KR20180108673A - 구강 바이오필름의 조성을 변화시키기 위한 프로바이오틱스 - Google Patents

구강 바이오필름의 조성을 변화시키기 위한 프로바이오틱스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구강 바이오필름의 조성을 바꾸기 위한, 특히 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 특정 미생물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 타액으로부터 유래된 구강 바이오필름의 박테리아 조성을 바꾸기 위한, 바람직하게는 그람-음성 혐기성 속 비율의 감소 및/또는 호기성 또는 통성 혐기성 속 비율의 증가를 위한 생균제로서의 미생물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 생균제로서의 미생물을 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품뿐만 아니라 이들의 제조방법을 제공한다.

Description

구강 바이오필름의 조성을 변화시키기 위한 프로바이오틱스
본 발명은 구강 바이오필름의 조성을 변화시키기 위한, 특히 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 특정 미생물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 치아로부터 유래된 구강 바이오필름의 박테리아 조성을 변화시키기 위한, 바람직하게는 그람-음성 혐기성 속 비율의 감소 및/또는 호기성 또는 통성 혐기성 속 비율의 증가를 위한 생균제로서 사용하기 위한 미생물에 관한 것이다.
더 나아가, 본 발명은 생균제로서 미생물을 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품뿐만 아니라 이의 제조방법을 제공한다.
잇몸의 염증 증상은 주로 치아 플라크의 형성에 의해 유발된다. 군집 박테리아 (Colonizing bacteria)는 타액 성분뿐만 아니라 음식 잔여물의 존재에 의해 치아의 표면에 바이오필름을 형성한다. 만일 초기 단계에서 충분히 제거하지 않는다면, 치아 표면의 플라크 막은 제거하기가 매우 어려운 치석을 침착하게 한다. 치은연 (gingival margin)에서 박테리아의 수 증가는 치은염 (gingivitis)으로 알려진 잇몸의 염증으로 이어진다. 민감한 개체들에서, 치은염은 치아 손실로 이어질 수 있는 치주염 (periodontitis)으로 진행될 수 있다. 특히, 그람-음성 박테리아에 존재하는 리포폴리사카라이드 (LPS)는, 작용 조직 (affected tissue)에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 및 인터류킨과 TNF-α와 같은 전-염증성 매개체 (pro-inflammatory mediators)를 방출하는 LPS-자극 대식세포들에 의한 비-특이적인 염증 반응을 야기할 수 있다. 전-염증성 매개체는 주변 조직의 세포외 기질을 파괴하는, 잔존하는 섬유아세포에서 추가적인 PGE2와 기질 금속단백분해효소 (MMPs)의 방출을 유도한다. 이것은 박테리아가 조직에 깊숙이 침투하게 하고, 상피의 외층과 치주 포켓 (periodontal pocket)을 형성하는 치근의 독립적인 염증 과정을 촉진하게 한다. 치아를 지탱하는 치조골 (alveolar bone)은 전진하는 박테리아 (advancing bacteria)보다 이를 먼저 재흡수하여 치아를 불안정하게 하고, 치료를 받지 않는다면 치아를 잃게 된다.
플라크와 치석의 물리적인 제거를 위한 개선된 방법부터 강력한 항균력을 갖는 구강 관리 제품의 사용에 이르는 여러 가지 접근들이 이 문제를 다루어왔다.
그러나, 구강 내 존재하는 모든 박테리아가 질병과 관련되어 있는 것은 아니며, 많은 박테리아들은 심지어 구강 건강을 장려한다. 그러므로, 구강 내 살고 있는 박테리아를 비특이적으로 제거하는 대신 구강 세균총 (flora)의 건강한 조성을 위해 균형을 이루는 것이 바람직하다.
구강 내 박테리아의 프로바이오틱 작용은 몇몇 연구의 대상이 되어 왔지만 종 간 크게 변화하는 것으로 밝혀졌으며 크게 관련이 없는 영향에 의존할 수 있기 때문에 효과적인 적용을 위한 적절한 파라미터 (parameter)를 확립하기가 어렵다.
프로바이오틱 작용 중에서, 질병-관련 종들에 대한 일반적인 항-박테리아 효과, 치아 표면의 박테리아 부착의 감소 또는 예방뿐만 아니라 항염증 효과는 문헌에서 논의되어 왔다.
WO 2010/077795 A2는 스트렙토코시 (Streptococci) 및 락토바실리 (Lactobacilli)의 특정 균주로부터 선택된 치료적 유효량의 유익한 박테리아를 포함하는 구강 건강의 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.
DE 20 2009 011 370 U1에 따르면 프로바이오틱스를 함유하는 치아 및 구강 관리 제품은 치은염 및 치주염을 예방할 수 있는 것으로 기술되어 있으며, 락토바실리 (lactobacilli), 비피도박테리아 (bifidobacteria), 엔테로코시 (enterococci), 스포로락토바실리 (sporolactobacilli) 및 스트렙토코시 (streptococci)을 포함하는 다양한 프로바이오틱 박테리아를 나열하고 있다. 그러나, 구체적인 균주들은 언급되지 않았으며, 더 나아가 주장하고 있는 프로바이오틱 작용은 평가되어 있지 않다.
WO 2010/008879 A2는 물과 접촉하면 활성화될 수 있는 비활성의 프로바이오틱을 포함하는 제과 조성물을 제공한다. 프로바이오틱스로서, 락토바실리 및 비피도박테리아의 각각 다른 균주들이 개시되어 있다. WO 2010/008879 A2에 언급되어 있는 프로바이오틱 효과는 예를 들어 병원성 박테리아의 억제에 의한 잇몸 염증의 감소를 포함한다.
EP 1 852 122 A1은 건조되고 재활성화 가능한 미생물들을 포함하는 치아 및 잇몸 건강 조성물에 관한 것이다. 상기 미생물들은 경쟁으로 인해 영향을 받은 조직 (affected tissue)의 평형을 재확립함으로써 독성 병원균 박테리아 세균총과 싸울 수 있다고 설명되어 있다. WO 2005018342는 또한 프로바이오틱 박테리아가 영양소 또는 부착 부위를 놓고 경쟁함으로써 병원균의 군집화 또는 자연 성장 (out growth)을 저해할 수 있는 경쟁 효과를 언급하고 있다.
더욱이, 단순한 경쟁적인 대체 (displacement) 외에도, 프로바이오틱 박테리아가 질병-관련 종과 공동-응집체를 형성할 수 있고, 이는 쉽게 씻겨나갈 수 있으며 입 안의 질병과 관련된 종을 줄일 수 있다는 것이 입증되었다.
치아 우식증, 치아 플라크 및 치주 감염의 예방 또는 치료를 위한 외인성 유산균의 용도는 WO 00/09080에 개시되어 있다. 남아있는 미생물총 (microflora) (공동-응집체) 간의 특정 결합을 통한 군집화 (colonization)는 개시되어 있으나, WO 00/09080에 따른 프로바이오틱스의 용도는 남아있는 미생물총의 일부가 아닌, 특정 유산균이 치아의 막 (pellicle)에 직접적으로 부착하여 병원균을 대체하거나 (displace) 이들의 부착을 예방할 수 있는 효과에 의존한다.
병원균을 대체하거나 병원균 바이오필름의 형성을 방해하는 응집체를 형성하기 위한 프로바이오틱 박테리아의 능력은 WO 2012/022773 A1에 언급되어 있다. WO 2012/022773 A1은 특정 병원균에 대한 항-박테리아 특성을 갖는 것으로 입증된, 유효량의 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) CECT 7481 및 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) CECT 7480을 포함하는 구강 건강을 위한 프로바이오틱 조성물과 관련이 있다.
WO 2012028759 (EP 2 612 904 A2)는 구강 내 감염 질환의 치료를 위한 스트렙토코커스 속 (genus Streptococcus)의 항균성 박테리아 균주를 제공하며, 이는 프로바이오틱 균주와 S. mutans의 공동-응집체 형성을 바탕으로 한다.
WO 2012/100991은 구강 내 스트렙토코시에 결합하기 위한 결합 (binder) 유기체 (유산균)의 용도를 개시하고 있으며, 이는 씻겨져 나가면서 병원균에 의한 군집화와 충치 (caries)의 형성을 예방한다. WO 2012/100991에 따른 효과적인 결합 미생물은 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) 및 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus)의 특정 균주들이다.
요약하면, 락토바실러스 속 및 다른 속에 속하는 특정 균주들은 생체 외 (in-vitro) 분석에서 몇몇 구강 질병-관련 박테리아 종에 대해 적대적이라는 것이 증명되었다 [1]. 이러한 균주들은 치아 충치 및 치주 질환의 예방 및 치료를 위한 프로바이오틱스 (probiotics)로서 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 그러나, 미생물 길항작용을 입증하기 위해 사용되는 분석은 한천 배지에서 단독 수행되므로 다소 인공적이다. 이는 구강 박테리아가 자연적으로 여러 다른 종으로 구성된 바이오필름을 형성하기 때문인데, 모두가 배양되어 온 것은 아니다 [2,3]. 예를 들어, 심층 시퀀싱 연구는 개별 피험자의 치아 플라크 시료에서 수백 종을 검출했다 [4-6]. 몇몇 생체 외 (in-vitro) 구강 바이오필름 분석이 개발되고 구강 관리 제품을 시험하기 위해 사용되는 동안, 이것들은 일반적으로 비교적 단순한 낮은 복잡도를 갖는 바이오필름을 유발하는 정의된 박테리아 접종원을 사용하였다 [7-9]. 구강 바이오필름의 높은 풍부도 (richness)와 다양성을 고려할 때, 생체 내 생태계를 더 정확히 나타내기 위해 타액이나 치아 플라크와 같은 자연적인 다양한 구강 접종이 바람직할 수 있다.
이전에 바이오필름으로 박테리아를 성장시키기 위해 개발되고 사용되어 온 시험관 내 시스템은 Calgary 바이오필름 장치 (Calgary biofilm device, CBD)이다 [10]. 이 시스템에서, 바이오필름은 96-웰 플레이트의 뚜껑으로부터 튀어나와 있는 마개 (pegs)에서 성장한다. 마개는 새로운 바닥판에 뚜껑을 옮김으로써 쉽게 교체가능한 성장 배지에 잠기게 되므로, 바이오필름의 장기간 성장을 가능하게 한다. CBD는 원래 의료 장치-관련 감염과 같은 적용을 위한 항생제에 대한 박테리아 바이오필름의 감수성을 결정하기 위해 개발되었으므로, '최소 바이오필름 박멸 농도 (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)' 분석법 (Innovotech, Canada)으로 상업적으로 이용가능하다. 이전의 연구는 단순하게 정의된 박테리아 접종원을 사용할 때 [11] 재현가능한 (reproducible) 총 생균 수를 갖는 균일한 바이오필름을 얻을 수 있다는 점을 입증했다. 또한, 구강 미생물 바이오필름 모델은 천연 접종물로서 건강한 개체의 타액을 접종한 CBD를 이용하여 개발되어 왔다 [12]. CBD의 마개는 치아 법랑질 (enamel)과 화학적으로 유사한 표면을 제공하기 위해 수산화 인회석 (hydroxyapatite)으로 코팅되었다. 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing)의 사용은 바이오필름의 박테리아 구성의 포괄적인 정의를 가능하게 했다. 바이오필름은 복잡하지만 재현가능하므로 구강 내 생체 조건을 정확하게 나타냈다.
타액으로부터 유래한 생체 외 구강 바이오필름의 조성에 대한 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) 프로바이오틱 균주의 효과는 이전에 수산화 인회석 디스크와 CDFFs (constant depth film fermenters)를 이용한 연구에서 연구되어 왔다 [13]. 성장 중인 바이오필름과 성숙한 바이오필름 모두에 대한 생균의 도입은 대조군에 비해 바이오필름의 조성을 변화시켰다. 그 차이는 총 혐기성, 그람-음성 혐기성 및 스트렙토코시의 수가 현저히 증가한 성장 중인 바이오필름에서 가장 두드러졌다. 그러나, 성숙한 바이오필름의 투여 (dosing)는 전체 혐기성 및 스트렙토코시에 대한 감소를 가져왔지만 통성 및 혐기성 그람-음성 혐기성 균의 증가를 가져왔다. 저자들은 또한 L. reuteri 균주가 투여가 중단된 후에도 바이오필름의 성숙을 지속할 수 있음을 보여주었다.
CBD 모델을 사용하여, 처음으로 구강 바이오필름의 조성에 대해 다수의 박테리아 균주를 처리한 영향을 개별적으로 평가할 수 있었기 때문에, 치아 표면의 건강한 바이오필름 조성에 대한 균형을 위해 가장 효과적이고 유익한 효과를 갖는 균주의 구체적인 선택을 가능하게 하였다. 특히, 특정 균주가 구강 건강에 유익한 박테리아의 비율을 증가시키는 동안 질병-관련 박테리아의 비율을 감소시킬 수 있음이 알려졌다.
본 발명의 목적은 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 매우 효과적으로 사용할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 타액으로부터 유래된 구강 바이오필름의 박테리아 조성을 구강 건강에 유익한 박테리아에 유리하도록 균형을 이룰 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 구강 관리에서 본 발명의 미생물을 효과적으로 사용하기 위한 조성물 및 제품을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 미생물에 의해 달성되며, 상기 미생물은 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691)이다.
본 발명에 이르는 광범위한 스크리닝 결과, 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)가 바이오필름의 공동체 조성에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 속 (genus) 수준에서, 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)-처리된 바이오필름에서 비율이 낮았던 많은 분류군 (taxa)은 필럼 박테로이데테스 (Phylum bacteroidetes), 푸조박테리움 (Fusobacterium), 프레보텔라 (Prevotella) 및 피라미도박터 (Pyramidobacter)에 속하는 명명되지 않은 속 (genera)을 포함하는 그람-음성 혐기성 속이었다. 이런 분류군은 치주염 실험의 연구에서 치주염의 발병과 함께 분류됨으로써, 그람-음성 혐기성의 비율 감소가 잇몸 건강을 유지하는데 유리하게 도움이 된다 [6, 28, 29]. 대조적으로, 음성 대조군과 관련하여 증가되는 다수의 속은 코리네박테리움 (Corynebacterium) 및 네이세리아 (Neisseria)를 포함하는 호기성/통성 혐기성 속이었으며, 잇몸 건강에 전형적으로 나타나는 초기의 미성숙 플라크에서 흔하다 [6, 30]. 종 (species) 수준에서, 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum)은 열-약독화된 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691)을 처리한 바이오필름에서 상대적으로 양이 현저히 적었다. 푸조박테리움 뉴클레아툼은 이전에 치은염과 관련이 있고 [6, 29], 초기 및 후기 이주종 (colonizer)과 함께 응집능을 통해 플라크에서 '교량 (bridging)' 미생물로써 기술되어 왔다 [31].
락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 균주는 부다페스트 조약 하에 중국, 우한 430072, 우한 대학교의 CCTCC (China Center for Type Culture Collection) 에 접근번호 CCTCC M 2013691 (BioGrowing Co., Ltd., No.10666 Songze Rd., Qingpu Shanghai 201700, China)로 2013년 12월 23일에 기탁되었다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 상기 기술된 미생물은 약독화된 (attenuated) 또는 사멸된 미생물이고, 바람직하게는 열에 의해 약독화된 미생물이다.
하기 기술된 연구에서, 본 발명에 따른 미생물은 열에 의해 약독화된 상태에서 특히 효율적이라는 것이 입증되었다.
본 발명에서 열에 의해 약독화된 균주의 활성은 열 처리 동안 생리활성 분자의 방출 때문일 수 있으며, 이는 특정 구강 종에 대해 약간의 특이성을 가질 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 타액으로부터 유래된 구강 바이오필름의 박테리아 조성을 변화시키기 위한, 바람직하게는 각각의 경우 음성 대조군을 기준으로 (아래, 실시예 1 참조), 바람직하게는 그람-음성 혐기성 속 비율의 감소 및/또는 호기성 또는 통성 혐기성 속 비율의 증가를 위한 생균제로서의 상기 언급한 미생물에 관한 것이다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명에 따른 미생물은, 바람직하게는 각각의 경우 음성 대조군을 기준으로 (아래, 실시예 1 참조), 박테로이데테스, 푸조박테리움, 프레보텔라 및 피라미도박터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 박테리아 비율의 감소 및/또는 코리네박테리움 및/또는 네이세리아 비율의 증가를 위한 것이다.
앞서 설명한 대로, 본 발명에 따른 미생물은 유해한 미생물의 축적이 감소되는 동안 유익한 미생물의 축적을 위해 바이오필름 내 미생물의 균형을 뒤집어 엎는다. 특히, 그람-음성 혐기성 속, 특히 박테로이데테스, 푸조박테리움, 프레보텔라 및 피라미도박터는 치은염의 발병과 관련 있다고 알려져 왔고, 본 발명에 따른 미생물에 의해 구강 바이오필름 조성에서 비율이 현저하게 감소되었다. 반면에, 호기성 또는 통성 혐기성 속, 특히 치주 건강 (periodontal health)의 전형적인 초기 미성숙 플라크에서 흔하게 볼 수 있는 코리네박테리움 및 네이세리아는 본 발명에 따른 미생물에 의해 비율이 증가되어, 유익한 효과를 최적화한다.
본 발명의 또 다른 측면은 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)을 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품에 관한 것으로, 상기 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 총 함량은 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 충분하고, 더 바람직하게는 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 총 함량은, 각각의 경우 조성물의 총 중량을 기준으로, 0.01 내지 100 %의 범위, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 %의 범위, 가장 바람직하게는 1 내지 10 %의 범위이며, 및/또는 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 총 함량은 1 x 103 내지 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU)의 범위, 보다 바람직하게는 1 x 105 내지 1 x 1010 CFU의 범위이다.
구강 관리에서 본 발명의 미생물을 실제로 사용하기 위한 조성물 및 제품을 제공하기 위해서, 유효량의 본 발명의 미생물을 포함하는 조성물이 제공된다. 특히, 상기 기술된 함량은 발명의 효과를 달성하기에 적합한 것임이 입증되었다.
나아가 본 발명은 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 바람직하게는 타액으로부터 유래된 구강 바이오필름의 박테리아 조성을 변화시키기 위한 상기 기술된 조성물 또는 제품에 관한 것이다.
바람직하게는, 조성물 또는 제품은 각각의 경우 음성 대조군과 비교하여 그람-음성 혐기성 속 비율의 감소 및/또는 호기성 또는 통성 혐기성 속 비율의 증가를 위해 사용된다.
특히 바람직하게는, 조성물 또는 제품은, 각각의 경우 음성 대조군과 비교하여 (하기 실시예 1 참조), 박테로이데테스, 푸조박테리움, 프레보텔라 및 피라미도박터로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 박테리아 비율의 감소 및/또는 코리네박테리움 및/또는 네이세리아 비율의 증가를 위해 사용된다.
본 발명에 따른 조성물은 담체, 부형제 또는 추가 활성 성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분, 예를 들어 비-스테로이드성 소염제, 항생제, 스테로이드, 항-TNF-α 항체 또는 다른 생화학적으로 생산된 활성 성분 및/또는 물질뿐만 아니라 진통제 (analgesics), 덱스판테놀 (dexpanthenol), 프레드니솔론 (prednisolon), 포비돈 아이오딘 (povidon iodide), 클로르헥시딘-비스-D-글루코네이트 (chlorhexidine-bis-D-gluconate), 헥세티딘 (hexetidine), 염산벤지다민 (benzydamine HCl), 리도카인 (lidocaine), 벤조카인 (benzocaine), 마크로골 라우릴 에테르 (macrogol lauryl ether), 염화세틸피리디늄 (cetylpyridinium chloride)과 결합된 벤조카인 또는 송아지 혈액으로부터 단백질이 제거된 혈투석액과 결합된 마크로골 라우릴 에테르뿐만 아니라; 예를 들어 충진제 (fillers) (예. 셀룰로오스, 탄산칼슘), 가소제 또는 흐름 개선제 (flow improves) (예. 활석 (talcum), 스테아린산 마그네슘 (magnesium stearate)), 코팅제 (예. 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (polyvinyl acetate phthalate), 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 (hydroxyl propyl methyl cellulose phthalate)), 붕괴제 (예. 전분, 가교된 폴리비닐 피롤리돈 (cross-linking polyvinyl pyrrolidone)), 연화제 (예. 트리에틸시트레이트, 디부틸프탈레이트) 과립화제 (락토오즈, 젤라틴), 지연제 (retardation) (예. 분산액 중의 폴리 (메트)아크릴산 메틸/에틸/2-트리메틸 아미노메틸 에스테르 공중합체 (poly (meth)acrylic acid methyl/ethyl/2-trimethyl aminomethyl ester copolymerizates in dispersion), 비닐 아세테이트/크로톤산 공중합체 (vinyl acetate/ crotonic acid copolymerizates)), 응축제 (compaction) (예. 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 락토오스), 용매, 현탁 또는 분산제 (예. 물, 에탄올), 유화제 (예. 세틸 알코올, 레시틴), 유동성 조절제 (substances for modifying the rheological properties) (실리카, 소듐 알지네이트), 미생물 안정화제 (예. 염화벤잘코늄 (benzalkonium chloride), 소르빈산칼륨 (potassium sorbate)), 보존제 및 항산화제 (예. DL-알파-토코페롤 (DL-alpha-tocopherol), 아스코르브산 (ascorbic acid)), pH 조절제 (젖산, 스트르산), 발포제 (blowing agents) 또는 비활성 기체 (예. 불소 염화탄화수소 (fluorinated chlorinated hydrocarbons), 이산화탄소), 염료 (산화철 (iron oxide), 산화티타늄 (titanium oxide)), 외용제의 기본 성분 (basic ingredients for ointment) (예. 파라핀, 비즈왁스) 및 문헌 (예. in Schmidt, Christin. Wirk- und Hilfsstoffe f
Figure pct00001
r Rezeptur, Defektur und Großherstellung. 1999; Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart oder Bauer, Fromming Fuhrer. Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie. 8. Auflage, 2006. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart) 에 개시된 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 제품은 코팅되거나 캡슐화된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 캡슐화는 제어된 방출을 허용하는 이점, 예를 들어 물과의 접촉시, 또는 장기간 동안의 연속적인 재방출의 이점을 가질 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 제품의 저장 수명을 개선하는 분해로부터 보호될 수 있다. 활성 성분들의 캡슐화를 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 캡슐화 재료뿐만 아니라 특정 요구들에 따라 조성물에 그것들을 적용하는 방법도 이용가능하다.
나아가, 본 발명에 따른 조성물 또는 제품은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 과립, 파우더 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 제품은 치약, 치아 겔, 치아 파우더, 치아 세정액, 치아 세정폼, 구강 세정제, 구강 스프레이, 치실, 츄잉껌 및 로젠지 (lozenges)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물 또는 제품은 규산염, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 알루미늄 및/또는 수산화 인회석 (hydroxyl apatite)와 같은 연마 시스템 (연마 및/또는 연마 구성 요소); 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 사코시네이트 및/또는 코카마이도프로필 베타인과 같은 계면활성제; 글리세롤 및/또는 소르비톨과 같은 습윤제; 카르복시 메틸 셀룰로오스, 폴리 에틸렌 글리콜, 카라기난 및/또는 라포나이트 ®과 같은 증점제; 사카린과 같은 감미료; 불쾌한 (unpleasant) 맛의 인상을 위한 향과 맛 교정제; 맛 조절 물질 (예를 들어, 이노시톨 포스페이트, 뉴클레오타이드, 예를 들어 일인산구아노신, 일인산아데노신 또는 다른 물질, 예를 들어 글루탐산나트륨 또는 2-페녹시 프로피온산); 멘톨 유도체 (예를 들어 L-멘틸 락테이트, L-멘틸 알킬 카보네이트, 멘톤 케탈 (menthone ketals))와 같은 냉각제; 아이실린 및 아이실린 유도체; 불화 나트륨 (sodium fluoride), 일불소 인산나트륨 (sodium monofluorophosphate), 주석 (II) 불화물 (tin difluoride), 4차 암모늄 플루오르화물 (quaternary ammonium fluorides), 구연산 아연 (zinc citrate), 황산 아연 (zinc sulfate), 피로인산주석 (tin pyrophosphate), 주석(II) 염화물 (tin dichloride), 다른 피로인산 (pyrophosphate)의 혼합물, 트리클로산 (triclosane), 염화세틸피리디늄 (cetylpyridinium chloride), 젖산 알루미늄 (aluminum lactate), 구연산 칼륨 (potassium citrate), 질산 칼륨 (potassium nitrate), 염화 칼륨 (potassium chloride), 염화 스트론튬 (strontium chloride), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 향료 물질 (aroma substances), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate) 및/또는 향 교정제와 같은 안정화제 및 활성 성분;을 포함할 수 있다.
츄잉껌 또는 치아 관리 츄잉껌은 엘라스토머, 예를 들어 폴리비닐 아세테이트 (PVA), 폴리에틸렌, (저 (low) 또는 중 (medium) 분자), 폴리이소부탄 (PIB), 폴리부타디엔 (polybutadiene), 이소부텐/이소프렌 공중합체, 폴리비닐에틸에테르 (PVE), 폴리비닐부틸에테르, 비닐 에스테르 공중합체 및 비닐 에테르, 스티렌/부타디엔 공중합체 (SBR); 또는 비닐 엘라스토머, 예를 들어 비닐 아세테이트/비닐 라우레이트, 비닐 아세테이트/비닐 스테아레이트 또는 에틸렌/비닐 아세테이트; 및 엘라스토머, 예를 들어 EP 0 242 325, US 4,518,615, US 5,093,136, US 5,266,336, US 5,601,858 또는 US 6,986,709에 기재된 예시의 혼합물을 포함하는 츄잉껌 베이스로 이루어질 수 있다. 추가로, 츄잉껌 베이스는 추가 성분, 예를 들어 (미네랄) 충진제 (filler), 예를 들어 탄산칼슘 (calcium carbonate), 이산화티타늄 (titanium dioxide), 이산화규소 (silicone dioxide), 활석 (talcum), 산화알루미늄 (aluminum oxide), 제2인산칼슘 (dicalcium phosphate), 제3인산칼슘 (tricalcium phosphate), 수산화마그네슘 (magnesium hydroxide) 및 이들의 혼합물; 가소제 (plasticisers) (예를 들어, 라놀린 (lanolin), 스테아린산 (stearin acid), 스테아린산 나트륨 (sodium stearate), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 다이아세틴 (diacetin) (글리세롤 디아세테이트 (glycerol diacetate)), 트리아세틴 (triacetin) (글리세롤 트리아세테이트 (glycerol triacetate)), 및 트리에틸시트레이트 (triethyl citrate)); 유화제 (예를 들어, 레시틴 (lecithin) 및 지방산의 모노 (mono) 및 다이글리세라이드 (diglycerides), 예를 들어 글리세롤 모노스테아레이트 (glycerol monostearate)와 같은 인지질), 항산화제, 왁스 (예를 들어, 파라핀 왁스, 칸데릴라 왁스, 카나우바 왁스, 마이크로크리스탈린 왁스 및 폴리에틸렌 왁스), 지방 또는 지방 오일 (fatty oils) (예를 들어, 경화된 (hardened) (수소화된 (hydrogenated)) 식물 또는 동물 지방) 및 모노 (mono), 디 (di) 또는 트리글리세라이드 (triglycerides)를 포함할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 앞서 기술한 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품의 제조방법에 관한 것이다:
락토바실러스 파라카제이 LPc-G110과 하나 이상의 추가 성분, 바람직하게는 담체, 부형제 또는 추가 활성성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 결합하는 단계.
하기 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시하기 위해 추가된 것이다.
실시예 1: 시험관 내(in vitro) 구강 바이오필름 복합체의 조성물에 대한 효과를 위한 박테리아 균주의 스크리닝
스크리닝은 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus) 및 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum)의 다수의 후보 프로바이오틱 균주들에 대해서 수행되었다.
시료 선정
멸균된 표준 튜브에 가래를 뱉어 참가자들로부터 5 ml의 타액을 얻었다. 타액은 얼음 위에 놓고 한 시간 이내에 접종에 사용하였다. 시료들은 CBD 플레이트의 접종을 위해 동일한 부피로 모았다.
Calgary 바이오필름 장치의 접종 및 바이오필름의 배양
모아놓은 타액은 15초동안 볼텍싱 (vortexing)하고, 200 μl를 96-웰 마이크로플레이트의 필요한 수만큼 웰 당 파이펫팅 (pipetting)하였다. 마이크로플레이트의 바깥 부분의 웰은 사용하지 않았다. 마개 (pegs) 가 있는 CBD 뚜껑은 수산화 인산염이 코팅된 마개가 타액에 잠기도록 마이크로플레이트에 끼웠다. CBD 플레이트는 37 ℃, 공기 + 5 % CO2에서 18시간동안 배양한 후, 뚜껑을 돼지 위 점소 (gastric mucin) (1 g/L), 해민 (10 mg/L), 및 비타민 K (0.5 mg/L)가 보충된 미리 환원된 (pre-reduced) BHI (Brain Heart Infusion) 배양액 (Fluka Analytical) 성장 배지 200 μl를 포함하는 새로운 베이스플레이트로 옮겼다. 마개는 공기 + 5% CO2에서 14일동안 배양한 후, 성장 배지는 3.5일 마다 교체해주었다.
바이오필름의 처리
성장 7일 후, 바이오필름은 하루에 두 번 살아있거나 또는 열에 의해 약독화된 (heat-attenuated) 프로바이오틱 균주를, BHI, 음성 대조군 (멸균 BHI), 또는 양성 대조군 (0.1% v/v 티몰)에 1 x 108 CFUs/ml의 농도로 현탁하여 일주일 동안 처리하였다. 프로바이오틱 균주의 열-약독화 (heat-attenuation)는 박테리아 현탁액(들)을 Techne 가열 블록 (Techne heating block)에 놓음으로써 수행되었다. 배양 후에, 현탁액은 얼음 위에 5분동안 놓아 두었고, 필요할 때까지 -70 ℃에서 저장하였다. 살아있는 프로바이오틱 제제 (probiotic preparations)는 필요할 때까지 -70 ℃에서 저장하고, 사용하기 전에 가열 블록에 37 ℃에서 30분동안 배양하여 소생시켰다.
처리는 매일 오전 9시와 오후 5시에 수행하였다. 각 프로바이오틱 제제 또는 대조군의 200 μl의 소분 (aliquots)은 처리 단계를 위해 96-웰 마이크로플레이트의 적절한 웰에 파이펫팅하였다. 3개의 마개의 3개의 복제물 (총 9개의 마개)은 프로바이오틱 제제 당 처리되었다. 바이오필름이 달린 마개들은 처리된 마이크로플레이트로 CBD의 뚜껑을 교체함으로써 프로바이오틱 제제 또는 대조군들에 담갔다. 노출 (exposure)은 적당한 교반으로 1분간 교반기 (shaker)에서 수행되었다. 마개들을 성장 배지로 되돌려 보내기 전에 PBS에 30초간 잠시 담구어 세척하였다.
파이로시퀀싱 분석을 위한 시료의 프로피듐 모노아자이드 ( propidium monoazide ) 처리 및 마개의 제거
14일째, 바이오필름이 달린 마개들은 뚜껑은 멸균된 집게 (plier)로 뚜껑을 부러뜨리고, 멸균된 PBS에 3회 담가서 세척하였다. 멸균된 큐렛 (curette)을 이용하여 보이는 모든 바이오필름 재료를 제거한 다음, 500 μl의 PBS에 넣어 현탁하였다. 세 개의 마개에서 얻은 재료는 분석을 위해 하나의 시료를 생산하기 위해 모았으며, 세 개의 시료를 각 처리군에 대해 처리하였다. 각각의 시료는 세포외 DNA 및 죽거나 손상된 세포의 DNA의 PCR 증폭을 예방하기 위해 프로피듐 모노아자이드 (PMA) 를 처리하였다. 시료들은 PMA와 DNA 간의 공유 결합을 형성하기 위해 500 W 할로겐 램프로 5분동안, 20 cm의 거리에서 빛에 노출시켰다. 노출 시간 동안, 시료들은 과도한 가열을 피하기 위해 얼음 위에 두었고, 가끔 흔들어주었다. 시료는 PMA 처리 후에 곧바로 DNA 추출을 위해 사용하였다 [14]: PBS에 현탁된 세포에 1.25μl의 PMA를 추가하고 (최종 농도 50μM에서), 실온의 암실에서 5분 동안 가끔 흔들어주며 배양하였다.
DNA 추출
DNA는 GenElute 박테리아 DNA 추출 키트 (Sigma-Aldrich)를 이용하여 타액과 바이오필름 시료로부터 추출하였다. DNA 추출은 37 ℃에서 30분간 45 mg/ml 라이소자임 용액에서 배양시킨 그람-양성 세포로부터 DNA의 회수율을 높이기 위한 추가적인 세포 용해 단계와 함께 제조사의 지시에 따라 수행되었다.
16S rRNA 유전자의 파이로시퀀싱 분석
바이오필름과 타액의 박테리아 조성은 이전에 [6]에 기술된 16S rRNA 유전자 일부의 454 파이로시퀀싱 분석을 일부 변형하여 이용하여 결정하였다. V1-V3 과변이부위 (hypervariable)에 걸친 약 500 bp의 길이의 16S rRNA 유전자 단편의 PCR 증폭은 혼합 프라이머 합성물을 이용하여 각DNA 시료에 대해 수행되었다. 혼합 프라이머는 Lib-L 에멀젼-PCR 방법을 이용한 454-파이로시퀀싱 분석을 위해 Roche GS-FLX 티타늄 시리즈 어댑터 (Titanium Series adapter) 서열 (A 및 B)에 따라 광범위한 16S rRNA 유전자 프라이머 27 FYM [15] 및 519 R [16]으로 이루어졌다. 정방향 프라이머는 이전에 기술했던 12-염기 오류-정정 Golay 바코드 (12-base error-correcting Golay barcodes)가 포함된다. PCR 반응은 Extensor Hi-fidelity PCR mastermix (ThermoScientific)을 이용하여 적절한 바코드가 붙은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머에 따라 수행되었다. PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 5분간 초기 변성 (initial denaturation), 95 ℃에서 45초, 53 ℃에서 45초, 72 ℃에서 45초를 25회 반복하고, 72 ℃에서 5분간 최종 연장 (final extension). PCR 앰플리콘 (amplicons)은 제조자의 지시에 따라 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)을 이용하여 정제하였다. 앰플리콘의 크기와 순도는 Agilent DNA 1000 kit와 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하여 확인하였다. 앰플리콘의 정량 (quantitation)은 Quant-iT Picogreen fluorescent nucleic acid strain (Invtrogen)을 이용하여 형광 분석으로 수행되었다. 앰플리콘 (amplicons)은 같은 몰의 농도 (1 x 109 molecules/μl)에서 함께 모았다. 시료의 에멀젼-PCR 및 단일방향 (unidirectional) 시퀀싱은 Lib-L 키트와 Roche 454 GS-FLX + 티타늄 시리즈 시퀀서 (Roche 454 GS-FLX + Titanium series sequencer)를 이용하여 영국, 캠브릿지, 캠브릿지 대학교의 생화학과 (Department of Biochemistry, Cambridge University, Cambridge, UK)에서 수행하였다.
서열 분석
서열 분석은 mother.org의 454 표준 작동 절차 [18]에 따라 'mothur' 소프트웨어 suite 버전 1.34 [17]을 사용하여 수행하였다. 서열은 mothur에 의해 개시된 AmpliconNoise 알고리즘 [19]를 이용하여 노이즈를 제거하였다. 길이가 400 베이스 미만 및/또는 다음 중 하나를 갖는 서열은 제거하였다: >2의 불일치 프라이머, >1 불일치 바코드 부위, 및 >8 염기 길이의 단일 중합체. 남아있는 서열들은 프라이머와 바코드를 제거하기 위해 잘라내고, SILVA 16S rRNA 참고 문헌 [20] 정렬로 조정하였다. UChime 알고리즘 [21]은 키메라 서열을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는 데이터세트 (dataset)로부터 제거되었다. 서열들은 0.015의 유전적 거리 (약 종 수준)에서 평균 이웃 알고리즘을 이용하여 OTUs(operational taxonomic units)로 모으고, 인간 구강 미생물군집 (microbiome) 데이터 베이스 (HOMD) 참고 세트 (버전 13)과 함께 나이브 베이지언 분류기 (Naive Bayesian classifier) [22]를 이용하여 확인하였다.
통계 분석
각 시료의 서열들은 통계적 OTU-기반의 다양성 비교를 위해 동일 수 (서열 수가 가장 적은 시료의)로 무작위로 부표본을 만들었다. 군집 (community)의 시료 규모는 Good의 비-모수적 커버리지 측정기 (Good's non-parametric coverage estimator) [23]를 이용하여 평가하였다. 군집의 다양성은 Simpson의 인버스 다양성 지수 (Simpson's inverse diversity index) [24]를 이용하여 측정하였다. 시료/처리군의 군집 구조는 thetaYC 측정기 [25]로 생성된 거리 매트릭스 (distance matrices)를 사용하여 비교하였다. 거리 매트릭스는 R (r-progect.org)에서 비-계량형 다차원 척도법 (NMDS) 플롯을 이용하여 시각화하였다. mothur에서 개시된 AMOVA (analysis of molecular variance) [26]는 thetaYC 거리 매트릭스에 기반하여 처리군 간에 통계적으로 뚜렷한 차이가 있는지 결정하는데 사용되었다. 박테리아 속의 비율에 기반하는 히트 맵 (heat map)과 계통도 (dendrogram)는 'vegan' 패키지를 사용하여 R에서 만들어냈다. 계통도는 vegan 패키지에 의해 개시된 군집 구조에서 'Bray-Curtis' 지수의 차이점에 기반된다. LEfSe (Linear Discriminant Analysis Effect Size) [27] 분석은 음성 대조군 바이오필름과 처리군 간의 유의미하게 차별적으로 존재하는 종-수준 OTU를 검출하기 위해 사용된다.
결과
성공적으로 증폭된 복제물은 열-약독화된 처리 실험의 양성 대조군 처리에 의한 것이었다. 평균 길이가 427 염기인 전체 468,261개의 16S rRNA 서열을 서열 키메라의 여과 및 제거 후 분석하여 얻었다. 바이오필름 시료에서 검출된 종-수준 OTU의 평균 수는 모아둔 (pooled) 타액 접종원에서 213.3 (± 24.7) 및 284 (±1.4)였다.
열-약독화된 프로바이오틱 균주를 처리한 바이오필름과 음성 대조군 바이오필름을 비-계량형 다차원 척도법 (NMDS) 플롯에서 비교한 결과는 대부분의 경우에서 박테리아 군집 구조 (군집에 존재하는 모든 OTUs의 상대적 양에 기반한 thetaYC 측정기)의 뚜렷한 차이를 보여주지 못했다. 그러나 L. paracasei LPc-G110을 처리한 결과, 음성 대조군과의 차이가 나타났으며, 이는 NMDS 축을 따라 대조군에서 벗어난 것으로 나타났다. 단일 티몰 양성 대조군 복제 시료는 음성 대조군과 가장 큰 차이를 보였다. 개별 처리군과 음성 대조군 간의 차이가 통계적으로 뚜렷하지 않았음에도 불구하고, AMOVA는 다른 처리군 간에 전반적으로 유의한 차이가 있음을 보여주었다 (P<0.001).
다른 속의 상대적인 양에 기반하는 계통도와 히트 맵을 이용한 바이오필름의 조성 비교는 OTU 분석의 결과를 뒷받침했다. 열-약독화된 처리를 위해, 3종의 L. paracasei LPc-G110 복제물 중 2종은 남아있는 바이오필름과 별도로 모았다. 이러한 차이를 나타내는 히트 맵은 주로 박테로이데테스, 푸조박테리움, 프레보텔라 및 피라미도박터의 상대적인 양의 감소 및 코리네박테리움 및 네이세리아의 증가로 인한 것임을 보여주었다. 더욱이, 티몰-처리 바이오필름은 다른 바이오필름 및 음성 대조군 바이오필름과 뚜렷한 차이를 보여주었고, 이는 주로 코리네박테리움, 네이세리아 및 스트렙토코커스로 구성되었다.
LEfSe (Linear Discriminant Analysis Effect Size)를 이용한 통계 분석은 37종-수준의 OTUs가 L. paracasei LPc-G110과 음성 대조군 간에 현저히 다르게 많이 나타남을 보여주었다.
실시예 2: 프로바이오틱 로젠지 (lozenge) 또는 정제 ( comprimate )
No 블록 성분 아이소말트 정제 ( Isomalt Comprimates)
위약
(placebo)		 프로바이오틱
(probiotic only)		 향 첨가 (+ Flavor)
1 A 스테아린산 마그네슘 1,800% 1,800% 1,800%
2 아세설팜 0,050% 0,050% 0,050%
3 수크랄로스 0,025% 0,025% 0,025%
4 프로바이오틱 재료 (Probiotic material) 　 1,000% 1,000%
5 향 (Flavor) (예. 134229 옵타민트 페퍼민트(Optamint Peppermint) s/d) 　 　 0,500%
6 B 아이소말트 98,125% 97,125% 96,625%
총합 100,00% 100,00% 100,00%
제조 방법:
●성분 1 및 6을 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기 (vacuum compartment drier)에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
성분 1, 2, 3, 4 및 5를 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 A). 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 형태로 적용된다.
●이후 블록 A를 성분 6 에 첨가하고, 5분동안 완전히 혼합한다.
●분말 혼합물을 15 - 20 kN의 조정된 압력으로 정제기 EK0 (Korsch AG, 베를린)에서 정제로 압축한다.
목표 파라미터 (target parameters):
◎정제 직경: 20 mm
◎정제 중량: 2,0 g
●밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에서 실온 (RT) 저장한다. 5개의 로젠지 (lozenges) 당 제습을 위해 1 g의 건조제 (desiccant)가 사용된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 3: 치약 파우더 (Powder dentifrice)
No 블록 성분 치아 파우더 ( Toothpowder )
위약
(Placebo)		 프로바이오틱
(Probiotic only)		 향 첨가
(+ Flavor)
1 A 탄산 마그네슘 3,00% 3,00% 3,00%
2 중탄산 나트륨 2,00% 2,00% 2,00%
3 불화 나트륨 0,25% 0,25% 0,25%
4 사카린나트륨 0,60% 0,60% 0,60%
5 B 프로바이오틱 재료 　 4,00% 4,00%
6 향 (예. 134229 옵타민트 페퍼민트 s/d) 　 　 2,00%
7 C 탄산 칼슘 94,15% 90,15% 88,15%
총합 100,00% 100,00% 100,00%
제조 방법:
●성분 7을 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1, 2, 3 및 4를 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 A).
●성분 5와 6을, 필요하다면, 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 B). 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 형태로 적용된다.
●이후 블록 A와 B를 결합시키고 완전히 혼합한다.
●혼합물을 성분 7에 첨가하고 5분간 완전히 혼합한다.
●분말 혼합물은 실온에서 1회분 당 1 g의 건조제와 함께 각각 0.5 g의 분획으로 저장되어 밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에 구성된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 4: 치약 파우더 (powder dentifrice)
No 블록 성분 치약 정제(Toothpaste tablets)
1 A 탄산 마그네슘 3,00 %
2 중탄산 나트륨 2,00 %
3 불화 나트륨 0,25 %
4 사카린나트륨 0,60 %
5 소듐 라우릴설페이트 0,50 %
6 스테아린산 마그네슘 1,00 %
7 B 향 (예. 134229 옵타민트 페퍼민트 s/d) 2,00 %
8 프로바이오틱 재료 6,67 %
9 C 탄산 칼슘 17,00 %
10 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 66,98 %
총합 100,00%
제조 방법:
●성분 6, 9 및 10을 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 A).
●성분 7과 8을 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 B). 프로바이오틱스 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 형태로 적용된다.
●이후 블록 A와 B를 결합시켜 완전히 혼합한다.
●성분 9와 10을 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 C).
●두 혼합물 (블록 A/B 및 블록 C)을 결합시키고 5분간 완전히 혼합한다.
●분말 혼합물을 15 - 20 kN의 조정된 압력으로 정제기 EK0 (Korsch AG, 베를린)에서 정제로 압축하였다.
목표 파라미터 (target parameters):
◎직경: 9 mm
◎정제 중량: 0,3 g
●밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에서 실온 (RT) 저장한다. 3개의 정제 (tablets) 당 제습을 위해 1 g의 건조제 (desiccant)가 사용된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 5: 츄잉껌
No 성분 츄잉껌 (식물성 유지 및 향 내 프로바이오틱스 포함)
(Chewing gum with Vegetable Oil, Probiotics in Flavor) 		츄잉껌 (식물성 유지 및 오일 내 프로바이오틱스 포함)
(Chewing gum with Vegetable Oil, Probiotics in Oil)
1 껌 베이스 (예. Geminis T) 30,00 % 블록 A 30,00 % 블록 A
2 아이소말트 (여기서는: 아이소말트 ST-PF (Isomalt ST-PF)) 65,00 % 블록 B 65,00 % 블록 B
3 코팅된 슈크랄로스 (Sucralose coated) (왁스 내 10%) 1,00 % 1,00 %
4 기름이 제거된 대두 레시틴 (Deoiled Soy Lecithin) (여기서는: Emulpur IP) 0,30 % 0,30 %
5 식물성 유지 - 트리글리세라이드 1,60 % 블록 C 1,60 % 블록 C
6 프로바이오틱 재료 0,80 % 블록 D 0,80%
7 향 (e.g. 203191 옵타민트 페퍼민트) 1,30 % 1,30 % 블록 D
제조 방법:
●성분 2를 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1을 균일한 덩어리가 얻어질 때까지 츄잉껌 실험-반죽기 (lab-kneader)에서 45 - 59 ℃까지 가열하면서 반죽한다. 가열은 모든 혼합 공정동안 작동된다.
●이어서 성분 2, 3 및 4를 첨가하고 혼합물이 균일하고 분말이 더 이상 보이지 않을 때까지 반죽한다.
●제조 방법에 따라, 성분 6은 성분 5 (블록 C) 또는 성분 7 (블록 D) 중 하나로 가공된다. 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 상태로 적용한다. 상기 성분들은 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 혼합한다.
●먼저, 블록 C를 츄잉껌 덩어리에 넣고 균일한 덩어리가 얻어질 때까지 다시 반죽한다.
●마지막으로, 블록 D를 그에 따라 처리한다. 첨가 후, 조성물은 츄잉껌 덩어리가 얻어질 때까지 반죽해야 한다.
●덩어리를 믹서에서 꺼내고 엠보싱 세트 "평판 (slabs)"을 사용하여 엠보싱 롤러 (embossing roller)로 미니-스틱 (mini-sticks)을 만든다.
●밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에서 실온 (RT) 저장한다. 7개의 츄잉껌 당 제습을 위해 1 g의 건조제 (desiccant)가 사용된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 6: 프로바이오틱 비들렛 ( beadlets )
성분 프로바이오틱 비들렛 (저함량, 향료 미포함, 염료 및 젤란검 포함)
중량 % (wt. % ) 		프로바이오틱 비들렛 (저함량, 향료, 염료 및 젤란검 포함)
중량 % (wt. % ) 		프로바이오틱 비들렛 ( 고함량 , 향료, 염료 및 젤란검 미포함, 고함량의 물 포함)
중량 % (wt. % ) 		프로바이오틱 비들렛 ( 고함량 , 향료, 염료 및 젤란검 미포함, 저함량의 물 포함)
중량 % (wt. % )
알지네이트 1,75 1,65 1,44 1,57
아라비아 검 1,25 1,18 0,60 0,65
밀 섬유 1,125 1,06 0,52 0,57
염료 0,0125 0,018 - -
향료 - 1,41 - -
글리세롤 0,1875 - - -
프로바이오틱 1,125 1,35 7,20 7,83
젤란검 0,0625 0,059 - -
물 100까지 첨가 100까지 첨가 100까지 첨가 100까지 첨가
load 약 20% 약 20% 약 74% 약 74%
제조 방법:
알지네이트 비들렛 (beadlets)의 석출을 위한 염화 칼슘 용기 (bath)의 제조:
●2%의 염화 칼슘 용액은 증류수와 염화 칼슘으로부터 제조한다. CaCl2는 완전히 용해되니 주의해야 한다.
알지네이트 용액의 제조(알지네이트 대신 펙틴 (pectin) 또는 젤란 검 (gellan gum)을 사용할 수도 있음):
●교반기가 있는 반응 용기에서 배치 (batch) 크기에 적합한 경우, 물을 공급한다.
●교반기를 작동시키고, 고속으로 교반하면서, 알지네이트, 아라비아 검 (gum arabicum), 밀 섬유 (wheat fiber) 및 프로바이오틱의 각각의 함량뿐만 아니라 요구되는 젤란 검을 선택적으로 추가한다.
●혼합물은 교반하면서 80℃로 가열하고, 이 온도에서 5분간 유지한다 - 이 단계에서 겔 형성 성분들이 용해된다.
●이후, 가열은 멈추고, 뜨거운 겔 용액을 덩어리가 없어질 때까지 적어도 30분동안 더 교반한다.
●이어서, 용액을 교반하면서 냉각기로 39 - 43℃로 냉각시킨다.
●추가 용기에서, 아로마와 염료는 필요에 따라 제공되며, 완전히 혼합한다. 아로마가 사용되지 않는 경우, 염료는 글리세롤과 혼합된다.
●염료 분산액이 균일하게 혼합되면, 배치 (batch) 용기에 알지네이트 용액과 함께 첨가한다. 혼합 용기는 물을 사용한 약 10% 함량의 알지네이트 용액으로 수회 세척하고 분산액에 첨가한다.
●알지네이트 분산액을 적어도 5분동안 추가로 교반한다.
●다음으로, 배치는 잠재적으로 남아있는 공기를 제거하기 위해 낮은 속도에서 적어도 15분동안 추가로 교반한다.
비들렛의 침전을 위한 염화 칼슘 용액으로의 알지네이트 용액의 적하 (dripping):
●알지네이트 분산액을 두 개의 배출구가 있는 단단히 밀폐가능한 압력 안정 반응 용기에 옮긴다. 하나의 배출구에서 가압된 공기를 가한다. 두번째 출입구는 튜브를 통해 적하 장치의 노즐로 이어진다.
●반응 용기를 가열판에서 담금질하고, 알지네이트 용액은 약 45℃의 온도에 도달하도록 한다. 용액은 자석 교반기로 약간 교반한다.
●반응 용기에 압력을 가한 후, 알지네이트 용액을 발진기에 의해 움직이는 노즐을 향해 압력을 가한다. 압력 및 발진기의 진동수의 적용에 의해, 노즐의 끝에서 생성되는 물방울의 크기가 조절될 수 있다.
●노즐 끝에 형성된 알지네이트 용액의 방울은 염화칼슘 용액이 순환하는 깔때기 형태로 수집 용기로 떨어진다.
●경화된 알지네이트 비들렛은 깔때기를 통해 염화칼슘 용액과 함께 통과하여 여과기에 수집되고, 수집된 염화칼슘 용액은 적하 장치 아래의 깔때기 안으로 거꾸로 퍼내어 재활용된다.
비들렛을 40 ℃의 배기 공기 온도에 도달할 때까지 80℃의 공급 공기 온도에서 Aeromatic flowbed-dryer 안에서 건조시킨다.
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Claims (13)

  1. 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 미생물로서,
    상기 미생물은 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691)인 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미생물은 약독화된 (attenuated) 또는 사멸된 미생물이고, 바람직하게는 열에 의해 약독화된 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    타액으로부터 유래된 구강 바이오필름의 박테리아 조성을 변화시키기 위한, 바람직하게는 그람-음성 혐기성 속 비율의 감소 및/또는 호기성 또는 통성 혐기성 속 비율의 증가를 위한 생균제로서의 미생물.
  4. 제3항에 있어서,
    박테로이데테스 (Bacteriodetes), 푸조박테리움 (Fusobacterium), 프레보텔라 (Prevotella) 및 피라미도박터 (Pyramidobacter)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 박테리아 비율의 감소 및/또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 및/또는 네이세리아 (Neisseria) 비율의 증가를 위한 미생물.
  5. 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품으로서,
    락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691)를 포함하고,
    상기 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 총 함량은 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 충분하고, 더 바람직하게는 상기 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 총 함량은, 각각의 경우 조성물의 총 중량을 기준으로, 0.01 내지 100 %의 범위, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 %의 범위, 가장 바람직하게는 1 내지 10 %의 범위이며, 및/또는 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 총 함량은 1 x 103 내지 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU)의 범위, 보다 바람직하게는 1 x 105 내지 1 x 1010 CFU의 범위인 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품.
  6. 제5항에 있어서,
    치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 바람직하게는 타액에서 유래되는 바이오필름의 박테리아 조성을 변화시키기 위한 조성물 또는 제품.
  7. 제6항에 있어서,
    그람-음성 혐기성 속 비율의 감소 및/또는 호기성 또는 통성 혐기성 속 비율의 증가를 위한 조성물 또는 제품.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    박테로이데테스 (Bacteriodetes), 푸조박테리움 (Fusobacterium), 프레보텔라 (Prevotella) 및 피라미도박터 (Pyramidobacter)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 박테리아 비율의 감소 및/또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 및/또는 네이세리아 (Neisseria) 비율의 증가를 위한 조성물 또는 제품.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    담체, 부형제 또는 추가 활성 성분으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 조성물 또는 제품.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물 또는 제품은 코팅된 또는 캡슐화된 조성물 또는 제품.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물 또는 제품은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 과립, 파우더 또는 캡슐의 형태인 조성물 또는 제품.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물 또는 제품은 치약, 치아 겔, 치아 파우더, 치아 세정액, 치아 세정폼, 구강 세정제, 구강 스프레이, 치실, 츄잉껌 및 로젠지 (lozenges)로 이루어진 군에서 선택되는 조성물 또는 제품.
  13. 하기 단계를 포함하는 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품의 제조방법:
    - 락토바실러스 파라카제이 LPc-G110과 하나 이상의 추가 성분, 바람직하게는 담체, 부형제 또는 추가 활성성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 결합하는 단계.
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