CN101942465A - 用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus haloduransXJU-1)乙醛脱氢酶的方法，内容包括克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段；其基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构建pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体；重组载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，分别获得表达乙醛脱氢酶aldA和aldB的BL21(DE3)工程菌；表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液。

Description

用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法 

技术领域

本发明涉及一种用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，属于生物工程领域。 

背景技术

酒精对人体有害，尤其对肝脏最为严重，同时对胃肠道、胰腺、心脏、肾脏等也会造成不同程度的损害。世界卫生组织在一份报告中提出：“酒精中毒是当今世界第一公害，其毒性可累及全身主要器官，对肝脏的影响最大。在西方国家，80％的肝硬变(liver cirrhosis)与酒精中毒有关。酒精中毒对病毒性肝炎、肝癌的发生、发展及预后都有重要影响。 

酒精在人体内的代谢主要靠体内的两种酶：一种是乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)；另一种是乙醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛，而后者则使乙醛转化为乙酸，乙酸可通过转化为乙酰辅酶A(CoA)而进入三羧酸循环，最终分解为二氧化碳和水。一般来说，人体中都存在前一种酶，而且数量基本是相等的，但缺少后一种酶的人就比较多。ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解为二氧化碳和水，而以乙醛的形式继续留在体内。目前，大量国内外的研究表明，乙醛在体内过度积累是肝损害的主要原因。因此利用上述乙醛脱氢酶的特性和功效开发有效的解酒药具有较高的应用价值和市场前景。乙醛脱氢酶可从一些动物的肝脏、胰腺等内脏进行提取，但提取过程较为复杂，成本高，不易规模化生产。 

发明内容

本发明的目的是：开发一种利用基因工程技术生产嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，发明内容如下： 

A.克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段； 

B.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体； 

C.pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌； 

D.表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液。 

本发明的各种特征如下： 

1.利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段为：克隆的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段长度分别是1521bp和1359bp。 

2.利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体方法为： 

A.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldA原始克隆的大小为1521bp，用 Nde I和HindIII酶切，其酶切反应体系如下： 

混匀后37℃酶切4h，于1％琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。 

嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldB原始克隆的大小为1359bp，用NdeI和BamH I酶切，其酶切反应体系如下： 

B.表达载体pET30b(+)的双酶切 

乙醛脱氢酶基因aldA使用的表达载体pET30b(+)大小为5.5kb，用Nde I和HindIII对pET30b(+)进行双酶切，其酶切反应体系如下： 

乙醛脱氢酶基因aldB使用的表达载体pET30b(+)大小为5.5kb，用Nde I和BamH I对pET30b(+)进行双酶切，其酶切反应体系如下： 

混匀后37℃酶切4h，1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收pET30b(+)大片段。 

C.pET30b(+)大片段分别与乙醛脱氢酶基因aldA和aldB酶切产物的连接 

分别将乙醛脱氢酶基因aldA和aldB酶切产物与pET30b(+)大片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下： 

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。 

3.利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得乙醛脱氢酶aldA和aldB的BL21(DE3)工程菌为： 

分别取经卡那霉素筛选，pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落，分别接种于含50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃下振荡培养过夜；分别取1ml培养液，按OMEGA公司的质粒DNA少量提取试剂盒说明书进行操作提取质粒；.取5μl质粒DNA，加入12μl蒸馏水、1μl缓冲液以及1μl Nde I、1μl HindIII酶混匀后置于37℃水浴中，保温2小时；同时取5μl质粒DNA，加入12μl蒸馏水、1μl缓冲液以及1μl Nde I、1μl BamH I酶混匀后置于37℃水浴中，保温2小时；将重组DNA和酶切后质粒DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源aldA和aldB基因片段，片段大小分别为1521bp和1359bp，初步确定该菌落为转化成功的工程菌；分别取卡那霉素筛选，pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落扩大培养后提取的质粒DNA送华大公司测序，进一步鉴定为该菌落为转化成功的工程菌。 

4.利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液： 

A.分别取pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB转化成功的工程菌1～2个菌落，接种到含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，于37℃，200rpmin振荡培养过夜，取200μl过夜培养物于含50μg/ml卡那霉素的200ml LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养2～3h，至A₆₀₀约为0.6～0.8时，加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃，200rpm振荡培养，诱导表达6h；取200ml经IPTG诱导表达的菌液，于4℃，5,000g离心15min，弃液体，用0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液洗涤细菌2～3次；加入细胞裂解缓冲液2ml及100ug/ml的溶菌酶50μl，于4℃搅拌20min，使细菌悬浮，然后将细菌悬液置于冰浴中超声破碎；于4℃，10,000g，离心15min，收集上清液，SDS-PAGE电泳，鉴定乙醛脱氢酶adlA和aldB的表达量和亚基分子量，检测酶活性和温度、pH、金属离子的影响，测定乙醛脱氢酶adlA和aldB的Km值；pET30b(+)-aldA转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)活性分别是1550U/L、64U/L和82U/L，钾离子为激活剂；pET30b(+)-aldB转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)活性 分别是1458U/L、0U/L和0U/L，锌离子为激活剂；aldA和aldB的酶催化反应温度在15-40℃之间无明显变化；最适pH分别是9.0-9.5和8.0；乙醛脱氢酶aaldA在钾离子的条件下活性最高，而乙醛脱氢酶aldB在锌离子存在下活性最高；乙醛脱氢酶aldA和aldB的Km值分别是1.64mmol/L和208.23mmol/L。 

本发明的优点和积极效果为：分别将嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因克隆、与pET30b(+)重组，分别构成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB表达载体、转化大肠杆菌BL21(DE3)，经卡那霉素筛选，分别获得表达乙醛脱氢酶aldA和aldB的BL21(DE3)工程菌、经发酵扩大培养，分离得到的乙醛脱氢酶粗酶aldA和aldB活性高，酶催化反应活性的pH范围分别为7.5-9.5和8.0-8.5，温度范围分别是20-45℃和37-50℃，km值分别是1.73mmol/L和广范围的pH和温度尤为适合作为解酒药的原料。 

附图说明

图1实施例2重组载体pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB结构图 

图2实施例3pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体酶切鉴定 

图中M为DNAMarker，1为经酶切后的pET30b(+)-aldA，2为未酶切的pET30b(+)-aldA；1′为经酶切后的pET30b(+)-aldB，2′为未酶切的pET30b(+)-aldB 

图3实施例4乙醛脱氢酶aldA的SDS-PAGE电泳图 

图中M：DNA marker；1，2：转化pET30b(+)-aldA的重组菌；3：pET30b(+)转化的BL21(DE3)菌；4.BL21(DE3) 

图4实施例4乙醛脱氢酶aldB的SDS-PAGE电泳图 

图中M：DNA marker；1，2：转化pET30b(+)-aldB的重组菌；3：pET30b(+)转化的BL21(DE3)菌；4.BL21(DE3 

图5实施例6温度对乙醛脱氢酶aldA和aldB的影响 

图6实施例7pH对乙醛脱氢酶aldA和aldB的影响 

图7实施例8金属离子对乙醛脱氢酶aldA和aldB的影响 

图8实施例9乙醛脱氢酶aldA的Km值 

图9实施例9乙醛脱氢酶aldB的Km值 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明： 

实施例1 

本实施例是克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段，克隆的嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片断经测序鉴定长度分别是1521bp和1359bp。 

实施例2 

本实施例是嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体的步骤如下： 

A.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldA原始克隆的大小为1521bp，用Nde I和HindIII酶切，其酶切反应体系如下： 

混匀后37℃酶切4h，于1％琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。 

嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldB原始克隆的大小为1359bp，用NdeI和BamH I酶切，其酶切反应体系如下： 

B.表达载体pET30b(+)的双酶切 

乙醛脱氢酶基因aldA使用的表达载体pET30b(+)大小为5.5kb，用Nde I和HindIII对pET30b(+)进行双酶切，其酶切反应体系如下： 

乙醛脱氢酶基因aldB使用的表达载体pET30b(+)大小为5.5kb，用Nde I和BamH I对pET30b(+)进行双酶切，其酶切反应体系如下： 

混匀后37℃酶切4h，1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收pET30b(+)大片段。 

C.pET30b(+)大片段分别与乙醛脱氢酶基因aldA和aldB酶切产物的连接。 

分别将乙醛脱氢酶基因aldA和aldB酶切产物与pET30b(+)大片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下： 

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时，构成的pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB结构如图1所示。 

实施例3 

本实施例是pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组体转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌的实验步骤如下： 

分别取经卡那霉素筛选，pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落，分别接种于含50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃下振荡培养过夜；分别取1ml培养液，按OMEGA公司的质粒DNA少量提取试剂盒说明书进行操作提取质粒；取5μl质粒DNA，加入12μl蒸馏水、1μl缓冲液以及1μl Nde I、1μl HindIII酶混匀后置于37℃水浴中，保温2小时；同时取5μl质粒DNA，加入12μl蒸馏水、1μl缓冲液以及1μl Nde I、1μl BamH I酶混匀后置于37℃水浴中，保温2小时；将重组DNA和酶切后质粒DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源aldA和aldB基因片段，鉴定结果如图2所示，基因片段大小分别为1521bp和1359bp，初步确定该菌落为转化成功的工程菌；分别取卡那霉素筛选，pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落扩大培养后提取的质粒DNA送华大公司测序，进一步鉴定为该菌落为转化成功的工程菌。 

实施例4 

本实施例是表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液的方法： 

分别取pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB转化成功的工程菌1～2个菌落，接种到含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，于37℃，200rpmin振荡培养过夜，取200μl过夜培养物于含50μg/ml卡那霉素的200ml LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养2～3h，至A600约为0.6～0.8时，加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃，200rpm振荡培养，诱导表达6h；取200ml经IPTG诱导表达的菌液，于4℃，5,000g离心15min，弃液体，用0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液洗涤细菌2～3次；加入细胞裂解缓冲液2ml及100ug/ml的溶菌酶50μl，于4℃搅拌20min，使细菌悬浮，然后将细菌悬液置于冰浴中超声破碎；于4℃，10,000g离心15min，收集上清液，电泳鉴定酶表达量，鉴定结果如图3和图4所示，工程菌在56KD分子量附近区带明显强于作为对照的BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)。 

实施例5 

本实施例是考察基因工程产物乙醛脱氢酶aldA和aldB的活性。aldA表达乙醛脱氢酶的酶活性测定体 系包括1mol/L Tris-Cl缓冲液(pH8.5)0.6mL、酶液0.2mL、5mmol/L β-NAD⁺0.4mL、1mol/L乙醛0.05mL、1mol/L KCl 0.6mL、1mol/L巯基乙醇(2-Me)0.05mL。aldB表达乙醛脱氢酶的酶活性测定体系包括1mol/LTris-Cl缓冲液(pH8.5)0.6mL、酶液0.2mL、5mmol/L β-NAD⁺0.4mL、1mol/L乙醛0.05mL、0.001mol/L醋酸锌0.6mL、1mol/L巯基乙醇(2-Me)0.05mL，将溶液混合后，在37℃范围内，进行酶促反应，恒温反应20min后，测定酶活力。 

pET30b(+)-aldA转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)的酶活性测定结果分别是1550U/L、64U/L和82U/L，钾离子为激活剂；pET30b(+)-aldB转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)活性分别是1458U/L、0U/L和0U/L，锌离子为激活剂，两种工程菌的粗酶活性明显高于作为对照的BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)。 

实施例6 

本实施例是考察温度对本发明的基因工程产物乙醛脱氢酶aldA和aldB的影响。酶活性测定体系同实施例5，在10℃-75℃范围内改变温度，进行酶促反应，恒温反应20min后，测定不同温度下的酶活力。其结果如图5所示，aldA和aldB的酶催化反应温度在15-40℃之间无明显变化。 

实施例7 

本实施例是考察pH对本发明的基因工程产物乙醛脱氢酶aldA和aldB的影响。固定反应体系温度为37℃，酶活性测定体系同实施例5。配制pH6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的Tris-Cl缓冲液，恒温反应20min后，分析不同pH值对酶活性的影响。其结果如图6所示，aldA和aldB的最适pH分别是9.0-9.5和8.0。 

实施例8 

本实施例是考察金属离子对本发明的基因工程产物乙醛脱氢酶aldA和aldB的影响。固定反应体系温度为37℃、pH8.5，酶活性测定体系同实施例5。在酶促反应体系中分别添加终浓度为0.35mol/L的KCl，MgCl₂，NaCl，MnSO4，Zn(AC)₂，分别与酶液充分混合，恒温反应20min后，测定酶活性。其结果如图7所示。乙醛脱氢酶aaldA在钾离子的条件下活性最高，而乙醛脱氢酶aldB在锌离子存在下活性最高。 

实施例9 

本实施例是考察本发明的基因工程产物乙醛脱氢酶aldA和aldB的Km值。酶活性测定体系同实施例5，测定乙醛脱氢酶在0.5mmol/L，1.3mmol/L，2.6mmol/L，6.6mmol/L，26.3mmol/L乙醛浓度下酶促反应速度V。根据利用林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，作图，由直线的横轴截距求出Km。其结果如图8和图9所示，乙醛脱氢酶aldA和aldB的Km值分别是1.64mmol/L和208.23mmol/L。 

aldA碱基序列：

1    ATGGTGTATA AACGTCCAAA TGAAGAAGGT GCTGTCGTCT CGTTTAAGAA GAGGTATGAC

61   AACTACGTGA ATGGAGAATG GACACCGCCT GTGAAAGGTC AATATTTTGA AAATGTCACT

121  CCGGTTACAG GCGAAGTCTT TTGTGAAGTC GCTCGTTCCA CAGCCGAGGA CATTGATCTA

181  GCCCTTGACG CCGCCCACGC GGCGAAAGAG CAATGGGGAA AAACGTCACC TGCTGAGCGA

241  GCAAATCTAT TAAATAAAAT AGCCGATCGG ATGGAGGAAA ACTTAGAAAA ACTCGCCGTT

301  GCGGAGACGT GGGAGAACGG GAAGCCCGTC CGTGAAACGT TAAATGCCGA CATTCCACTG

361  GCGATCGACC ATTTTCGCTA CTTTGCTGGC GCGATTCGTG CCCAAGAAGG TACGTTGAGC

421  CAAATTGACA ACGATACGGT CGCGTACCAT TTTCATGAAC CGCTTGGTGT TGTCGGTCAA

481  ATTATCCCCT GGAACTTTCC GATTTTAATG GCGACGTGGA AGCTGGCACC TGCCTTAGCT

541  GCCGGCAACT GCGTCATCTT AAAGCCTGCA GAACAGACGC CGGCTTCGAT TTTTGTCTTG

601  CTTGAATTAA TTGAAGATCT ACTGCCAAAA GGGGTTGTCA ACATTGTGAA CGGCTTCGGA

661  GTGGAAGCAG GAAAACCGCT CGCTTCCTCG AGTCGTGTCG CCAAGGTGGC ATTTACAGGG

721  GAAACGACAA CCGGCCGCTT AATCATGCAA TATGCGTCGG AAAACTTGAT TCCCGTCACA

781  CTTGAACTTG GCGGTAAATC ACCGAATATT TTCTTTGATG ACGTGATGGC AAAAGACGAC

841  GCCTTTTTAA ATAAAGCGAT CGAAGGGTTC GTCCTGTTTG CCTTGAACCA AGGAGAAGTT

901  TGCACATGCC CGTCTCGCGC CCTCATCCAA GAGTCGATCT ACGATACATT TATGGAGCGT

961  GCTTTGGCTC GGGTACAAGC GATTAAACAA GGCAATCCGC TAGATCCTAA CACGATGATT

1021 GGCGCTCAAG CCTCACAGGA GCAGCTTGAA AAAATTCTTT CGTACTTAGC CATCGGTAAG

1081 GAGGAAGGCG CCGAGGTACT CGCTGGCGGT GAACGCAATC ATTTGCCAGG TGAATTGGCG

1141 AACGGCTACT ATGTTAGTCC AACTGTGTTT AAAGGTACGA ATGATATGCG CGTCTTCCAA

1201 GAGGAAATCT TCGGGCCGGT CGTTTCTGTG ACGACGTTTA AGGATGCGGA GGAAGCATTA

1261 GCGATTGCGA ATGACACCCT TTACGGACTC GGGGCAGGTG TTTGGACGCG GGACATGAAT

1321 AAAGCCTACC GATTTGGGCG AGAGATTCAA GCGGGACGCG TATGGACGAA CTGCTATCAC

1381 GCCTACCCTG CCCACGCCGC TTTTGGAGGG TACAAAAAGT CCGGTATTGG TCGAGAAACA

1441 CACCTGATGA TGCTGAGCCA CTATCAACAA ACGAAAAATC TGCTCGTCAG CTACAGTGAA

1501 GACGCATTAG GATTTTTCTA A

 

aldB碱基序列：

1    ATGAAGGAAA AAGTTCAAAT GCAGCGGAGA TATTTTCATA CGAACGAAAC AAAAGAGCTT

61   TCATTTCGCA TGAACATGTT AAAAAAACTA AAAAAAGCGC TCCTAGACTA TGAAAACGAA

121  TTGCTTGCCG CCTTAAAAGA AGATTTAAAT AAATCGACGT CAGAGGCGTT TTTAACGGAG

181  CTTGGCCCCC TTTATCACGA GATCACGTTT ATGTTAAAGC ATTTACCGAC TTGGATGAAG

241  CGAAAAAAAG TGAAAACACC GCTGACCCAC GTTGGCTCAA AAGGGTACAT CCATTATGAG

301  CCTTATGGGG TCGTGCTCAT TATCGCCCCA TGGAACTACC CCTTGCAGCT AGCGATTAAT

361  CCGCTGATTG GTGCTATTGC AGCAGGAAAT TGTGCAATCG TGAAGCCATC TGAATTAACA

421  CCTGCTACTT CTGGCGTCAT CACCAAAATG ATCGAAAACA CATTCCCTGA AGAATACGTT

481  TGTTCAGTGG AAGGGGGAGT GGAAACGAGT CAAGCCCTTT TAGCGGAGAA GATGGACTAT

541  ATCTTTTTCA CAGGAAGTGT CGGTGTTGGG AAACATGTAA TGAAAGCTGC TTCTCGTCAT

601  TTAACGCCTG TCACTTTAGA GCTTGGTGGC AAAAGCCCAG CGATTGTGTG CGAAGACGCG

661  CAGATCGCTG TGACGGCGAA AAGAATAGCA TGGGGGAAAT TTTTGAATGC GGGACAAACG

721  TGTGTTGCCC CAGATTATGT CCTCGTACAT GACTCAAAAA AAGAGGACTT TTTAAAGGCG

781  CTGCAAACAG AAATAAAAAC GCTTTTTCAA CGTAAGATCG ACAGAGGCGA CTATCCAACG

841  ATCGTCAGTG ATCGTCATTT TGCGCGACTC ATCCGATTTT TGCAAGATGG AGATGTGGTC

901  ATCGGTGGGC AGCATGAGCG CAATAAACGG TTCATAGCCC CAACCGTTTT AACGAATGTT

961  TCATGGGAAA GTCCAGTAAT GGAGGATGAA ATATTCGGCC CTATCCTACC GGTGTTTTCC

1021 TTTTCTGAAC TAGATGAAGT GATTGAAAAA GTGCGTGAGA GGCCGCATCC CCTTGCCCTT

1081 TATCTGTTTA CTGAATCAAA GGAAACAGAG GAGAAACTAA TCCATTCTCT TTCCTTTGGT

1141 GGCGGATGTA TTAATGATAC AGTCATGCAT TTAGCAACCC CGTATTTACC GTTTGGCGGC

1201 GTTGGTGAGA GTGGAATGGG TGCATACCAT GGAGAAGAGA GCTTCTACAC GTTCTCTCAT

1261 CGGAAAAGTG TGTTAAAGCA ACCAACAAGT GTGGATCTCC CGATTCGATA CAAAGAGAGT

1321 AAGCTGTCAT TGAAAATGCT GCGCAAGCTT TTCCAATAA

Claims (5)

1.一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征包括如下步骤：

A.克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段；

B.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体；

C.pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌；

D.表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液。

2.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于克隆嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段为：克隆的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段长度分别是1521bp和1359bp。

3.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶aldA和aldB基因片段分别与pET30b(+)表达载体重组，构成pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体为：

A.嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldA原始克隆的大小为1521bp，用Nde I和HindIII酶切，其酶切反应体系如下：

混匀后37℃酶切4h，于1％琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。

嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)，其乙醛脱氢酶基因aldB原始克隆的大小为1359bp，用NdeI和BamH I酶切，其酶切反应体系如下：

B.表达载体pET30b(+)的双酶切

乙醛脱氢酶基因aldA使用的表达载体pET30b(+)大小为5.5kb，用Nde I和HindIII对pET30b(+)进行双酶切，其酶切反应体系如下：

乙醛脱氢酶基因aldB使用的表达载体pET30b(+)大小为5.5kb，用Nde I和BamH I对pET30b(+)进行双酶切，其酶切反应体系如下：

混匀后37℃酶切4h，1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收pET30b(+)大片段；

C.pET30b(+)大片段分别与乙醛脱氢酶基因aldA和aldB酶切产物的连接

分别将乙醛脱氢酶基因aldA和aldB酶切产物与pET30b(+)大片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下：

混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。

4.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经卡那霉素筛选，获得乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌为：

分别取经卡那霉素筛选，pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落，分别接种于含50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃下振荡培养过夜；分别取1ml培养液，按OMEGA公司的质粒DNA少量提取试剂盒说明书进行操作提取质粒；.取5μl质粒DNA，加入12μl蒸馏水、1μl缓冲液以及1μl Nde I、1μl HindIII酶混匀后置于37℃水浴中，保温2小时；同时取5μl质粒DNA，加入12μl蒸馏水、1μl缓冲液以及1μl Nde I、1μl BamH I酶混匀后置于37℃水浴中，保温2小时；将重组DNA和酶切后质粒DNA同时进行电泳，紫外光下检测外源aldA和aldB基因片段，片段大小分别为1521bp和1359bp，初步确定该菌落为转化成功的工程菌；分别取卡那霉素筛选，pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落扩大培养后提取的质粒DNA送华大公司测序，进一步鉴定为该菌落为转化成功的工程菌。

5.按权利要求1所述的一种利用基因工程技术生产重组嗜碱耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans XJU-1)乙醛脱氢酶的方法，其特征在于表达乙醛脱氢酶的BL21(DE3)工程菌在LB培养基培养，经种子及发酵扩大培养，从发酵液提取、分离得到乙醛脱氢酶粗酶液：

分别取pET30b(+)-aldA和pET30b(+)-aldB转化成功的工程菌1～2个菌落，接种到含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，于37℃，200rpmin振荡培养过夜，取200μl过夜培养物于含50μg/ml卡那霉素的200ml LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养2～3h，至A600约为0.6～0.8时，加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃，200rpm振荡培养，诱导表达6h；取200ml经IPTG诱导表达的菌液，于4℃，5,000g离心15min，弃液体，用0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液洗涤细菌2～3次；加入细胞裂解缓冲液2ml及100ug/ml的溶菌酶50μl，于4℃搅拌20min，使细菌悬浮，然后将细菌悬液置于冰浴中超声破碎；于4℃，10,000g离心15min，收集上清液，SDS-PAGE电泳，鉴定乙醛脱氢酶adlA和aldB的表达量和亚基分子量，检测酶活性和温度、pH、金属离子的影响，测定乙醛脱氢酶adlA和aldB的Km值；pET30b(+)-aldA转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)活性分别是1550U/L、64U/L和82U/L，钾离子为激活剂；pET30b(+)-aldB转化成功的工程菌、BL21(DE3)、转化pET30b(+)空质粒的BL21(DE3)活性分别是1458U/L、0U/L和0U/L，锌离子为激活剂；aldA和aldB的酶催化反应温度在15-40℃之间无明显变化；最适pH分别是9.0-9.5和8.0；乙醛脱氢酶aaldA在钾离子的条件下活性最高，而乙醛脱氢酶aldB在锌离子存在下活性最高；乙醛脱氢酶aldA和aldB的Km值分别是1.64mmol/L和208.23mmol/L。

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