布情况的方法可以检测细菌、病毒、真菌或原生动物中的一种或多种。例如，被检测以产生微生物分布情况的细菌包括变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、乳芽胞杆菌属(Lactobacillus)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。可以被检测以产生微生物分布情况的示例性病毒包括人类疱疹病毒(HHV)-1(也称为单纯性疱疹病毒(HSV)-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(也称为水痘-带状疱疹病毒)、HHV-4(Epstein-Barr病毒)、HHV-5(巨细胞病毒)、HHV-6、HHV-7、HHV-8、脊髓灰质炎病毒、A组柯萨奇病毒、B组柯萨奇病毒、埃可病毒和肠道病毒71(EV-71)、人乳头瘤病毒家族(HPV)例如HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-35、腮腺炎病毒、新城疫病毒、人类副流感病毒2型、4a型和4型、副粘病毒、风疹病毒、人类流感病毒A型例如H1N1和H3N3、人类流感病毒B型、人类流感病毒C型和鼻病毒。可以被检测以产生微生物分布情况的示例性真菌包括假丝酵母(Candida)例如白假丝酵母(Candidaalbicans)、曲霉(Aspergillus)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、格特隐球菌(Cryptococcusgattii)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、和接合菌(Zygomycota)。可以被检测以产生微生物分布情况的示例性原生动物包括龈内阿米巴(Entamoebagingivalis)和口腔毛滴虫(Trichomonastenax)。
此外，本发明的微生物分布情况可用于确定对象发生疾病、病症或障碍的易感性，所述疾病、病症或障碍例如慢性牙周炎、急性成人牙周炎、牙龈炎例如急性坏死溃疡性牙龈炎、樊尚咽峡炎、龋齿、疱疹病毒感染、原发性疱疹性龈口炎或口腔疱疹(唇疱疹和口溃疡)、生殖器疱疹、水痘-带状疱疹病毒感染例如水痘或带状疱疹、流感、普通感冒、性病、单核细胞增多症、柯萨奇病毒感染例如手足口病、疱疹性咽峡炎、急性淋巴结性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、风疹(德国麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛状白斑症、幼儿急疹、卡波西肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鹅口疮)、急性萎缩性(红斑性)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病、慢性萎缩性(红斑性)念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、副球孢子菌病和接合菌病(毛霉菌病)。
可以使用在活生物体内可延展的任何类型的聚合物来进行前述产生微生物分布情况的方法。例如，所述可延展聚合物可以是口香糖、泡泡糖或胶基。此外，这些可延展聚合物可以是有机的(具有碳基)，并且因此这些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。在一种实施方式中，所述可延展聚合物是弹性体例如聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、硅酮、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
在另一种实施方式中，所述产生微生物分布情况的方法可以在牙科或牙周组合物、器具或装置上或其内的可延展聚合物上进行。例如，可延展聚合物可以是包含在牙髓(牙科)或牙周器械或组合物上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内嵌体、牙科外嵌体和镶盖中使用的聚合物。此外，可延展聚合物在外科装置(例如支架或承载物)、颌面器具例如腭裂板、上颌支架和正畸矫治器上或其中。这些可延展聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、硅酮、尼龙和可生物降解聚合物例如聚丙交酯或其组合。
另一方面，本发明提供了用于执行本文中描述的任何上述方法的试剂盒。具体来说，本发明提供了用于检测或定量粘附于可以在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种特异性针对所述微生物的引物、有机溶剂和缓冲溶液。
这些试剂盒可以任选地包含有机溶剂例如氯仿、二甲苯或甲苯，和/或在分子生物学领域中常规的并且核酸在其中稳定的缓冲溶液，例如Tris缓冲液、TBE缓冲液(Tris-硼酸-EDTA)和TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA)。在特定实施方式中，所述缓冲溶液是包含三(羟甲基)氨基甲烷的Tris缓冲液。Tris缓冲液也被称为Tris碱、Trizma、Trisamine、THAM、氨丁三醇、氨基丁三醇和缓血酸胺。此外，本发明的试剂盒还可以任选地包含用于PCR扩增的缓冲液、dNTP和用于凝胶载样的缓冲液。
附图说明
图1示出了在体内随时间被捕获在口香糖中的细菌。以使用校准曲线确定的CFU(对数单位)(A)或使用qPCR获得的任意单位(B)表示的被捕获在两种不同口香糖类型中的细菌的数目，随咀嚼时间而变。误差条表示在测量两次的5位志愿者的组中的标准偏差。
具体实施方式
本发明提供了从粘附于可以在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物提取核酸的方法。“可以在活生物体内延展的”聚合物在活生物体中的温度和pH下是柔性和韧性的，但所述聚合物的组成在暴露于由所述生物体施加的不同力和条件(例如温度、pH、酶)时是稳定的。例如，本发明的方法包括对由生物体施加的力(例如牙齿或牙龈的咀嚼、研磨或咬切)、生物体中的温度(例如生物体口腔的温度)或化学条件(例如由生物体产生的酶、活生物体口腔的pH)作出响应可以延展的聚合物。这些可延展聚合物可能是有机的(具有碳基)，因此这些聚合物将溶解在本发明的方法的有机溶剂中。这样的聚合物的实例包括口香糖、泡泡糖或胶基。
在本发明的方法中使用的其他可延展聚合物包括包含在牙髓(牙科)或牙周器械、组合物或器具上或其内的牙科树脂或聚合物，例如在腔洞恢复材料例如复合材料和填料、义齿、牙桥、牙冠、根管、牙科内嵌体、牙科外嵌体、镶盖或外科装置(例如支架和承载物)、颌面器具例如腭裂板、上颌支架和正畸矫治器例如陋习(咬指甲或吮吸拇指)矫正器具、牙套、磨牙护具、安抚奶嘴、橡皮奶嘴、奶嘴、饮水喷口、磨牙环或玩具、磨牙棒或玩具和用于人类和动物的其他咀嚼装置中使用的聚合物。在食品包装物中使用的可延展聚合物也可用于本发明的方法。这些可延展聚合物包括异戊二烯、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、聚甲基丙烯酸丁酯(PBMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、古塔波胶和聚丁烯。术语“聚丁烯”包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、硅酮、尼龙和可生物降解聚合物例如聚丙交酯(PLA)或其组合。
此外，本发明提供了从粘附于聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物提取核酸的方法，在与活生物体接触后将所述聚合物溶解在有机溶剂中，例如医疗装置、牙科或牙周装置和外科装置。
本发明的方法可以在医疗装置中常用的聚合物上进行。例如，在医疗装置中常用的热塑性聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酯例如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚酯例如聚丙交酯(PLA)、聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯(PVC)、聚醚砜(PES)、聚丙烯酸酯(PMMA)、聚砜(PSU)、聚醚醚酮(PEEK)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚四氟乙烯、聚丙烯合金、均聚物和共聚物、聚甲醛或聚缩醛共聚物。热塑性聚合物包括无定形热塑性聚合物和半结晶热塑性聚合物。此外，在医疗装置中常常使用热固性聚合物，例如水凝胶(丙烯酸酯)、聚氨酯(PUR、TPU)。弹性体例如硅酮也常用于医疗装置。
本发明的方法可以在可生物降解聚合物上进行，包括天然、合成和生物合成的聚合物，例如在用于伤口闭合、组织工程支架和软组织扩张的生物可吸收缝合线、支架、别针、杆和钉中使用的可生物降解聚合物，包括聚酯例如聚乳酸(PLLA)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)。其他可生物降解的聚合物包括PHB-PHV类型的聚羟基烷酸酯、其他聚酯和天然聚合物，尤其是改性多糖例如淀粉、纤维素和壳聚糖。
口香糖
口香糖一般由水不溶性胶基、水溶性部分和调味剂组成。水溶性部分在咀嚼期间随着口香糖的一部分调味剂在一段时间内消散。胶基部分在整个咀嚼过程中保留在口中。
不溶性胶基通常包含弹性体、树脂、脂肪和油、软化剂和无机填充剂。胶基可以包括或可以不包括蜡。不溶性胶基可以占口香糖重量的约5％至约95％，更通常地，胶基占口香糖的10％至约50％，并且在某些优选实施方式中占口香糖重量的约25％至约35％。
例如，本发明的口香糖胶基含有以重量计约20％至约60％的合成弹性体、以重量计约0％至约30％的天然弹性体、以重量计约5％至约55％的弹性体增塑剂、以重量计约4％至约35％的填充剂、以重量计约5％至约35％的软化剂，以及任选少量(以重量计约1％或更少)的混杂成分例如着色剂、抗氧化剂等。
合成弹性体可以包括但不限于凝胶渗透层析(GPC)重均分子量为约10,000至约95,000的聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯比例为约1:3至约3:1的苯乙烯-丁二烯共聚物、GPC重均分子量为约2,000至约90,000的聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、月桂酸乙烯酯含量为共聚物重量的约5％至约50％的乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物及其组合。
优选的范围，对于聚异丁烯来说是50,000至80,000的GPC重均分子量；对于苯乙烯-丁二烯来说是1:1至1:3结合的苯乙烯-丁二烯；对于聚乙酸乙烯酯来说是10,000至65,000的GBC重均分子量，并且在泡泡糖胶基中通常使用更高分子量的聚乙酸乙烯酯；对于乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯来说月桂酸乙烯酯含量为10-45％。
天然弹性体可以包括天然橡胶例如烟熏或液体乳胶和银菊胶，以及天然树胶例如节路顿胶、lechicaspi、perillo、索马胶、巴拉塔树胶、巧克力铁线子胶、nispero、rosindinha、糖胶树胶、香港古塔胶及其组合。优选的合成弹性体和天然弹性体浓度随着使用胶基的口香糖是粘性还是常规的、是泡泡糖还是常规口香糖而变，正如下面讨论的。优选的天然弹性体包括节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶。
弹性体增塑剂可以包括但不限于天然松香酯例如部分氢化松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚化松香的甘油酯、松香的甘油酯、部分氢化松香的季戊四醇酯、松香的甲基酯和部分氢化的甲基酯、松香的季戊四醇酯，合成物质例如源自于α-蒎烯、β-蒎烯和/或d-柠檬烯的萜烯树脂，以及上述物质的任何适合的组合。优选的弹性体增塑剂也随着具体应用和所使用的弹性体的类型而变。
填充剂/调质剂可以包括碳酸镁和碳酸钙、碎石灰石、硅酸盐类型例如硅酸镁和硅酸铝、粘土、氧化铝、滑石、氧化钛、磷酸单钙、磷酸二钙和磷酸三钙、纤维素聚合物例如木材及其组合。
软化剂/乳化剂可以包括动物脂、氢化动物脂、氢化和部分氢化的植物油、可可脂、单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、卵磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、乙酰化的甘油单酯、脂肪酸(例如硬脂酸、棕榈酸、油酸和亚油酸)及其组合。着色剂和增白剂可以包括FD&C类型的染料和色淀，水果和植物提取物，二氧化钛及其组合。胶基可以包含或可以不包含蜡。
除了水不溶性胶基部分之外，典型的口香糖组合物包括水溶性增量部分和一种或多种调味剂。水溶性部分可以包括增量甜味剂、高强度甜味剂、调味剂、软化剂、乳化剂、着色剂、酸化剂、填充剂、抗氧化剂和提供所需属性的其他组分。
向口香糖添加软化剂是为了优化口香糖的咀嚼性能和口感。软化剂，也被称为增塑剂和塑化剂，一般占口香糖重量的约0.5％至约15％。软化剂可以包括甘油、卵磷脂及其组合。水性甜味剂溶液例如含有山梨糖醇、氢化淀粉水解物、玉米糖浆及其组合的那些水性甜味剂溶液，也可以在口香糖中用作软化剂和粘合剂。
增量甜味剂包括糖和无糖组分两者。增量甜味剂一般占口香糖重量的约5％至约95％，更通常为口香糖重量的约20％至约80％，更通常为口香糖重量的约30％至约60％。糖类甜味剂一般包括在口香糖技术领域中公知的含糖组分，包括但不限于单独或组合的蔗糖、右旋糖、麦芽糖、糊精、干粉转化糖、果糖、左旋糖、半乳糖、玉米糖浆固形物等。无糖甜味剂包括但不限于糖醇例如单独或组合的山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、氢化淀粉水解物、麦芽糖醇等。
高强度甜味剂也可以单独或与上述物质组合使用。优选的甜味剂包括但不限于单独或组合的三氯蔗糖、阿斯巴甜、安赛蜜的盐、阿力甜、糖精及其盐、环拉酸及其盐、甘草酸盐、二氢查尔酮、奇异果甜蛋白、罗汉果、应乐果甜蛋白、甜叶菊及其糖苷等。为了提供更持久的甜味和香味感受，可能希望包封或以其他方式控制至少一部分人造甜味剂的释放。诸如湿法成粒、蜡法成粒、喷雾干燥、喷雾激冷、流化床包衣、凝聚和纤维延伸的技术可用于获得所需的释放特征。
糖和/或无糖甜味剂的组合可用于口香糖中。此外，软化剂也可以提供额外的甜味，例如使用水性糖或糖醇溶液。
有机溶剂
本发明的方法包括将可延展聚合物溶解在有机溶剂中。溶剂是能够溶解或分散一种或多种其他物质的物质。有机溶剂是碳基溶剂(即它们在分子结构中含有碳)。可以在本发明的方法中使用的示例性的有机溶剂包括氯仿、二甲苯、甲苯、1,2-二氯苯、己烷、四氢呋喃、二氯甲烷或丙酮。
缓冲液
术语“缓冲溶液”是指由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物构成并且被用于使溶液的pH保持几乎恒定的水性溶液。在本发明的方法中使用的缓冲溶液是中性或微碱性的，并保持核酸稳定。在本发明的任一方法中使用的示例性缓冲液示出在表1中。
表1–常用生物缓冲液
术语“Tris缓冲液”是指包含三(羟甲基)氨基甲烷的缓冲溶液。Tris缓冲液也被称为Tris碱、Trizma、Trisamine、THAM、氨丁三醇、氨基丁三醇和缓血酸胺。
也可以使用包含Tris的缓冲溶液例如TAE缓冲液(Tris-乙酸-EDTA，其是含有Tris碱、乙酸和EDTA的溶液)或TBE缓冲液(Tris-硼酸-EDTA，其含有Tris碱、硼酸和EDTA)来进行本发明的方法。
或者，可以使用硼酸锂缓冲液(LB)(其是含有单水氢氧化锂和硼酸的溶液)或硼酸钠缓冲液(SB)来进行本发明的方法。
核酸
术语“核酸”、“核酸序列”或“核酸分子”是指DNA或RNA序列。该术语涵盖了由已知的DNA和RNA的任何碱基类似物形成的分子，所述碱基类似物例如但不限于4-4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、氮丙啶基-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷、5'-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
本发明的方法可以检测和/或定量天然存在的或“天然”核酸或非天然存在的、非天然的人造、合成的或人造核酸。术语“天然存在的”或“天然的”当与生物材料例如核酸分子、多肽、宿主细胞等联合使用时，是指在自然界中存在并且没有被人为操作的材料。类似地，“非天然存在的”或“非天然的”当在本文中使用时，是指在自然界中不存在的或已被人类在结构上修改或合成的材料。
术语“提取的核酸”是指(1)当从来源细胞分离总DNA时，已与至少约50％的天然存在的蛋白质、脂类、糖类或其他材料分离开，并且(2)不与所述“提取的核酸”在自然界中连接的多核苷酸的全部或一部分相连的核酸。优选地，本发明的分离或提取的核酸分子基本上不含在其天然环境中存在的任何其他污染的核酸分子或其他污染物。
扩增核酸的方法
本发明的方法包括对从粘附于聚合物或俘获在聚合物中的微生物提取的核酸进行扩增。术语“扩增方法”是指通过片段的复制增加核酸序列的特定片段的拷贝数的任何方法。通常使用热循环仪来进行这些方法。
聚合酶链反应(PCR)是最常用的核酸扩增方法，其使用至少两种引物和DNA聚合酶。实时PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是一种扩增和定量核酸的非常灵敏的方法。实时PCR检测反应过程中核酸扩增的产物，并且对于确定初始靶的拷贝数来说通常被认为比终点PCR更准确。
其他核酸扩增方法包括使用链置换DNA聚合酶的链置换(SDA)，等温扩增方法例如解旋酶依赖性扩增(HDA)和等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增(RT-tHDA)，可以合成环状核酸的多个拷贝的作为单向核酸复制的滚环扩增(RCA)，使用单一温度温育进行扩增的环介导等温扩增(LAMP)，作为使用热稳定DNA连接酶和热稳定DNA聚合物来扩增靶核酸的核酸扩增方法的连接酶链反应(LCA)，作为扩增RNA和体外转录的一步等温方法的基于核酸序列的扩增(NASBA)。可以使用本领域中标准的技术来进行这些方法。本发明还设想了使用序列分析来验证使用PCR扩增的DNA片段的同一性。
在本发明的方法中，可以使用“PCR反应混合物”来进行PCR，它是适用于执行PCR的混合物。PCR反应混合物含有适量的热稳定DNA聚合酶；待扩增的线性或环状的模板DNA、优选为双链DNA；一对寡核苷酸引物，使得一条引物被构造成退火到模板的一条链，另一条引物被构造成退火到模板的另一条或互补链；ATP；适量的各个四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)；以及缓冲液、盐例如MgCl2、防腐剂、还原剂和可能需要的水。
可以对寡核苷酸引物进行设计以特异性扩增对目标基因或鉴定特定微生物的基因来说特异的核酸。在设计寡核苷酸引物时，引物的长度取决于它的(A+T)含量和它的配偶体的Tm。此外，引物应该足够复杂，以降低引物退火到所选靶之外的其他序列的可能性。本发明的方法可以利用长度在10-30个核苷酸范围内的引物；优选地，引物长度为17个核苷酸。一般来说，对引物推荐40％-60％的G+C含量，以避免内部二级结构和任一种碱基的长区段。此外，引物不应退火到具有比引物更高的熔点的二级结构区域(靶内)。
寡核苷酸引物可以是扩增在所有类型的特定微生物中存在的核酸序列的通用引物，例如对任何类型的细菌、真菌、病毒或原生动物特异的通用引物，例如用于细菌核糖体16SrRNA基因的引物。例如，通用引物可以特异性针对特定类型的细菌，例如特异性针对厌氧细菌的通用引物、特异性针对好氧细菌的通用引物、特异性针对革兰氏阴性细菌的通用引物或特异性针对革兰氏阳性微生物的通用引物。此外，通用引物可以特异性针对微生物的特定属，例如扩增链球菌特异性的核酸序列的通用引物，或者通用引物可以特异性针对微生物的特定种，例如扩增变异链球菌(Streptococcusmutans)特异性的核酸序列的通用引物，通用引物可以特异性针对微生物的特定株，例如扩增变异链球菌(Streptococcusmutans)MT8148特异性的核酸序列的通用引物。
脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)包括2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)、2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(dCTP)、2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸(dGTP)和2′-脱氧胸苷-5′-三磷酸(dTTP)。一般来说，PCR反应中dNTP的浓度为约200μM。重要的是保持4种dNTP的浓度高于每种dNTP的估算Km(10μM-15μM)，并为最佳碱基掺入进行平衡。等摩尔浓度地降低dNTP和镁离子的浓度可以提高保真度。也可以使用修饰的dNTP(dig-11-dUTP、5-溴-dUTP、次黄苷、生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP和7-去氮杂dGTP)和2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸(dUTP)。
此外，除了PCR和其他扩增方法之外，可以使用任何常规测定法对提取的核酸进行分析，以鉴定特定序列的来源或存在/表达。这些测定法可以代替扩增方法或与扩增方法相组合来进行。示例性的测定法包括常规和脉冲场Southern印迹、Northern印迹、变性梯度凝胶电泳、斑点印迹杂交、条形印迹杂交、微阵列、外切核酸酶活性、荧光原位杂交(FISH)或通过阻遏蛋白结合进行的原位定位。
微生物
本发明提供了检测粘附于在活生物体内可延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的检测方法。此外，本发明提供了确定来自于活生物体的唾液样品的微生物分布情况的方法。唾液样品的微生物分布情况可用于确定生物体发生龋齿或牙周疾病的易感性或风险，不论所述微生物目前是否引起感染。此外，本发明的方法可用于质量控制方法，以确定聚合物对微生物的附着或俘获易感还是有抗性。
“微生物”是指微小的生物体，其可以是单细胞或多细胞生物体，并且对宿主生物体来说可以是病原性或共生的。本发明提供了粘附于可以在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的检测和定量方法，并且这些微生物包括细菌、病毒、真菌和原生动物。
细菌可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌以及厌氧或好氧细菌。本发明特别设想了检测口腔细菌例如共生口腔细菌和病原口腔细菌例如链球菌(streptococci)、乳芽胞杆菌(lactobacilli)、葡萄球菌(staphylococci)、棒状杆菌(corynebacteria)、放线菌(actinomcyessp.)、梭形杆菌(fusobacteriumsp.)和各种不同厌氧菌、尤其是拟杆菌(bacteroides)的方法。示例性的口腔细菌包括变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆菌(Lactobacillussalivarius)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
病毒可以是疱疹病毒科的成员例如人类疱疹病毒(HHV)，包括HHV-1(也称为单纯性疱疹病毒(HSV)-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(也称为水痘-带状疱疹病毒)、HHV-4(Epstein-Barr病毒)、HHV-5(巨细胞病毒)、HHV-6、HHV-7和HHV-8。
病毒可以是小核糖核酸病毒科(肠病毒属)的成员，例如脊髓灰质炎病毒、A组柯萨奇病毒、B组柯萨奇病毒、埃可病毒。具体来说，病毒可以是引起手足口病的病毒例如柯萨奇病毒A16、A5、A7、A10、B2和B5，引起疱疹性咽峡炎的病毒例如柯萨奇病毒A1-6、A8、A10和A22以及肠病毒71(EV-71)。
病毒可以是乳多空病毒科的成员例如人乳头瘤病毒家族(HPV)，包括HPV-16、HPV-18、HPV-33和HPV-35。病毒可以是副粘病毒科(腮腺炎病毒属)的成员例如腮腺炎病毒、新城疫病毒、人类副流感病毒2型、4a型和4b型。病毒可以是副粘病毒科(麻疹病毒属)的成员。此外，病毒可以是披膜病毒科(风疹病毒属)的成员。病毒也可以是犬口腔乳头瘤病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒。
病毒还可以是流感病毒例如人类流感病毒A型如H1N1和H3N3、人类流感病毒B型和人类流感病毒C型。病毒可以是引起普通感冒的病毒例如鼻病毒。
已知某些疱疹病毒(单纯性疱疹病毒和引起水痘和带状疱疹的水痘-带状疱疹病毒)是牙龈炎的病因。其他疱疹病毒(巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒)也可能在某些类型的牙周疾病、包括侵袭性和严重慢性牙周疾病的发作或发展中发挥作用。所有疱疹病毒经历活动期，然后是潜伏期以及可能的重新激活。这些病毒可能以不同方式引起牙周疾病，包括释放组织破坏性细胞因子、牙周细菌的过度生长、抑制免疫因子和引发引起细胞死亡的其他疾病过程。
本发明的方法可以检测真菌例如假丝酵母如白假丝酵母(Candidaalbicans)、曲霉(Aspergillus)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、格特隐球菌(Cryptococcusgattii)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidiodesimmites)和接合菌(Zygomycota)。
本发明的方法可以检测原生动物，例如龈内阿米巴(Entamoebagingivalis)和口腔毛滴虫(Trichomonastenax)。
本发明设想了检测引起口腔疾病和障碍或与其相关的微生物，所述口腔疾病和障碍例如牙周疾病(牙龈组织的炎症或感染)例如慢性牙周炎和急性成人牙周炎、牙龈炎例如急性坏死溃疡性牙龈炎、樊尚咽峡炎、龋齿、疱疹病毒感染、原发性疱疹性龈口炎或口腔疱疹(唇疱疹和口溃疡)、生殖器疱疹、水痘-带状疱疹病毒感染例如水痘或带状疱疹、流感、普通感冒、性病、单核细胞增多症、柯萨奇病毒感染例如手足口病、疱疹性咽峡炎、急性淋巴结性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、风疹(德国麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛状白斑症、幼儿急疹、卡波西肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鹅口疮)、急性萎缩性(红斑性)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病、和慢性萎缩性(红斑性)念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、组织胞浆菌病(也称为Cave病、达林氏病(Darling'sdisease)、俄亥俄山谷病、网状内皮增殖病、Spelunker肺病和Caver病)、芽生菌病(也称为北美芽生菌病、芽生菌性皮炎和Gilchrist病)、副球孢子菌病(也称为巴西芽生菌病、南美芽生菌病、Lutz-Splendore-deAlmeida病和副球孢子菌肉芽肿)、毛霉菌病(由毛霉引起)、藻菌病(由藻菌引起)和蛙粪霉菌病(由蛙粪霉菌引起)和接合菌病(毛霉菌病)。本发明还提供了由粘附于可以在活生物体内延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的存在引起或与所述微生物的存在相关的任何病症、疾病或障碍的诊断方法。
哺乳动物细胞
本发明的任一方法也可用于检测粘附于聚合物或俘获在聚合物中的来自于哺乳动物细胞的核酸，所述哺乳动物细胞例如人类细胞、犬类细胞、猫类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、牛类细胞、马类细胞、绵羊细胞、山羊细胞、灵长类细胞、来自于水生哺乳动物例如鲸和海豚的细胞以及来自于其他外来哺乳动物的细胞。可以检测的哺乳动物细胞包括上皮细胞、鳞状细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、成牙质细胞、成釉细胞、味蕾内的细胞例如感觉细胞、支架(或支柱)细胞、干细胞、基底细胞、唾液腺内的细胞例如浆液细胞和粘液细胞。
此外，所述细胞可以是癌细胞，其例如来自于在舌、口、唇、咽、扁桃体或牙龈上发生的肿瘤例如口腔鳞状细胞癌、唾液腺腺癌、粘液表皮样癌、腺样囊性癌、肉瘤(从骨骼、软骨、脂肪、纤维组织或肌肉产生的肿瘤)、淋巴瘤或黑素瘤。所述细胞可以是来自于患有癌前期病变例如粘膜白斑病或粘膜红斑病的对象的癌前细胞。
试剂盒
本发明还提供了执行本发明的方法的试剂盒。具体来说，本发明提供的试剂盒包含按照本发明的任一方法对来自于粘附于聚合物或俘获在聚合物中的细胞或微生物的核酸进行检测和/或定量的组分。所述试剂盒包含用于扩增目标微生物、哺乳动物细胞例如人类细胞或癌细胞特异性的核酸片段的寡核苷酸引物。所述试剂盒还可以包含用于扩增核酸的通用正向和/或反向引物。所述试剂盒还可以包含执行本发明的方法的说明书。
本发明的试剂盒还可以包含执行PCR或其他扩增方法所必需的组分。例如，试剂盒可以含有下列一种或多种物质：Taq聚合酶或另一种热稳定聚合酶，ATP，适量的各个四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，以及缓冲液、盐例如MgCl2、防腐剂、还原剂或水。
试剂盒还可以包含执行检测测定法所必需的任何组分例如有机溶剂和缓冲溶液，如氯仿和/或Tris缓冲液。试剂盒可以包含缓冲液、载样染料、凝胶、分子量标志物、膜、滤器、阻断缓冲液和用于Northern印迹分析、Southern印迹分析、条状印迹分析或原位杂交分析以及本领域中常用的任何其他方法的检测试剂。
在考虑了下面的说明性实施例后，本发明的其他方面和优点将被理解。
实施例
实施例1描述了粘附于手指揉搓的口香糖的细菌的定量，实施例2描述了在体内粘附于口香糖的细菌的定量，实施例3描述了定量在体内粘附于口香糖的细菌的其他实验。
实施例1
在体内粘附于口香糖或俘获在口香糖中的细菌的定量
进行了进一步研究以证实口香糖可以从口腔除去细菌，并且可以提取细菌的核酸。
5位健康人类志愿者(1位男性，4位女性，年龄为27至56岁)给出了他们参加本研究的书面知情同意书。本研究的包含判据是每位志愿者健康状况良好，并且他们的恒牙具有至少16种天然元素。排除判据是在研究之前的一个月内使用抗生素或漱口液。此外，志愿者在研究期间不使用抗生素、漱口液和其他口香糖类型。所述实验进行一式两份。
接下来，要求志愿者将两种不同的口香糖类型咀嚼最多10分钟的不同量的时间，并根据使用咀嚼过的口香糖片的超声处理获得的CFU，和根据使用从溶解在氯仿中的咀嚼过的口香糖片分离的细菌DNA的qPCR获得的任意单位，来确定咀嚼过的口香糖中的细菌数目。使用两种方法确定细菌数目，产生了在咀嚼后短时间内掺入的细菌量的初始峰。随着咀嚼时间增加直至10分钟，细菌掺入量减少(图1)。
在不同天，要求志愿者咀嚼1.5g每种类型的口香糖0.5、1、3、5或10分钟。咀嚼时间被随机分派并且在一天中的相同时间点进行。在咀嚼后，将口香糖吐在含有10ml无菌水的聚苯乙烯杯中，然后将咀嚼过的口香糖置于特氟龙模具中，按照实施例1中对手指揉搓的口香糖的描述进行超声处理。将得到的悬液铺于血琼脂板(2号血琼脂基料40g/L，氯高铁血红素5mg/L，甲萘醌1mg/L，绵羊血50ml/L)上，并在37℃和厌氧条件(5-10％H2，10％CO2，80％N2)下温育7天(Concept400厌氧工作站，RuskinnTechnologyLtd.，Pencoed，UK)后，确定CFU的数量。
在分开的实验运行中，5位健康志愿者(4位男性，1位女性)将1.5g每种类型的口香糖咀嚼0.5、1、3、5或10分钟。同样地，将咀嚼过的口香糖吐在含有10ml无菌水的聚苯乙烯杯中，然后在无菌离心管中将它用5ml氯仿(67-66-3，FisherScientific，Waltham，USA)和3mlTE缓冲液(AM9849，-LifeTechnologiesTM，Carlsbad，USA)溶解。将管振摇至少30分钟以完全溶解口香糖。将得到的悬液离心10分钟以从水性顶层中除去大的粒子和胶基。
对于qPCR分析来说，使用由1000μlPCR-混合物(SsoFastTM Supermix，Bio-rad，Hercules，USA)、500μl无DNA的水(FisherScientific，Waltham，USA)和250μl引物混合物构成的主混合物。所述引物混合物是270μL无DNA的水和15μL的9种特定细菌菌种的验证过的正向和反向引物的溶液。引物的详细情况提供在下面的表2中。
表2
在96孔PCR板(MSP-9601，Bio-rad，Hercules，USA)中，将从水性溶液获取的2.5μL样品与17,5μL主混合物混合。然后在热循环仪(CFX96，Bio-rad，Hercules，USA)上，按照2步扩增(95.0℃10秒，55.0℃30秒)进行qPCR，进行39个循环并制作熔解曲线(65℃至95.0℃)。板包括取决于引物组的阳性对照和阴性对照：无DNA和无引物。结果表示成倍数表述并在实验内进行比较，同时将细菌计数表示成任意单位(AU)。
根据这些体内实验，取决于咀嚼时间，被捕获在口香糖中的细菌的量被估算为1x107。据估算，整个唾液带有108-109个微生物(Burt等，JournaloftheAmericanDentalAssociation127:190–196,2006)，意味着1-10％的唾液细菌可以被口香糖实际捕获并从口腔移除。
实施例2
定量在体内粘附于口香糖或俘获在口香糖中的细菌的其他实验
进行了进一步的实验以确定使口香糖被细菌饱和所必需的最少时间，并对粘附于口香糖的细菌进行定量。方法总体来说如上面实施例1中所述来进行。
要求5位对象在2周内咀嚼留兰香口香糖。只允许对象每天咀嚼一片口香糖。将咀嚼过的口香糖嚼团储存在15mL无菌falcon管中，直至进行PCR分析。这些样品被描述在下面的表3中。
表3–咀嚼时间和嚼团重量
对于分析来说，将冷冻的口香糖嚼团从冰箱取出并允许其升至室温。向含有口香糖嚼团的管加入TE缓冲液(3ml)和氯仿(5ml)。将样品混合30分钟，并且在口香糖嚼团完全溶解后，将样品以4500rpm离心10分钟。随后，取出2ml水性顶层并通过PCR进行分析。
使用SsoFast试剂盒，按照制造商的说明书，使用正向和反向通用引物进行PCR。反应如下进行：95.0℃3分钟，95.0℃10秒，55.0℃30秒，随后将下列循环重复39次：95.0℃10秒，然后熔解曲线65.0℃至95℃：增量为0.5℃5秒。
根据表3中的结果，在咀嚼1分钟后粘附于口香糖的细菌计数为约400。如图1中所示，当咀嚼时间前进到咀嚼20分钟时，粘附于口香糖的细菌的量略微降低。
本研究进一步证实，本发明的方法可以检测并定量粘附于口香糖的口腔细菌。
对于本领域技术人员来说，在考虑了目前优选的实施方式后，预期可以在本发明的实践中进行大量修改和改变。因此，对本发明的范围设置的唯一限制是在权利要求书中出现的限制。

Claims (73)

1.一种从可以在活生物体内延展的聚合物提取核酸的方法，所述方法包括：
a)将所述聚合物与i)有机溶剂和ii)缓冲溶液相接触，以及
b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述聚合物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液中。
2.权利要求1的方法，其还包括鉴定从所述聚合物提取的核酸的来源的步骤。
3.权利要求1或2的方法，其还包括对从所述聚合物提取的核酸进行定量的步骤。
4.权利要求2或3的方法，其中使用扩增方法来进行鉴定步骤或定量步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述扩增方法是聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等温扩增或基于序列的扩增。
6.权利要求2、4或5任一项的方法，其中使用聚合酶链反应来鉴定所述核酸的来源。
7.权利要求3-5任一项的方法，其中使用定量聚合酶链反应来定量所述核酸。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液、TBE或TAE。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述有机溶剂选自氯仿、二甲苯和甲苯。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述聚合物被所述有机溶剂完全溶解。
13.权利要求1-11任一项的方法，其中所述聚合物被所述有机溶剂至少部分溶解。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中从所述聚合物的内表面提取所述核酸。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中至少90％的粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物内的核酸被提取。
16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述核酸的来源是微生物。
17.权利要求16的方法，其中所述微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。
18.权利要求17的方法，其中所述细菌是变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、乳芽胞杆菌属(Lactobacillus)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotellaintermedia)、唾液乳芽胞杆菌(Lactobacillussalivarius)、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
19.权利要求17或18的方法，其中所述微生物被俘获在所述聚合物的内表面内。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述核酸的来源是哺乳动物细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述细胞是上皮细胞、鳞状细胞、成纤维细胞或角质形成细胞。
22.权利要求21的方法，其中所述细胞是癌细胞。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中所述聚合物是弹性体。
24.权利要求23的方法，其中所述弹性体是聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、硅酮、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述聚合物是口香糖或胶基。
26.权利要求24的方法，其中所述聚合物在牙科或牙周组合物、器具或装置内。
27.权利要求26的方法，其中所述聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、尼龙、可生物降解聚合物或其组合。
28.一种粘附于可以在活生物体中延展的聚合物或俘获在所述聚合物中的微生物的检测方法，所述方法包括：
a)将至少一部分所述聚合物溶解在有机溶剂和缓冲溶液中，
b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从所述微生物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液内，以及
c)使用至少一种对所述微生物特异的寡核苷酸引物扩增所述核酸。
29.权利要求28的方法，其还包括对粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物进行定量的步骤。
30.权利要求28或29的方法，其中使用聚合酶链反应、链置换、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、等温逆转录-嗜热性解旋酶依赖性扩增、滚环扩增、环介导等温扩增或基于序列的扩增来扩增所述核酸。
31.权利要求28-30任一项的方法，其中使用聚合酶链反应来扩增所述核酸。
32.权利要求28-31任一项的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液、TBE或TAE。
33.权利要求28-32任一项的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液。
34.权利要求28-33任一项的方法，其中所述有机溶剂选自氯仿、二甲苯和甲苯。
35.权利要求28-34任一项的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。
36.权利要求28-35任一项的方法，其中所述微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。
37.权利要求36的方法，其中所述细菌是变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、乳芽胞杆菌属(Lactobacillus)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
38.权利要求28-37任一项的方法，其中所述微生物被俘获在所述聚合物内。
39.权利要求28-38任一项的方法，其中所述聚合物是弹性体。
40.权利要求39的方法，其中所述弹性体是聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
41.权利要求28-40任一项的方法，其中所述聚合物是口香糖或胶基。
42.权利要求28-41任一项的方法，其中所述聚合物在牙科或牙周材料或装置内。
43.权利要求42的方法，其中所述聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯、尼龙、可生物降解聚合物或其组合。
44.权利要求28-43任一项的方法，其还包括在哺乳动物对象中诊断微生物感染的步骤，其中将所述聚合物与所述对象的口腔相接触，并且其中口腔中存在所述微生物指示微生物感染。
45.一种诊断哺乳动物口腔中的感染的体外方法，所述方法包括按照权利要求28-43任一项的方法检测微生物，其中将所述聚合物与所述哺乳动物的口腔相接触，并且其中口腔中存在所述微生物指示微生物感染。
46.一种确定哺乳动物在口腔中发生感染的易感性的体外方法，所述方法包括按照权利要求28-43任一项的方法检测微生物，其中将所述聚合物与所述哺乳动物的口腔相接触，并且其中口腔中存在所述微生物指示微生物感染的增加的易感性。
47.一种对微生物的粘附有抗性的可延展聚合物的鉴定方法，所述方法包括：
a)将可延展聚合物与微生物在促进粘附的条件下相接触，
b)将至少一部分所述聚合物溶解在有机溶剂和缓冲溶液中，
b)分离所述有机溶剂和缓冲溶液，其中从粘附于所述聚合物的微生物提取的核酸被包含在所述缓冲溶液内，以及
c)检测所述缓冲溶液中微生物特异性的核酸的存在或不存在，其中所述缓冲溶液中不存在核酸指示对微生物的附着有抗性的聚合物。
48.权利要求47的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液、TBE或TAE。
49.权利要求47或48的方法，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液。
50.权利要求47-49任一项的方法，其中所述有机溶剂选自氯仿、二甲苯和甲苯。
51.权利要求47-50任一项的方法，其中所述有机溶剂是氯仿。
52.权利要求47-51任一项的方法，其中所述微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。
53.权利要求54的方法，其中所述细菌是变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、乳芽胞杆菌属(Lactobacillus)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
54.权利要求47-53任一项的方法，其中所述聚合物是弹性体。
55.权利要求54的方法，其中所述弹性体是聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
56.权利要求47-55任一项的方法，其中所述聚合物是口香糖或胶基。
57.权利要求47-56任一项的方法，其中所述聚合物在牙科或牙周材料或装置内。
58.权利要求57的方法，其中所述聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、异丁烯或其组合。
59.一种产生哺乳动物对象的口腔的微生物分布情况的方法，所述方法包括：
a)将可延展聚合物与所述对象的口腔相接触；
b)在与所述对象的口腔相接触后，检测粘附于或附着于所述可延展聚合物的至少一种微生物的存在和不存在，
其中至少一种微生物的存在或不存在决定所述对象的口腔的微生物分布情况。
60.权利要求59的方法，其中所述方法还包括下列步骤：
c)将所述哺乳动物对象的微生物分布情况与参比微生物分布情况进行比较，其中所述参比分布情况指示口腔疾病或障碍的增加的易感性，以及
d)对所述微生物分布情况进行评分，以确定所述对象是否对口腔疾病或障碍具有增加的易感性。
61.权利要求59或60的方法，其还包括对粘附于所述聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物进行定量的步骤。
62.权利要求59-61任一项的方法，其中被检测的至少一种微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。
63.权利要求62的方法，其中所述细菌是变异链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromomasgingivalis)、中间卟啉单胞菌(Porphymomasintermedia)、福氏拟杆菌(Bacteroidesforsythus)、Tanneraellaforsythia、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、纠缠真杆菌(Eubacteriumnodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、中间型链球菌(Streptococcusintermedius)、Aggregetibacteractinomycetemcomitans、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、乳芽胞杆菌属(Lactobacillus)、啮蚀艾肯菌(Eikenellacorrodens)、牙龈二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagagingivalis)、格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、小韦荣氏球菌(Veillonellaparvula)、核粒梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)和远源链球菌(Streptococcussobrinus)。
64.权利要求59-63任一项的方法，其中所述聚合物是弹性体。
65.权利要求64的方法，其中所述弹性体是聚乙酸乙烯酯、聚丁烯、聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物、硅酮、节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和巴拉塔树胶或其组合。
66.权利要求59-65任一项的方法，其中所述聚合物是口香糖或胶基。
67.权利要求59-66任一项的方法，其中所述聚合物在牙科或牙周材料或装置内。
68.权利要求67的方法，其中所述聚合物是甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、甲基丙烯酸甘油酯(GMA)、二甲基丙烯酸三乙二醇酯(TEGDMA)、双酚A-甲基丙烯酸甘油酯(BIS-GMA)、古塔波胶和聚丁烯，包括α-丁烯、顺丁烯、β-丁烯、反β-丁烯、尼龙、异丁烯或其组合。
69.一种试剂盒，其用于执行权利要求1-68任一项的方法。
70.一种用于检测或定量粘附于可以在活生物体中延展的聚合物或俘获在所述聚合物内的微生物的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种对所述微生物特异的引物、有机溶剂和缓冲溶液。
71.权利要求70的试剂盒，其中所述缓冲溶液是Tris缓冲液。
72.权利要求70或71的试剂盒，其中所述有机溶剂是氯仿。
73.权利要求70-72任一项的试剂盒，其还包含用于PCR扩增的缓冲液、dNTP和用于凝胶载样的缓冲液。
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