CN103642799A - 一种分离微生物宏基因组dna与总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA和RNA分离技术领域，公开了一种分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，S1：总核酸的获取：准备细胞裂解液，利用有机溶剂将细胞裂解液中的蛋白质与脂类去除；S2：总RNA的分离：向步骤S1中的总核酸中加入氯化锂溶液，在低温静置后采用离心的方法分离出总RNA，将上清液中的宏基因组DNA转移放置；S3：宏基因组DNA的沉淀：取出步骤S2中所转移放置的上清液，利用预冷的异丙醇或乙醇将上清液中的宏基因组DNA沉淀，并在低温静置后采用离心的方法分离出宏基因组DNA；S4：宏基因组DNA与总RNA的纯化，采用乙醇洗涤纯化步骤S2和步骤S3中获得的总RNA和宏基因组DNA，采用离心的方法获得纯化后的总RNA和宏基因组DNA。本发明具有分离效果好、回收率高、成本低、操作简单的优点。
Description
技术领域
本发明涉及DNA和RNA分离技术领域，更具体的说，特别涉及一种分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法。
背景技术
目前，关于核酸同时提取的方法报道的已有很多，有针对无细胞壁的动物组织细胞(Deborah A.Triant，Andrew Whitehead.Simultaneous Extractionof High-Quality RNA and DNA from Small Tissue Samples[J].Joumal ofHeredity，2009，100(2)：246-250)，有坚韧细胞壁的植物组织(刘胜洪，刘文，刘明峰，等.一种高效提取猕猴桃DNA和RNA的方法[J].生物技术通报，2011，9：171-175)，医学材料(M.Bauer,D.Patzelt.A method for simultaneousRNA and DNA isolation from dried blood and semen stains[J].Forensic ScienceInternational[J].2003，136(1-3)：76-78.)或其他环境样品(Carla M.Zammita，Lesley A.Mutcha,v,et al.The recovery of nucleic acid from biomining and acidmine drainage microorganisms[J].Hydrometallurgy,2011，108(1-2)：87-92)。但这些报道中应用的核酸分离法多为试剂盒分离或采用核酸酶处理。
采用试剂盒分离的成本较高，且在处理量较大超过吸附柱的承载量时回收率会降低，造成损失严重；采用酶处理时，虽然可以有效除去DNA中的RNA或RNA中的DNA，但是浪费比较严重，特别针对一些提取所得核酸总量较少的难取样或取样量有限的样品，可能会导致分析所需核酸量不足而需要扩增，而扩增常常就会导致分析结果的偏差或失真。但是，目前基于分子生物学分析的技术已经深入各个领域，如分析环境样品中的生物多样性和代谢多样性，生态系统中的群落动态变化与对环境因子的响应(Xie，J.，Z.He，X.Liu,etal.GeoChip-based analysis of the functional genediversity and metabolic potential of microbial communities in acid minedrainage[J].Appl Environ Microbiol.2011.3(77)：991-999)，疾病诊断、监测和治疗，法医鉴定，生物酶的开发与生产等，相关的实验手段如：实时定量PCR技术(Han，J.S.，and C.G.Kim.Microbiological monitoring of acid minedrainage treatment systems and aquatic surroundings using real-time PCR[J].Water Sci Technol.2009.11(59)：2083-2091)、基因芯片技术(Guo，X.，H.Yin，J.Cong,et al.RubisCO gene clusters found in a metagenome microarray fromacid mine drainage[J].Appl Environ Microbiol.2013.6(79)：2019-2026)和宏基因组测序技术(Auld，R.R.，M.Myre，N.C.Mykytczuk,et al.Characterizationof the microbial acid mine drainage microbial community using culturing anddirect sequencing techniques[J].J Microbiol Methods.2013.2(93)：108-115)等。然而这些分析均需以高质量的DNA或RNA为材料，故在核酸的提取与分离过程中既要保证完整性又要保证全面性。因此，有必要提供一种分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，为分子生物学分析提供有利的技术支持，为宏基因组学或宏转录组学的分析奠定技术基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、回收率高、操作简单的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法。
为了解决以上提出的问题，本发明采用的技术方案为：
一种分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，包括以下步骤：
步骤S1：总核酸的获取，准备细胞裂解液，并利用有机溶剂将细胞裂解液中的蛋白质与脂类去除；
步骤S2：总RNA的分离，向步骤S1中的总核酸中加入氯化锂溶液，并在低温静置后采用离心的方法分离出总RNA，同时将上清液中的宏基因组DNA转移放置；
步骤S3：宏基因组DNA的沉淀，取出步骤S2中所转移放置的上清液，利用预冷的异丙醇或乙醇将上清液中的宏基因组DNA沉淀，并在低温静置后采用离心的方法分离出宏基因组DNA；
步骤S4：宏基因组DNA与总RNA的纯化，分别采用乙醇洗涤纯化步骤S2和步骤S3中获得的总RNA和宏基因组DNA，并分别采用离心的方法获得纯化后的总RNA和宏基因组DNA。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S1中的有机溶剂为氯仿和异戊醇的混合液，并且氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，所述有机溶剂的加入量与细胞裂解液的体积相等。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S1中的总核酸体积若小于100μL，则核酸样品浓度在300-400ng/μL。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S2中的氯化锂溶液为饱和溶液，并且氯化锂溶液的加入体积为总核酸溶液体积的0.25倍，而氯化锂溶液需经121℃，0.1MPa的高温高压灭菌30min。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S2中的低温静置条件具体为，首先在-20℃的温度下静置20min，然后在4℃的温度下静置6-8h。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S2和S3中的离心条件具体为，在温度为4℃(也可以为常温)，离心力为12000×g下离心20min。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S3中，所述异丙醇或乙醇的加入量为上清液体积的0.6倍，其低温静置条件具体为在-20℃的温度下静置30min，也可以为-70℃或-80℃。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S4中的洗涤用乙醇为70％稀释液，其中的无水乙醇与水体积比为7∶3。
根据本发明的一优选实施例：所述步骤S4中的离心条件为在离心力为10000×g的条件下室温离心15min。
根据本发明的一优选实施例：所述细胞裂解液为菌种样品或环境样品的细胞裂解液。
与现有技术相比，本发明的方法相对于现有技术中的试剂盒分离以及酶处理法的优点在于：1、能够实现纯菌样品或环境样品的同提核酸中大片段(大于23kb)的基因组DNA与总RNA的有效分离；2、该方法具有分离效果好、回收率高、成本低、操作简单，无容量限制的优点；3、该方法回收的DNA和RNA质量较好，纯度较高，可以满足下游的聚合酶链式反应(PCR)和逆转录PCR反应。
附图说明
图1为本发明的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法的流程图。
图2为本发明中纯茵样品的同时提取核酸分离结果示意图。
图3为本发明中环境样品的同时提取核酸分离结果示意图。
图4为本发明中分离纯化后核酸的吸收曲线图。
图5为本发明中分离所得DNA的PCR扩增示意图。
图6为本发明中分离所得RNA的逆转录PCR示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一：
本实施例中，采用的细胞裂解液为菌种样品，所采用的菌种均来自中南大学资源生物学院生物冶金教育部重点实验室菌种库中保藏的纯菌，这些细菌均分离自酸性矿坑水(pH1-3左右)，能够在较低的pH下生长，具有氧化亚铁和硫的能力，一般用于微生物湿法冶金生产中；其中，Acidithiobacillus.ferrooxidans(A.f)为嗜酸氧化亚铁硫杆菌，最适生长温度25-30℃，最适pH1.5-2，以氧化亚铁离子获取能源；Acidithilbacillus caldus(A.c)为嗜酸喜温硫杆菌，最适生长温度40-45℃，最适pH2-2.5，以还原型硫化物，单质硫为能源物质；At.albertlensis(A.t)为嗜酸中温硫杆菌，最适生长温度30℃，最适pH1.8，利用单质硫和还原型硫化物生长；Leptospirillum.ferriphilium(L.f)为嗜铁钩端螺旋菌，最适生长温度40℃，最适pH1.6，仅利用亚铁为能源物质；Ferroplasma.thermophilum(F.t)嗜热铁质古菌，最适生长温度为45℃，最适pH为1.0，该菌为化能有机营养型或化能混营养型，可以利用酵母浸出物。实验具体操作步骤如下(结合图1)：
1.60μL混合核酸中加入15μL饱和氯化锂溶液，于-20℃静置30min后于4℃静置6-8小时；
2.室温下，在离心力为12000×g的条件下离心20min沉淀总RNA，上清液转移入新的1.5mL无酶EP管；
3.在上清液中加入45tL异丙醇，于-20℃静置30min后，在室温下，在离心力为12000×g的条件下离心20min沉淀宏基因组DNA；
4.为了提高所得RNA的纯度，用DNase I进一步纯化总RNA，加入量为0.2U／μg，37℃水浴30min；
5.用1mL浓度为70％预冷乙醇洗涤宏基因组DNA与总RNA并于室温下，在离心力为10000×g的条件下离心15min后回收宏基因组DNA和总RNA；
6.室温下晾干乙醇，用TE缓冲液或ddH2O重溶。
在上述过程中，所有的移液器等需经RNase喷雾清除剂处理后，高温高压蒸汽灭菌。
下表1与表2为分别利用本方法与现有的QIAGENAll Prep DNA／RNAMini Kit(Germany)试剂盒分离所得宏基因组DNA和总RNA的质量，从这两个表可以看出，在初始量核酸一致的情况下，本方法所回收到的宏基因组DNA与总RNA均高于利用商业化试剂盒所回收到的量，其中，本发明对宏基因组DNA的回收量比试剂盒提高50-300％，本发明对总RNA的回收量比试剂盒提高10-50％，而且，本方法所回收到的核酸质量也优于试剂盒所分离得到的核酸质量。
表1利用本发明分离不同菌DNA与RNA结果
表2利用试剂盒分离不同菌DNA与RNA结果
图2为纯菌样品的同时提取核酸分离结果示意图，图中2a为为M，氯化锂分离所得A.c，A.t，L.f，F.t，A.f的DNA电泳条带；2b为M，氯化锂分离及DNaseI处理所得A.c，A.t，L.f，F.t，A.f的RNA电泳条带，从图中可以看出，采用本方法，能够成功的将同时提取到的核酸(包括DNA与RNA)分离成大片段DNA与小片段的RNA。
图4为分离纯化后核酸的吸收曲线图，从图中可以看出，所分离得到的DNA与RNA在260nm处有显著的核酸吸收峰，而在230nm处的杂质吸收峰较低，说明利用本方法分离得到的核酸具有较高的质量。
图5为分离所得DNA的PCR扩增示意图，图中条带为M，空白对照，A.f(阳性对照)，A.c，A.t，L.f，F.t，的16S rRNA基因PCR扩增结果，从图中可以看出，所分离得到的核酸能够成功的用于分子生物学操作，分离得到的DNA能够成功的进行PCR，分离得到的RNA也能够成功的用于逆转录PCR分析。
实施例二：
本实施例中，采用的细胞裂解液为环境样品，如矿区的水样品和泥样品。其具体步骤与实施例一中的步骤一致。
图3中3a为M，利用氯化锂分离铜矿水样I,II,金矿水样和泥样的DNA；3b为M，利用氯化锂分离铜矿水样I,II,金矿水样和泥样的RNA，从图中可以看出，采用本方法，能够成功的将从环境样品中同时提取到的核酸(包括DNA与RNA)分离成大片段DNA与小片段的RNA。
在试验结果上可以与实施例作如下的对比。
图6中6a条带依次为M，空白对照，A.f(1)，A.c(2)，A.t(3)以及铜矿水样II(4)，I(5)和金矿水样(6)和泥样(7)的逆转录PCR结果。6b条带依次为M，空白对照，阳性对照(A.f)，A.c(2)，A.t(3)以及铜矿样II(4)和I(5)，阿希水样(6)和泥样(7)去除基因组后的PCR结果，从图中可以看出，从环境样品中同时提取、分离得到的核酸能够成功的用于分子生物学操作，如，分离得到的DNA能够成功的进行PCR，分离得到的RNA也能够成功的用于逆转录PCR分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：总核酸的获取，准备细胞裂解液，并利用有机溶剂将细胞裂解液中的蛋白质与脂类去除；
步骤S2：总RNA的分离，向步骤S1中的总核酸中加入氯化锂溶液，并在低温静置后采用离心的方法分离出总RNA，同时将上清液中的宏基因组DNA转移放置；
步骤S3：宏基因组DNA的沉淀，取出步骤S2中所转移放置的上清液，利用预冷的异丙醇或乙醇将上清液中的宏基因组DNA沉淀，并在低温静置后采用离心的方法分离出宏基因组DNA；
步骤S4：宏基因组DNA与总RNA的纯化，分别采用乙醇洗涤纯化步骤S2和步骤S3中获得的总RNA和宏基因组DNA，并分别采用离心的方法获得纯化后的总RNA和宏基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S1中的有机溶剂为氯仿和异戊醇的混合液，并且氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，所述有机溶剂的加入量与细胞裂解液的体积相等。
3.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S1中的总核酸体积若小于100μL，则核酸样品浓度在300-400ng/μL。
4.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S2中的氯化锂溶液为饱和溶液，并且氯化锂溶液的加入体积为总核酸溶液体积的0.25倍。
5.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S2中的低温静置条件具体为，首先在-20℃的温度下静置20min，然后在4℃的温度下静置6-8h。
6.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S2和S3中的离心条件具体为，在温度为4℃，离心力为12000×g下离心20min。
7.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述异丙醇或乙醇的加入量为上清液体积的0.6倍，其低温静置条件具体为在-20℃的温度下静置30min。
8.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S4中的洗涤用乙醇为70％稀释液，其中的无水乙醇与水体积比为7∶3。
9.根据权利要求1所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述步骤S4中的离心条件为在离心力为10000×g的条件下室温离心15min。
10.根据权利要求1～9任一项所述的分离微生物宏基因组DNA与总RNA的方法，其特征在于：所述细胞裂解液为菌种样品或环境样品的细胞裂解液。
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