CN108603165A - 用于改变口腔生物膜之组成的益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于改变口腔生物膜的组成，特别是用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病的特定微生物。特别地，本发明涉及用作益生菌剂的微生物，以改变来源于唾液的口腔生物膜的细菌组成，优选用于降低革兰氏阴性厌氧属的比例和/或提高好氧属或兼性厌氧属的比例。此外，本发明提供了包含微生物作为益生菌剂的经口药物组合物、口腔护理产品或者用于营养或休闲的产品，及其产生方法。

Description

用于改变口腔生物膜之组成的益生菌
本发明涉及用于改变口腔生物膜的组成，特别是用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病的特定微生物。
特别地，本发明涉及用作益生菌剂的微生物，以改变来源于牙齿之口腔生物膜的细菌组成，优选用于降低革兰氏阴性厌氧属的比例和/或提高好氧属或兼性厌氧属的比例。
此外，本发明提供了包含微生物作为益生菌剂的经口药物组合物、口腔护理产品或者用于营养或休闲的产品，及其产生方法。
牙龈的炎性病症主要由牙菌斑的形成诱发。定殖细菌借助于食物残渣以及唾液组分的存在而在牙齿表面上形成生物膜。如果在早期阶段没有充分清除的话，则牙齿表面上的斑膜导致牙石的沉积，其非常难以去除。龈缘处存在数目升高的细菌导致龈发炎，称之为龈炎。在易感性个体中，龈炎可能发展为牙周炎，其可以导致失牙。特别地，存在于革兰氏阴性细菌中的脂多糖(LPS)可以通过LPS刺激的巨噬细胞而引起非特异性免疫应答，其在受影响组织中释放前列腺素E2(prostaglandin E2，PEG2)以及例如白介素和TNF-α的促炎介质。促炎介质诱导从驻留的成纤维细胞释放更多PGE2和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)，其破坏周围组织的细胞外基质。这允许细菌更深地渗透到组织中并且促进炎性过程，而不依赖于上皮和牙根的外层，从而促使形成牙周袋。支撑牙齿的牙槽骨在进展的细菌前面收缩，导致牙齿变得不稳定，并且如果不进行治疗的话，则会失牙。
许多不同的方法已经解决了这个问题，从用于机械去除斑块和牙石的改进方法到使用具有强抗菌性能的口腔护理产品。
然而，并非口腔内存在的所有细菌都与疾病相关，并且许多甚至促进口腔健康。因此，期望建立朝向口腔菌群的健康组成的平衡，而不是非特异性地根除驻留细菌。
对细菌在口腔中的益生菌作用已经进行了一些研究，但是已经发现其随物种强烈变化，并且由于该作用可能依赖于在很大程度上不相关的效应而难以建立用于有效应用的合适参数。
在益生菌作用中，文献中已经讨论了针对疾病相关物种的一般性抗菌作用、对牙齿表面的细菌黏附的降低或预防，以及抗炎作用。
WO 2010/077795 A2涉及改善口腔健康的组合物，其包含治疗有效量的选自链球菌(streptococcus)和乳杆菌(lactobacillus)的特定菌株的有益细菌。
根据DE 20 2009 011 370 U1，公开了包含益生菌的牙齿和口腔护理产品能够预防牙周炎和龈炎，其描述了多种益生菌，包括乳杆菌、双歧杆菌(bifidobacterium)、肠球菌(enterococcus)、芽孢乳杆菌(sporolactobacillus)和链球菌。然而，未提及特定菌株，并且未进一步评价所谓的益生菌作用。
WO 2010/008879 A2提供了包含与水接触后可活化的无活性益生菌的糖食组合物。作为益生菌，公开了不同的乳杆菌和双歧杆菌菌株。WO 2010/008879 A2中提及的益生菌作用包括减轻牙龈炎症，例如通过抑制致病性细菌来减轻牙龈炎症。
EP 1 852 122 A1涉及包含脱水的可再活化微生物的牙齿和牙龈健康组合物。据解释，所述微生物可以通过由于竞争重建受影响组织的平衡来对抗毒性致病性细菌菌群。WO 2005018342也涉及竞争效应，其中益生菌能够通过竞争营养物或附着位点来抑制病原体的定植或生长。
此外，已经确定，除单纯竞争性置换之外，益生菌还可能能够与疾病相关物种形成易于冲洗出的共聚集体(co-aggregate)，从而降低口腔中疾病相关物种的载量。
在WO 00/09080中公开了使用外源性乳酸菌来预防或治疗龋齿、牙菌斑和牙周感染。提及通过与驻留微生物群特异性结合(共聚集)而进行定殖，但根据WO 00/09080的益生菌使用依赖于以下作用：不是驻留微生物群的一部分的某些乳酸菌能够直接附着到牙齿的表膜上，由此置换病原体或阻止其附着。
WO 2012/022773 A1中提到了益生菌替换病原体或形成聚集体从而干扰病原体生物膜形成的能力。WO 2012/022773 A1主要涉及包含有效量的植物乳杆菌CECT 7481(Lactobacillus plantarum CECT 7481)和短乳杆菌CECT 7480(Lactobacillus brevisCECT 7480)的用于口腔健康的益生菌组合物，其被证明具有针对某些病原体的抗菌特性。
WO 2012028759(EP 2 612 904 A2)提供了用于治疗口腔内感染性疾病的链球菌属的抗微生物细菌菌株，其基于变形链球菌(S.mutans)与益生菌菌株形成共聚集体。
WO 2012/100991公开了使用黏合剂生物体(乳酸菌)与口腔内链球菌结合，然后将其冲洗出，由此防止病原体定植和龋齿形成。根据WO 2012/100991的有效黏合剂生物体是副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的某些菌株。
总之，已经证明属于乳杆菌属和其他属的某些菌株在体外测定中对一些口腔疾病相关细菌物种具有拮抗作用[1]。这些菌株有潜能用作益生菌用于预防和治疗龋齿和牙周疾病。然而，用于证明微生物拮抗作用的测定单一地在琼脂培养基上进行，并且因此是相当人工的。这是因为口腔细菌天然形成由许多不同物种构成的生物膜，所述物种并非所有都被培养[2，3]。深度测序研究已经例如在来自个体对象的牙菌斑样品中检测到数百种物种[4-6]。虽然已经开发了一些体外口腔生物膜测定并且将其用于测试口腔护理产品，但这些测定通常使用相对简单的确定细菌接种物，产生复杂性低的生物膜[7-9]。鉴于口腔生物膜的高丰富性和多样性，可优选地使用天然多样性口腔接种物，例如唾液或牙菌斑，以更准确地代表体内生态系统。
一种先前已开发并且用于作为生物膜生长细菌的体外系统是卡尔加里生物膜装置(Calgary Biofilm device，CBD)[10]。在该系统中，使生物膜生长在从96孔板的盖子突出的钉状物上。将钉状物浸入可容易地通过将盖子转移到新的基板来更换的生长培养基中，从而使生物膜能够长期生长。最初开发CBD是为了确定细菌生物膜对用于例如医疗设备相关感染的应用的抗生素的易感性，并且因此可作为“最小生物膜清除浓度”(MinimumBiofilm Eradication Concentraion，MBEC)测定(Innovotech，Canada)商购获得。先前的工作已表明，当使用简单的确定细菌接种物时，可以获得具有可重现总活菌计数的均一生物膜[11]。此外，使用接种有健康个体的唾液作为天然接种物的CBD，已经开发了口腔微生物生物膜模型[12]。将CBD的钉状物在羟磷灰石中进行涂覆以提供与牙釉质在化学上类似的表面。使用下一代测序允许综合表征生物膜的细菌组成。生物膜显示是复杂但可重现的，因此准确地表示口腔的体内条件。
罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)益生菌菌株对来源于唾液的体外口腔生物膜的组成的作用先前已在使用羟磷灰石盘和恒定深度膜发酵罐(constant depth filmfermenter，CDFF)的研究中进行了研究[13]。与对照相比，向生长中生物膜和成熟生物膜二者引入活菌株改变生物膜的组成。这些差异在生长中生物膜中最为明显，其中检测到总厌氧菌、革兰氏阴性厌氧菌和链球菌的数目显著增加。然而，成熟生物膜的给药导致总厌氧菌和链球菌减少，但兼性和厌氧革兰氏阴性厌氧菌增加。作者还表明，罗伊乳杆菌(L.reuteri)菌株在给药停止后仍可以在成熟生物膜中持续存在。
使用CBD模型，现在首次可以单独评估大量细菌菌株的处理对复杂口腔生物膜之组成的影响并且由此允许特异性地选择对朝向牙齿表面上健康生物膜组成的平衡具有最有效有益效果的菌株。值得注意的是，已经发现，某些菌株能够降低疾病相关细菌的比例，同时提高对口腔健康有益的细菌的比例。
本发明的一个目的是提供可以用于高度有效地治疗和/或预防牙周疾病的微生物。
本发明的另一个目的是提供能够平衡来源于唾液的口腔生物膜的细菌组成以有利于对口腔健康有益的细菌的微生物。
此外，本发明的一个目的是提供将本发明微生物有效地用于口腔护理的组合物和产品。
本发明的目的通过用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病的微生物而满足，其中所述微生物是副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)。
产生本发明的广泛筛选揭示副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)影响生物膜的群落组成。在属水平上，在经副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)处理的生物膜中比例较低的许多分类群是革兰氏阴性厌氧属，包括在拟杆菌门(phylum Bacteroidete)之内的未命名属、梭杆菌(Fusobacterium)、普氏菌(Prevotella)和锥形杆菌(Pyramidobacter)。革兰氏阴性厌氧菌比例的降低有利于帮助维持牙周健康，因为在实验性龈炎的研究中这些分类群与龈炎发生有关[6，28，29]。与此相反，相对于阴性对照增加的许多属是好氧/兼性厌氧属，包括棒状杆菌(Corynebacterium)和奈瑟菌(Neisseria)，并且在牙龈健康典型的早期未成熟斑块中是常见的[6，30]。在物种水平上，在用经热弱化(attenuated)副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)处理的生物膜中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)的相对丰度显著较低。具核梭杆菌先前与龈炎有关[6，29]，并且由于其能够与早期和晚期定植物共聚集而被描述为斑块中的“桥接”生物体[31]。
菌株副干酪乳杆菌LPc-G110已经根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2013年12月23日以保藏号CCTCC M 2013691保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection，CCTCC)(武汉大学，中国武汉430072)(由润盈生物工程有限公司，中国上海市青浦区崧泽大道10666号，201700(BioGrowing Co.，Ltd.，No.10666 SongzeRd.，Qingpu Shanghai 201700，China)保藏)。
在本发明的一个优选实施方案中，上述微生物是弱化微生物或死微生物，优选经热弱化微生物。
在下面描述的研究中，已经证明根据本发明的微生物在热弱化状态下特别有效。
本研究中经热弱化菌株的活性可能是由于热处理期间生物活性分子的释放，并且这些可能对某些口腔物种具有一定特异性。
在一个方面，本发明涉及上述微生物，其用作益生菌剂以改变来源于唾液的口腔生物膜的细菌组成，优选用于降低革兰氏阴性厌氧属的比例和/或提高好氧属或兼性厌氧属的比例，优选地在每种情况下均相对于阴性对照(参加以下实施例1)。
在一个优选实施方案中，根据本发明的微生物用于降低选自拟杆菌、梭杆菌、普氏菌和锥形杆菌的一种或更多种细菌的比例，和/或用于提高棒状杆菌和/或奈瑟菌的比例，优选地在每种情况下均相对于阴性对照(参见以下实施例1)。
如上所述，根据本发明的微生物使生物膜中的微生物平衡倾向于有益微生物的积聚，同时降低有害细菌的比例。特别地，革兰氏阴性厌氧属，尤其是拟杆菌、梭杆菌、普氏菌和锥形杆菌与龈炎发生有关，并且通过根据本发明的微生物有利地降低其在口腔生物膜组成中的比例。另一方面，在牙周健康典型的早期未成熟斑块中常见的好氧属或兼性厌氧属，特别是棒状杆菌和奈瑟菌，通过根据本发明的微生物在比例上提高，由此优化有益效果。
本发明的另一方面涉及经口药物组合物、口腔护理产品或者用于营养或休闲的产品，其包含副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)，其中副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCCM 2013691)的总量足以用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病，进一步优选地，其中副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)的总量为0.01％至100％，更优选0.1％至50％，最优选1％至10％，在每种情况下均相对于组合物的总重量，和/或其中副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)的总量为1×103至1×1011个菌落形成单位(CFU)，更优选1×105至1×1010CFU。
为了提供将本发明微生物实际用于口腔护理的组合物和产品，提供了包含有效量的根据本发明的微生物的组合物。特别地，已经证明上面指定的量适合于实现本发明的效果。
此外，本发明涉及如上所述的组合物或产品，其用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病，优选用于改变来源于唾液的口腔生物膜的细菌组成。
优选地，所述组合物或产品用于降低革兰氏阴性厌氧属的比例和/或提高好氧属或兼性厌氧属的比例，在每种情况下均相对于阴性对照。
特别优选地，所述组合物或产品用于降低选自拟杆菌、梭杆菌、普氏菌和锥形杆菌的一种或更多种细菌的比例和/或用于提高棒状杆菌和/或奈瑟菌的比例，优选地在每种情况下均相对于阴性对照(参见以下实施例1)。
根据本发明的组合物还可以包含选自以下的一种或更多种组分：载体、赋形剂或其他活性成分，例如如来自以下的组的活性剂：非类固醇消炎剂、抗生素、类固醇、抗TNF-α抗体或其他通过生物技术产生的活性剂和/或物质以及镇痛剂、右泛醇、泼尼松龙、聚维酮碘化物、氯己定-双-D-葡糖酸盐、海克替啶、苄达明HCl、利多卡因、苯佐卡因、聚乙二醇月桂基醚、与氯化十六烷基吡啶(cetidyl pyridinium chloride)组合的苯佐卡因或与来自小牛血液的无蛋白质血液透析物组合的聚乙二醇月桂基醚；以及例如填充剂(例如纤维素、碳酸钙)、增塑剂或流动性改进剂(例如滑石、硬脂酸镁)、包衣(例如聚乙烯乙酸酯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)、崩解剂(例如淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮)、软化剂(例如柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯)、用于造粒的物质(乳糖、明胶)、延迟剂(例如分散体中的聚(甲基)丙烯酸甲基/乙基2-三甲基氨甲酯共聚物、乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物)、压制剂(例如微晶纤维素、乳糖)、溶剂、助悬剂或分散剂(例如水、乙醇)、乳化剂(例如鲸蜡醇、卵磷脂)、用于改进流变特性的物质(二氧化硅、藻酸钠)、用于微生物稳定化的物质(例如苯扎氯铵、山梨酸钾)、防腐剂和抗氧化剂(例如DL-α-生育酚、抗坏血酸)、用于调节pH的物质(乳酸、柠檬酸)、发泡剂或惰性气体(例如氟化氯化烃、二氧化碳)、染料(铁氧化物、钛氧化物)、用于软膏剂的基本成分(例如石蜡、蜂蜡)和文献中描述的其他成分(例如Schmidt，Christin.Wirk-und Hilfsstoffe für Rezeptur，Defektur und Groβherstellung.1999；Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart oder Bauer，Führer.Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie.8.Auflage，2006.Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart)。
根据本发明的组合物或产品也可以是经涂覆的或经包封的。
根据本发明的组合物的包封可以具有允许受控释放(例如在与水接触后受控释放)或在长时间内连续释放的优点。此外，可以保护组合物免于降解，从而改善产品的保质期。用于包封活性成分的方法是本领域公知的，并且许多包封材料以及如何根据具体要求将其应用于组合物的方法是可利用的。
此外，根据本发明的组合物或产品可以是溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、颗粒剂、散剂或胶囊剂的形式。
根据本发明的组合物或产品可以选自牙膏、牙用凝胶、牙粉、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫、漱口剂、口喷剂、牙线、口香糖和锭剂。
这样的组合物或产品可以包含研磨体系(研磨剂和/或抛光组分)，例如硅酸盐、碳酸钙、磷酸钙、氧化铝和/或羟基磷灰石；表面活性剂，例如如月桂基硫酸钠、月桂基肌氨酸钠和/或椰油酰胺基丙基甜菜碱；湿润剂，例如甘油和/或山梨醇；增稠剂，例如羧甲基纤维素、聚乙二醇、角叉胶和/或甜味剂，例如糖精；芳香剂(aroma)和用于不愉快味道印象的味道矫正剂；味道调节物质(例如肌醇磷酸；核苷酸，例如鸟苷一磷酸、腺苷一磷酸或其他物质，例如谷氨酸钠或2-苯氧基丙酸)；冷却剂，例如薄荷醇衍生物(例如L-薄荷基乳酸酯(L-mentyl lactate)、L-薄荷基烷基碳酸酯、薄荷酮缩酮)、icilin和icilin衍生物；稳定剂和活性剂，例如氟化钠、单氟磷酸钠、二氟化锡、季铵氟化物、柠檬酸锌、硫酸锌、焦磷酸锡、二氯化锡、不同焦磷酸盐的混合物、三氯生、氯化十六烷基吡啶、乳酸铝、柠檬酸钾、硝酸钾、氯化钾、氯化锶、过氧化氢、芳香物质、碳酸氢钠和/或气味校正剂。
口香糖或牙齿护理口香糖可以包含含有弹性体的口香糖基质，所述弹性体例如聚乙酸乙烯酯(PVA)、聚乙烯、(低分子或中分子)聚异丁烷(PIB)、聚丁二烯、异丁烯/异戊二烯共聚物、聚乙烯乙醚(PVE)、聚乙烯丁醚、乙烯酯与乙烯醚的共聚物、苯乙烯/丁二烯共聚物(SBR)或乙烯基弹性体，例如基于乙酸乙烯酯/月桂酸乙烯酯、乙酸乙烯酯/硬脂酸乙烯酯或乙烯/乙烯基乙酸酯的乙烯基弹性体，以及所述弹性体的混合物，如例如EP 0 242 325、US4,518,615、US 5,093,136、US 5,266,336、US 5,601,858或US 6,986,709示例性所述的。另外，口香糖基质可以含有其他成分，例如(矿物质)填充剂，例如碳酸钙、二氧化钛、二氧化硅、滑石、氧化铝、磷酸二钙、磷酸三钙、氢氧化镁及其混合物；增塑剂(例如羊毛脂、硬脂酸、硬脂酸钠、乙酸乙酯、二醋精(二乙酸甘油酯)、三醋精(三乙酸甘油酯)和柠檬酸三乙酯)；乳化剂(例如磷脂，例如卵磷脂以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯，例如单硬脂酸甘油酯)；抗氧化剂；蜡(例如石蜡、小烛蜡、巴西棕榈蜡、微晶蜡和聚乙烯蜡)；脂肪或脂肪油(例如硬化(氢化)植物脂肪或动物脂肪)和甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。
最后，本发明还涉及产生如上所述的经口药物组合物、口腔护理产品或者用于营养或休闲的产品的方法，其包括以下步骤：
-将副干酪乳杆菌LPc-G110与一种或更多种其他组分，优选与选自载体、赋形剂或其他活性成分的一种或更多种组分组合。
增加以下实施例以举例说明本发明而不是为了限制范围。
实施例1：针对对复杂体外口腔生物膜的组成的作用筛选细菌菌株
对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的许多候选益生菌菌株进行筛选。
样品收集
通过咳出到无菌通用管中从参与者获得5毫升唾液。将唾液置于冰上并在收集后一小时内用于接种。将样品以等体积合并用于接种CBD板。
卡尔加里生物膜装置的接种和生物膜的孵育
将合并的唾液涡旋15秒并向96孔微板中每孔吸移200μl，直至所需数量的孔。不使用在微板的外侧周围的孔。将具有钉状物的CBD盖装配到微板上，使得涂覆有羟磷灰石的钉状物浸入唾液中。然后，将CBD板在37℃下在空气+5％CO2中孵育18小时，在此之后将盖子转移至含有200μl预还原脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)肉汤(Fluka Analytical)生长培养基的新基板中，所述生长培养基补充有猪胃黏蛋白(1g/L)、氯化血红素(10mg/L)和维生素K(0.5mg/L)。将钉状物在空气+5％CO2中孵育14天，并且每3.5天更换生长培养基。
生物膜的处理
在生长7天后，用悬浮于BHI中1×108CFU/ml浓度的活或经热弱化益生菌菌株、阴性对照(无菌BHI)或阳性对照(0.1％v/v百里酚)每天两次地处理生物膜，进行七天。益生菌菌株的热弱化通过在80℃下将细菌悬浮液在Techne加热块中放置30分钟来进行。在孵育后，将悬浮液在冰上放置5分钟，然后在-70℃下储存直至需要。活益生菌制剂在需要之前储存在-70℃，并且在使用前通过将其在37℃下在加热块上孵育30分钟进行复苏。
处理每天在9am和5pm进行。将各益生菌制剂或对照的200微升等分试样吸移到96孔微板的合适孔中用于处理操作。各益生菌制剂处理三个钉状物的三个样品重复(总共九个钉状物)。通过将CBD的盖子转移到含有处理剂的微板将具有生物膜的钉状物浸入益生菌制剂或对照中。在振动器上在轻轻搅拌下进行暴露1分钟。然后，通过在振动器上将钉状物短暂浸入PBS中30秒来洗涤钉状物，之后将其返回到生长培养基中。
钉状物的移出和用于焦磷酸测序分析的样品的叠氮溴化丙锭处理(propidium monoazide)
在14天时，用无菌钳将具有生物膜的钉状物从盖子上折断，并通过浸入无菌PBS中洗涤三次。然后，使用无菌刮匙移出所有可见的生物膜材料并悬浮于500μl PBS中。合并来自三个钉状物的材料以产生一个样品用于分析，并且对于每个处理组处理三个样品。对每个样品进行叠氮溴化丙锭(PMA)处理，以防止来自死细胞或受损细胞的DNA和细胞外DNA进行后续PCR扩增[14]：向悬浮于PBS中的细胞加入1.25μl PMA(终浓度为50μM)并在室温下在黑暗中在偶尔摇动下孵育5分钟。然后，使样品以20cm的距离暴露于来自500W卤素灯的光5分钟，以在PMA和DNA之间形成共价连接。在暴露时间期间，将样品置于冰上以避免过度加热并偶尔摇动。在PMA处理后立即将样品用于DNA提取。
DNA提取
使用GenElute细菌DNA提取试剂盒(Sigma-Aldrich)从合并的唾液和生物膜样品中提取DNA。DNA提取按照制造商的说明并进行另外的细胞裂解步骤进行，以提高从革兰氏阳性细胞的DNA回收，其中将样品在37℃下在45mg/ml溶菌酶溶液中孵育30分钟。
16S rRNA基因的焦磷酸测序
如先前所述[6]并进行一些微小修改来使用部分16S rRNA基因的454焦磷酸测序确定生物膜和唾液的细菌组成。使用复合融合引物对每个DNA样品进行覆盖V1-V3高变区的长度为约500bp的16S rRNA基因片段的PCR扩增。融合引物包含宽范围16S rRNA基因引物27FYM[15]和519R[16]以及Roche GS-FLX Titanium系列衔接子序列(A和B)，其用于使用Lib-L乳液-PCR方法进行454-焦磷酸测序。正向引物包含先前描述的12-碱基错误校正Golay条形码。使用Extensor高保真PCR主混合物(Thermo-Scientific)以及合适的经条形码编码正向引物和反向引物进行PCR反应。PCR条件如下：在95℃下初始变性5分钟，随后是25个以下循环：95℃45s，53℃45s和72℃45s；最后72℃下延伸5分钟。然后，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书纯化PCR扩增子。使用Agilent DNA 1000试剂盒和Agilent 2100生物分析仪检测扩增子的尺寸和纯度。使用Quant-iT Picogreen荧光核酸染料(Invitrogen)通过荧光测定进行扩增子的定量。然后，将扩增子以等摩尔浓度(1×109个分子/μl)合并在一起。使用Lib-L试剂盒和Roche 454GS-FLX+Titanium系列测序仪(Department ofBiochemistry，Cambridge University，Cambridge，UK)进行样品的乳液-PCR和单向测序。
序列分析
使用“mothur”软件套件版本1.34[17]遵循mothur.org上的454标准操作程序[18]进行序列分析。如mothur实施的使用AmpliconNoise算法[19]对序列进行去噪。将长度小于400个碱基和/或具有以下之一的序列丢弃：＞2个与引物的错配，＞1个与条形码区域的错配，以及长度＞8个碱基的均聚物。对剩余的序列进行修剪以除去引物和条形码，并与SILVA16S rRNA参考比对物进行比对[20]。UChime算法[21]用于鉴定嵌合序列，然后将其从数据集中除去。使用平均邻近算法将序列以0.015的遗传距离(近似物种水平)聚类成操作分类单位(operational taxonomic unit，OTU)，并使用Bayesian分类器[22]用人口腔微生物组数据库(Human Oral Microbiome Database，HOMD)参考集(版本13)进行鉴定。
统计学分析
将每个样本的序列随机子采样至相同数目(具有最少序列数的样品的数目)用于基于OTU的统计学多样性比较。使用Good非参数覆盖估计器评价群落的采样程度[23]。使用Simpson逆多样性指数计算群落的多样性[24]。使用thetaYC计算器生成的距离矩阵比较样本/处理组的群落结构[25]。使用在R(r-project.org)中生成的非度量多维测度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)图来可视化距离矩阵。使用如在mothur中实施的分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)[26]来确定基于thetaYC距离矩阵在处理组之间是否存在统计学上显著的差异。使用“vegan”包在R中生成基于细菌属比例的热图和树状图。树状图基于如由vegan包实施的群落结构中的“Bray-Curtis”相异性指数。线性判别分析效应大小(Linear Discriminant Analysis Effect Size，LEfSe)[27]分析用于检测在阴性对照生物膜和处理组之间丰度显著不同的物种水平OTU。
结果
成功扩增的重复来自热弱化处理实验的阳性对照处理。在过滤和去除序列嵌合体后，获得总共468,261个16S rDNA序列用于分析，其中平均长度为427个碱基。物种水平OTU的平均数目在生物膜样品中检测到为213.3(±24.7)，在合并的唾液接种物中为284(±1.4)。
在非度量多维测度(NMDS)图中比较用经热弱化益生菌菌株处理的生物膜和阴性对照生物膜在大多数情况下未显示细菌群落结构的显著差异(基于群落中存在的所有OTU的相对丰度的thetaYC计算器)。然而，副干酪乳杆菌LPc-G110(L.paracasei LPc-G110)处理确实显示与阴性对照不同，这通过沿NMDS轴远离对照移位来指示。单百里酚阳性对照重复样品显示与阴性对照的相异性最大。分子方差分析(AMOVA)显示在不同处理组之间存在整体上显著的差异(P＜0.001)，但是单独处理与阴性对照之间的差异在统计学上不显著。
使用基于不同属的相对丰度的树状图和热图比较生物膜的组成支持OTU分析的发现。对于热弱化处理，三个副干酪乳杆菌LPc-G110重复中有两个与剩余的生物膜分开聚类。热图显示，这些差异主要是由于拟杆菌、梭杆菌、普氏菌和锥形杆菌的相对丰度的降低，以及棒状杆菌和奈瑟菌的增加。此外，经百里酚处理的生物膜显示与其他生物膜和阴性对照生物膜显著不同，并且主要包含棒状杆菌、奈瑟菌和链球菌属。
使用线性判别分析效应大小(LEfSe)的统计学分析显示，37个物种水平OTU的丰度在副干酪乳杆菌LPc-G110和阴性对照之间显著不同。
实施例2：益生菌锭剂或片剂(comprimate)
产生方法：
●将组分1和6在真空室干燥器中在50℃和最大10mbar的压力下干燥16小时。
●所有组分都精确称重
将组分1、2、3、4和5合并并充分混合(块A)。益生菌材料以活性为每克约105至1012个菌落形成单位(CFU)的冻干形式施加。
●随后将块A加入组分6中并充分混合5分钟。
●将粉末混合物在压片机EK0(Korsch AG，Berlin)中在15至20kN的调节压力下压制成片剂。
目标参数：
○片剂直径：20mm
○片剂重量：2.0g。
●在RT下储存在密封的铝袋中。每5个锭剂使用1g干燥剂进行除湿(通过在105℃下在真空室干燥器中储存3小时来活化)。
实施例3：粉状洁牙剂
产生方法：
●将组分7在真空室干燥器中在50℃和最大10mbar的压力下干燥16小时。
●所有组分都精确称重。
●将组分1、2、3和4合并并充分混合在一起(块A)。
●如果需要的话，将组分5和6合并并充分混合(块B)。益生菌材料以活性为每克约105至1012个菌落形成单位(CFU)的冻干形式施加。
●随后将块A和B合并并充分混合在一起。
●将混合物加入组分7中并充分混合5分钟。
●将粉末混合物制成0.5g的部分，每部分与1g干燥剂/部分(通过在105℃下在真空室干燥器中储存3小时来活化)一起在RT下储存在密封的铝袋中。
实施例4：粉状洁牙剂
产生方法：
●将组分6、9和10在真空室干燥器中在50℃和最大10mbar的压力下干燥16小时。
●所有组分都精确称重。
●将组分1、2、3、4、5和6合并并充分混合在一起(块A)。
●将组分7和8合并并充分混合在一起(块B)。益生菌材料以活性为每克约105至1012个菌落形成单位(CFU)的冻干形式施加。
●随后将块A和B合并并充分混合在一起。
●将组分9和10合并并充分混合在一起(块C)。
●将这两种混合物(块A/B和块C)合并并充分混合5分钟。
●将粉末混合物在压片机EK0(Korsch AG，Berlin)中在15至20kN的调节压力下压制成片剂。
目标参数
○片剂直径：9mm
○片剂重量：0.3g。
●在RT下储存在密封的铝袋中。每3个片剂使用1g干燥剂进行除湿(通过在105℃下在真空室干燥器中储存3小时来活化)。
实施例5：口香糖
产生方法：
●将组分2在真空室干燥器中在50℃和最大10mbar的压力下干燥16小时。
●所有组分都精确称重。
●将组分1在口香糖实验室捏合机中回火至45℃至59℃，加热捏合直至获得均匀的团块。在整个混合过程期间持续加热。
●随后加入组分2、3和4并捏合直至混合物均匀并且粉末不再可见。
●根据配方，将组分6加工到组分5中(块C)，或者加工到组分7中(块D)。益生菌材料以活性为每克约105至1012个菌落形成单位(CFU)的冻干形式施加。混合组分直至获得均匀的混悬体。
●首先，将块C加入口香糖团块中并再次捏合直至获得均匀的团块。
●最后，相应地加工块D。在添加后，必须将组合物捏合直至获得均匀的口香糖团块。
●将团块从混合器中取出，并使用压纹装置“板”通过压纹辊形成为微型棒。
●在RT下储存在密封的铝袋中。每7个口香糖使用1g干燥剂进行除湿(通过在105℃下在真空室干燥器中储存3小时来活化)。
实施例6：益生菌珠粒
产生方法：
用于沉淀藻酸盐珠粒的氯化钙浴的产生：
●由蒸馏水和氯化钙产生2％氯化钙溶液。必须注意CaCl2完全溶解。
藻酸盐溶液的产生(作为藻酸盐的替代，也可以使用果胶或结冷胶)：
●在具有搅拌器并且适合批量尺寸的反应容器中，提供水。
●打开搅拌器，并在以高水平搅拌的同时，加入相应量的藻酸盐、阿拉伯胶、小麦纤维和益生菌，以及任选所需的结冷胶。
●在搅拌的同时将混合物加热至80℃并在该温度下保持5分钟-在该步骤期间，凝胶形成组分溶解。
●然后，关闭加热并将热凝胶溶液进一步搅拌至少30分钟直至其没有结块。
●随后，在搅拌的同时将溶液通过制冷冷却至39℃至43℃。
●在另一个容器中，如果需要的话，提供芳香剂和染料并充分混合。在不使用芳香剂的情况下，将染料与甘油混合。
●当染料分散体均匀混合时，将其与藻酸盐溶液一起加入分批容器中。将混合容器用所使用藻酸盐溶液的量的约10％的水洗涤数次，并加入分散体。
●将藻酸盐分散体进一步搅拌至少5分钟。
●随后，将该批次以低速进一步搅拌至少15分钟以除去可能存在的空气。
将藻酸盐溶液滴入氯化钙溶液中以沉淀珠粒：
●将藻酸盐分散体移动至具有两个出口的可紧密密封的压力稳定反应容器中。在一个出口处，施加压缩空气。第二个出口通过管引导至滴注单元的喷嘴。
●将反应容器在加热板上回火，使得藻酸盐溶液达到约45℃的温度。用磁力搅拌器轻轻搅拌溶液。
●在向反应容器施加压力后，藻酸盐溶液被压向喷嘴，喷嘴设定为通过振荡器振荡。通过调节压力和振荡器的频率，可以调节在喷嘴尖端处产生的液滴的尺寸。
●在喷嘴尖端处形成的藻酸盐溶液液滴落入其中循环有在开始时制备的氯化钙溶液的漏斗形式的收集容器中。
●固化的藻酸盐珠粒与氯化钙溶液一起通过漏斗并收集在筛子中，收集的氯化钙溶液被泵送回在滴落单元之下的漏斗中，从而再循环。
●将珠粒在Aromatic流动床-干燥器中在80℃的供气温度下干燥，直至排气温度达到45℃。
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Claims (13)

1.用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病的微生物，其中所述微生物是副干酪乳杆菌LPc-G110(Lactobacillus paracasei LPc-G110)(CCTCC M 2013691)。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是弱化微生物或死微生物，优选经热弱化微生物。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其用作益生菌剂以改变来源于唾液的口腔生物膜的细菌组成，优选用于降低革兰氏阴性厌氧属的比例和/或提高好氧属或兼性厌氧属的比例。
4.根据权利要求3所述的微生物，其用于降低选自以下的一种或更多种细菌的比例：拟杆菌(Bacteroidete)、梭杆菌(Fusobacterium)、普氏菌(Prevotella)和锥形杆菌(Pyramidobacter)，和/或用于提高棒状杆菌(Corynebacterium)和/或奈瑟菌(Neisseria)的比例。
5.经口药物组合物、口腔护理产品或者用于营养或休闲的产品，其包含副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)，其中副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)的总量足以用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病，进一步优选地其中副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCCM 2013691)的总量为0.01％至100％，更优选0.1％至50％，最优选1％至10％，在每种情况下均相对于所述组合物的总重量，和/或其中副干酪乳杆菌LPc-G110(CCTCC M 2013691)的总量为1×103至1×1011个菌落形成单位(CFU)，更优选1×105至1×1010CFU。
6.根据权利要求5所述的组合物或产品，其用于治疗和/或预防龋齿和/或牙周疾病，优选用于改变来源于唾液的口腔生物膜的细菌组成。
7.根据权利要求6所述的组合物或产品，其用于降低革兰氏阴性厌氧属的比例和/或提高好氧属或兼性厌氧属的比例。
8.根据权利要求6或7所述的组合物或产品，其用于降低选自拟杆菌、梭杆菌、普氏菌和锥形杆菌的一种或更多种细菌的比例，和/或用于提高棒状杆菌和/或奈瑟菌的比例。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的组合物或产品，其还包含选自以下的一种或更多种组分：载体、赋形剂或其他活性成分。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物或产品，其中所述组合物或产品是经涂覆的或经包封的。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的组合物或产品，其中所述组合物或产品是溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、颗粒剂、散剂或胶囊剂的形式。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的组合物或产品，其中所述组合物或产品选自牙膏、牙用凝胶、牙粉、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫、漱口剂、口喷剂、牙线、口香糖和锭剂。
13.产生根据权利要求5至12中任一项所述的经口药物组合物、口腔护理产品或者用于营养或休闲的产品的方法，其包括以下步骤：
-将副干酪乳杆菌LPc-G110与一种或更多种其他组分，优选与选自载体、赋形剂或其他活性成分的一种或更多种组分组合。
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