CN102533735A - 一种从胶基中提取动植物基因组dna的方法 - Google Patents

一种从胶基中提取动植物基因组dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从胶基或含胶基食品中提取动植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)样品中胶基成分的溶解：将经前处理的胶基或含胶基食品，以三氯甲烷充分溶解至饱和；(3)溶解后胶基中极性成分的萃取：以CTAB提取液作为萃取剂，萃取溶解后胶基中极性成分。本方法操作简便，且能够有效从胶基或含胶基食品中提取动植物基因组DNA，以便用于PCR或相应下游实验，进行进一步的检测。

Description

一种从胶基中提取动植物基因组DNA的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从胶基或含胶基食品中提取动植物基因组DNA的方法。
背景技术
胶基食品，是一种含有水不溶性树胶、添加甜味和香味料的耐咀嚼性食品，其中以胶基糖为代表。胶基糖主要有口香糖和泡泡糖两大类。其中，胶基作为胶基糖中最基本的咀嚼物质，是胶基糖组成的重要部分，是一种无营养、不消化且不溶于水的热塑性物质，它在人体温度下可以呈现出各种适宜的咀嚼性能和成膜性能，在加热软化时具有巨大的粘着力，以葡萄糖浆作为介质，通过高效率的混合可以吸附大量的可溶性甜味料和香料等，用于承载甜味剂、香精以及任何其他想利用的物质。为了制作不同风味的泡泡糖和口香糖，常需在胶基成分中添加一定的如油脂等动植物成分。根据消费群体(如某些民族习惯)的需求，必须通过对胶基或含胶基食品中可能的动植物DNA组分进行检测以确定动植物成分的添加。而胶基不能溶于常规DNA提取试剂，故以常规的DNA提取方法不能对胶基中的动植物DNA组分进行提取以及后续的检测。迄今为止，也未见国内外有这方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简便、能够有效从胶基或含胶基食品中提取动植物基因组DNA的方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种从胶基或含胶基食品中提取动植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(A)样品前处理：将胶基或含胶基食品样品剪碎；
(B)样品中胶基成分的溶解：用三氯甲烷溶解经步骤(A)前处理后的样品，至饱和；
(C)胶基中极性成分的萃取：以CTAB提取液作为萃取剂，萃取经步骤(B)溶解后的胶基中的极性成分；
(D)提取样品中的DNA。
作为本发明的一种优选实施方式，在步骤(A)中，所述样品用量为10克。
作为本发明的一种优选实施方式，在步骤(B)中，用于溶解样品的三氯甲烷用量为15～20ml。
作为本发明的一种优选实施方式，在所述步骤(C)中，用于萃取的CTAB提取液的体积为15～20ml。
作为本发明的一种优选实施方式，在步骤(C)中，用等体积CTAB提取液连续两次萃取经步骤(B)溶解后胶基中的极性成分。
进一步，在所述步骤(C)中，加入15～20ml CTAB提取液至经步骤(B)溶解后的胶基中，充分震荡混匀，940×g室温离心5分钟.，取上层转移至另一50ml离心管。再次重复该操作。
作为本发明的一种优选实施方式，在所述步骤(D)中，提取样品中DNA的具体步骤如下：
(a)取离心后的上层清液，65℃水浴15分钟，加入RNA酶，37℃水浴15分钟；
(b)加入等体积酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀后11000×g室温离心10分钟，小心取出上层清液，移至另一离心管，离心后，两相界面浑浊，加入等体积酚/氯仿/异戊醇至上层清液中，震荡混匀后，11000×g室温离心10分钟；
(c)加入核酸共沉淀剂混匀后，按1/10体积加入3MNaAc并混匀，加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃静置30～40分钟，28000×g 4℃离心10分钟，弃上清；
(d)向沉淀中加入600μl-20℃预冷的75％乙醇，快速混匀，28000×g 4℃离心5分钟，弃上清；
(e)将所得沉淀干燥15分钟，然后溶解沉淀。
进一步，所述步骤(e)中用50μl双蒸水溶解沉淀。
进一步，所述步骤(e)中用50μlTE缓冲液溶解沉淀。
与现有技术相比，本发明使用三氯甲烷溶解胶基，使其能够有效溶解，提取胶基或含胶基食品中的动植物DNA，有利于后续程序中采用生物工程技术手段，对所提取的胶基或含胶基食品中的动植物DNA成分进行检测，从而保证食品安全和环境保护。
附图说明
图1是A组胶基中猪源性成分实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)。图中，S1：A组胶基，P：猪肉作为阳性参比，N：大豆作为阴性参比，B：提取空白，TE：试剂空白。
图2是B组香口胶中猪源性成分实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)。图中，S2：B组香口胶，P：猪肉作为阳性参比，N：大豆作为阴性参比，B：提取空白，TE：试剂空白。
图3是C组胶基中高等植物内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)。图中，S1：C组胶基，P：大豆作为阳性参比，N：猪肉作为阴性参比，B：提取空白，TE：试剂空白。
图4是D组香口胶中高等植物内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)。图中，S2：D组香口胶，P：大豆作为阳性参比，N：猪肉作为阴性参比，B：提取空白，TE：试剂空白。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。
以下实施例中，所采用的胶基和香口胶均为普通市售样品，可通过商业渠道购买获得。所采用的实验试剂也均为本领域常规试剂。
实施例1 胶基和香口胶样品中动物源性基因组DNA的提取
选取两种不同的胶基样品和香口胶样品，依次作为A组、B组，分别按照以下具体步骤对其中的动物源性基因组DNA进行提取：
1.样品前处理
称取10克A组胶基(或B组香口胶)样品，尽可能地剪碎或粉碎，待用。
2.样品中胶基成分的溶解
取50ml离心管一支，加入三氯甲烷约15ml，加入经剪碎或粉碎的A组胶基(或B组香口胶)样品，充分溶解，至达饱和为止。
3.溶解后胶基中极性成分的萃取
加入15ml CTAB核酸提取液至上述溶解后样品中，充分震荡混匀，940×g室温离心5分钟，取上层清液转移至另一50ml离心管中。再次重复以上操作。
4.样品中DNA的提取
将两次离心后的上层清液合并，65℃水浴15分钟，加入RNA酶，37℃水浴15分钟。加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液(该混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1，混合液的pH值≥7.5)，振荡混匀后11000×g室温离心10分钟，小心取出上层清液，移至另一离心管，离心后，两相界面浑浊，加入等体积以上酚/氯仿/异戊醇混合液至上层清液中，震荡混匀后11 000×g室温离心10分钟。加入核酸共沉淀剂混匀后，按所得混合液1/10体积加入3M NaAc并混匀，加入与混合液等体积的异丙醇，充分混匀，-20℃静置30～40分钟，28000×g 4℃离心10分钟，小心快速倾去上层清液，并顺势快速倒置于吸水纸上吸取多余上清。向沉淀中加入600μl-20℃预冷的75％乙醇，快速混匀，28000×g 4℃离心5分钟，小心快速倾去上清，并顺势快速倒置于吸水纸上吸取多余上清。然后将所得沉淀置于核酸真空干燥系统中干燥15分钟。加入50μl双蒸水或50μl TE缓冲液溶解沉淀。
5.DNA含量的测定
吸取上述DNA溶液，适当溶解，选择0.D.值在0.4～0.8之间读数计算DNA浓度，调整DNA浓度为100ng/μl，PCR待用。
6.动物基因组DNA的PCR检测
经上述操作所获得的DNA必须经PCR实验检测到动物基因组DNA相应的基因，方可确定提取到适用的DNA，并可进行下游实验。本方法检测动物基因组DNA采用的是猪源性成分实时荧光PCR检测试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，D320)，并按照该试剂盒说明书进行操作。根据具体情况不同，本发明也可采用其他动物源性成分(如牛、羊等等)的检测试剂盒，对胶基或含胶基食品中可能含有的动物源性成分进行检测，以确定其中所含的动物源性成分。这里仅以检测猪源性基因组DNA进行举例说明，但采用其他动物源性成分的检测试剂盒进行检测的原理是相同的，并且本领域普通技术人员能够通过本发明的方法进行实现。
根据常规实时荧光PCR要求，设定基线和阈值：
以猪肉作为阳性参比，其相应内源基因扩增结果均Ct≤40；
以大豆作为阴性参比，设计提取空白和试剂空白作为对照，提取空白、试剂空白和阴性参比相应内源基因扩增结果Ct＞40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)。
A组胶基和B组香口胶样品DNA相应内源基因扩增结果均Ct≤40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)，确定利用本方法提取到适用于PCR的DNA。
实时荧光PCR反应的具体条件如表1和表2所示：
表1 实时荧光PCR反应体系
表2 实时荧光PCR反应循环参数
Figure BDA0000137405230000051
检测结果如图1和图2所示。其中，图1是A组胶基中猪源性成分实时荧光PCR检测图谱。图中，S1为A组胶基的荧光性曲线，P为作为阳性参比的猪肉的荧光性曲线，N为作为阴性参比的大豆的荧光性曲线，B为提取空白的荧光性曲线，TE为试剂空白的荧光性曲线。图2是B组香口胶中猪源性成分实时荧光PCR检测图谱。图中，S2为B组香口胶的荧光性曲线，P是作为阳性参比的猪肉的荧光性曲线，N是作为阴性参比的大豆的荧光性曲线，B是提取空白的荧光性曲线，TE是试剂空白的荧光性曲线。由图中可见，A组胶基的荧光性曲线以及B组香口胶的荧光性曲线都与作为阳性参比的猪肉荧光性曲线相当接近，这表明，A组胶基和B组香口胶中均含有猪源性成分。可见，利用本发明的方法可检测出胶基和含胶基食品中的猪成分，说明所提取的DNA是有效的适用的DNA，而且所提DNA中含有猪成分。
实施例2 胶基和香口胶样品中植物源性基因组DNA的提取
选取两种不同的胶基样品和香口胶样品，依次作为C组、D组，分别按照以下具体步骤对其中的植物源性基因组DNA进行提取：
1.样品前处理
称取10克C组胶基(或D组香口胶)样品，尽可能地剪碎或粉碎，待用。
2.样品中胶基成分的溶解
取50ml离心管一支，加入三氯甲烷约20ml，加入经剪碎或粉碎的C组胶基(或D组香口胶)样品，充分溶解，至达饱和为止。
3.溶解后胶基中极性成分的萃取
加入约20ml CTAB核酸提取液至上述溶解后胶基中，充分震荡混匀，940×g室温离心5分钟，取上层清液转移至另一50ml离心管中。再次重复以上操作。
4.样品中DNA的提取
将两次离心后的上层清液合并，65℃水浴15分钟，加入RNA酶，37℃水浴15分钟。加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，振荡混匀后11000×g室温离心10分钟，小心取出上层清液，移至另一离心管，离心后，两相界面浑浊，加入等体积酚/氯仿/异戊醇至上层清液中，震荡混匀后11 000×g室温离心10分钟。加入核酸共沉淀剂混匀后，按1/10体积加入3M NaAc并混匀，加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃静置30～40分钟，28000×g 4℃离心10分钟，小心快速倾去上层清液，并顺势快速倒置于吸水纸上吸取多余上清。向沉淀中加入600μl-20℃预冷的75％乙醇，快速混匀，28000×g 4℃离心5分钟，小心快速倾去上清，并顺势快速倒置于吸水纸上吸取多余上清。然后将所得沉淀置于核酸真空干燥系统中干燥15分钟。加入50μl双蒸水或50μl TE缓冲液溶解沉淀。
5.DNA含量的测定
吸取上述DNA溶液，适当溶解，选择0.D.值在0.4～0.8之间读数计算DNA浓度，调整DNA浓度为100ng/μl，PCR待用。
6.植物基因组DNA的PCR检测
经上述操作所获得的DNA必须经PCR实验检测到植物基因组DNA相应的基因，方可确定提取到适用的DNA，并可进行下游实验。
本发明检测植物基因组DNA采用的是检测高等植物内源基因tRNALeu，该检测所用到的引物序列和探针序列如表3所示：
表3 高等植物内源基因实时荧光PCR检测所用引物序列和探针序列
Figure BDA0000137405230000061
实时荧光PCR反应的具体条件与实施例1相同。
根据常规实时荧光PCR要求，设定基线和阈值：
以大豆作为阳性参比，其相应内源基因扩增结果均Ct≤40；
以猪肉作为阴性参比，设计提取空白和试剂空白作为对照，提取空白、试剂空白和阴性参比相应内源基因扩增结果Ct≥40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)。
C组胶基和D组香口胶样品DNA相应内源基因扩增结果均Ct≤40或45(根据PCR时所设定的循环数而定)，确定利用本方法提取到适用于PCR的DNA。
图3是C组胶基中高等植物内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)。图中，S1：C组胶基，P：大豆作为阳性参比，N：猪肉作为阴性参比，B：提取空白，TE：试剂空白。
图4是D组香口胶中高等植物内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)。图中，S2：D组香口胶，P：大豆作为阳性参比，N：猪肉作为阴性参比，B：提取空白，TE：试剂空白。
检测结果如图3和图4所示。其中，图3是C组胶基中植物源性成分实时荧光PCR检测图谱。图中，S1为C组胶基的荧光性曲线，P为作为阳性参比的大豆的荧光性曲线，N为作为阴性参比的猪肉的荧光性曲线，B为提取空白的荧光性曲线，TE为试剂空白的荧光性曲线。图4是D组香口胶中植物源性成分实时荧光PCR检测图谱。图中，S2为D组香口胶的荧光性曲线，P是作为阳性参比的大豆的荧光性曲线，N是作为阴性参比的猪肉的荧光性曲线，B是提取空白的荧光性曲线，TE是试剂空白的荧光性曲线。由图中可见，D组胶基以及D组香口胶的荧光性曲线都与作为阳性参比的大豆荧光性曲线相当接近，表明，C组胶基和D组香口胶中均含有植物源性成分。可见，利用本发明的方法可检测出胶基和含胶基食品中的植物成分，说明所提取的DNA是有效的适用的DNA，而且所提DNA中含有植物成分。
以上为本发明以猪源性、植物源性DNA为例从胶基中提取并检测动植物DNA的方法，然而，利用本发明的方法，也可以提取并检测其他种类的动植物DNA，这取决于实际应用的具体要求，而以上所述仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种从胶基中提取动植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(A)样品前处理：将胶基或含胶基食品样品剪碎；
(B)样品中胶基成分的溶解：用三氯甲烷溶解经步骤(A)前处理后的样品，至饱和；
(C)胶基中极性成分的萃取：以CTAB提取液作为萃取剂，萃取经步骤(B)溶解后的胶基中的极性成分；
(D)提取样品中的DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(A)中，所述样品用量为10克。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(B)中，用于溶解样品的三氯甲烷用量为15～20ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(C)中，用于萃取的CTAB提取液的体积为15～20ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(C)中，用等体积CTAB提取液连续两次萃取经步骤(B)溶解后胶基中的极性成分。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(C)中，加入15～20ml CTAB提取液至经步骤(B)溶解后的胶基中，充分震荡混匀，940×g室温离心5分钟.，取上层转移至另一50ml离心管。再次重复该操作。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(D)中，提取样品中DNA的具体步骤如下：
(a)取离心后的上层清液，65℃水浴15分钟，加入RNA酶，37℃水浴15分钟；
(b)加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，该混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1，混合液的pH值≥7.5，振荡混匀后11000×g室温离心10分钟，小心取出上层清液，移至另一离心管，离心后，两相界面浑浊，加入等体积以上酚/氯仿/异戊醇混合液至上层清液中，震荡混匀后，11000×g室温离心10分钟；
(c)加入核酸共沉淀剂混匀后，按所得混合液1/10体积加入3M NaAc并混匀，加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃静置30～40分钟，28000×g 4℃离心10分钟，弃上清；
(d)向沉淀中加入600μl-20℃预冷的75％乙醇，快速混匀，28000×g 4℃离心5分钟，弃上清；
(e)将所得沉淀干燥15分钟，然后溶解沉淀。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(e)中用50μl双蒸水溶解沉淀。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(e)中用50μl TE缓冲液溶解沉淀。
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