BR122022006942B1 - Composições compreendendo lactobacillus plantarum - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma cepa bacteriana inovadora, L. plantarum GOS 42 (DSM 32131), preparações isoladas e composições das mesmas; e seu uso em medicamento, especialmente no tratamento e/ou prevenção de inflamação.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma cepa bacteriana inovadora Lactobacillus plantarum Gos 42 (DSM 32131) e composições da mesma para uso como um probiótico. A cepa inovadora tem uso particular em medicamento, especialmente no tratamento e/ou prevenção de inflamação. A cepa inovadora e composições da mesma encontram utilidade particular no tratamento e/ou prevenção de inflamação na cavidade oral, de preferência, para o tratamento e/ou prevenção de gengivite e/ou periodontite.

[0002] Em particular, a cepa inovadora e composições da mesma podem ser usadas como agentes anti-inflamatórios para reduzir ou inibir a liberação de um ou mais fatores inflamatórios selecionados a partir do grupo que consiste em interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator de necrose tumoral (TNF), prostaglandina E2 (PGE2), isoprostanos, metalopeptidase matriz 9 (MMP9) e NF- KB.

[0003] De preferência, a cepa inovadora da invenção é um probiótico, ou seja, um micro-organismo que confere um benefício quando prolifera em um microambiente particular, por exemplo, inibindo ou impedindo a proliferação de outros organismos dentro do mesmo microambiente. Os exemplos de micro-organismos probióticos incluem Lactobacilli que podem colonizar o trato gastrointestinal, pelo menos temporariamente, para deslocar ou destruir organismos patogênicos, assim como fornecer outros benefícios ao hospedeiro.

[0004] Conforme utilizado no presente documento, “probiótico” refere-se a micro-organismos que formam pelo menos uma parte da flora temporária ou endógena e, assim, exibem um efeito profilático e/ou terapêutico benéfico sobre o organismo hospedeiro. Os probióticos são, de modo geral, conhecidos por ser clinicamente seguros (isto é, não patogênicos) por aqueles indivíduos versados na técnica. A título de exemplo, e sem limitação a qualquer mecanismo particular, o efeito profilático e/ou terapêutico de uma bactéria produtora de ácido da presente invenção resulta, em parte, de uma inibição competitiva da proliferação de patógenos devido a: (i) sua capacidade de colonização superior; (ii) parasitismo de micro-organismos indesejáveis; (iii) a produção de ácido (por exemplo, lático, acético e outros compostos ácidos) e/ou outros produtos extracelulares que possuem atividade antimicrobiana; e (iv) várias combinações dos mesmos. Deve-se entender que os produtos e atividades mencionados anteriormente das bactérias produtoras de ácido da presente invenção atuam sinergicamente para produzir o efeito probiótico benéfico revelado no presente documento.

[0005] Preparação purificada ou isolada de uma cepa bacteriana significa que a preparação não contém outra espécie ou cepa bacteriana em uma quantidade suficiente para interferir na replicação da preparação a uma temperatura particular. Uma preparação purificada ou isolada de uma cepa bacteriana é produzida com o uso de métodos-padrão, por exemplo, plaqueamento em seleção de temperatura e diluição limitante.

[0006] As condições inflamatórias das gengivas são principalmente induzidas pela formação de placa dental. As bactérias colonizadoras formam um biofilme na superfície dos dentes auxiliadas pela presença de resíduos de alimento assim como componentes da saliva. Se não forem eliminados suficientemente em um estágio inicial, os filmes de placa na suficiente dos dentes resultam em deposição de cálculos dentais, que é muito difícil de remover. A presença de números elevados de bactérias na margem gengival leva à inflamação da gengiva, conhecida como gengivite. Em indivíduos suscetíveis, a gengivite pode progredir para periodontite, que pode levar à perda de dentes. Em particular, os lipopolissacarídeos (LPS) presentes em bactérias gram-negativas podem causar uma resposta imunológica não específica por macrófagos estimulados por LPS, que liberam prostaglandina E2 (PEG2) e mediadores pró- inflamatórios, tais como interleucinas e TNF-α no tecido afetado. Os mediadores pró-inflamatórios induzem a liberação de outras PGE2s e metaloproteinases matriz (MMPs) dos fibroblastos residentes, que destroem a matriz extracelular do tecido circundante. Isso permite que as bactérias penetrem mais profundamente no tecido e promovam o processo inflamatório independente da camada externa do epitélio e da raiz dental que causa a formação de uma bolsa periodontal. O osso alveolar que sustenta o dente reabsorve as bactérias que avançam, fazendo com que o dente se torne instável e, se deixado não tratado, seja perdido.

[0007] A fim de evitar a destruição progressiva das gengivas, as respostas inflamatórias na cavidade oral precisam ser suprimidas nos estágios iniciais ou, idealmente, prevenidas.

[0008] Muitas abordagens diferentes solucionaram esse problema, variando de métodos aprimorados para a remoção mecânica de placa ao uso de produtos para tratamento oral com fortes propriedades antibacterianas.

[0009] Entretanto, nem todas as bactérias presentes na cavidade oral estão associadas a doenças e muitas ainda promover saúde oral. Portanto, é desejável estabelecer um equilíbrio em relação a uma composição saudável da microbiota bucal em vez de bactérias residentes de erradicação não específica.

[0010] A microbiota oral normal é altamente complexa e inclui mais de 700 espécies bacterianas, assim como arqueas, fungos, protozoários e vírus. Parasitas da gengiva inferior, tais como lactobacilos e bifidobactérias, mostraram ter efeitos benéficos sobre a saúde dos intestinos, incluindo algumas propriedades anti-inflamatórias, quando administrados como probióticos.

[0011] A ação probiótica de bactérias na cavidade oral foi submetida a alguma pesquisa, mas os resultados variam fortemente com a espécie usada e os parâmetros adequados para aplicação eficaz são difíceis de estabelecer devido ao fato de que a ação pode basear-se em efeitos amplamente não relacionados.

[0012] Entre as ações probióticas, os efeitos antibacterianos gerais contra espécies associadas a doenças, a redução ou a prevenção de adesão bacteriana à superfície dos dentes assim como efeitos anti-inflamatórios foram discutidos na literatura.

[0013] Entretanto, pouco é conhecido sobre a influência de cepas probióticas específicas sobre mecanismos inflamatórios, em particular em relação à supressão de mediadores inflamatórios diferentes. Notavelmente, concluiu- se nas investigações extensivas que levaram à presente invenção que algumas cepas de bactérias probióticas conhecidas de modo geral podem também melhorar a liberação de fatores pró-inflamatórios em certas doses. Portanto, permanece uma necessidade não atendida de cepas inovadoras que exibem efeito desejável sobre mediadores pró- inflamatórios e anti-inflamatórios de inflamação.

[0014] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma cepa bacteriana inovadora e composições da mesma que podem ser usadas em medicamento, especialmente no tratamento e/ou na prevenção de inflamação, tal como na cavidade oral, e particular no tratamento e/ou na prevenção de gengivite e/ou periodontite.

[0015] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma cepa bacteriana inovadora e composições da mesma que têm capacidade de reduzir ou inibir a liberação de um ou mais fatores inflamatórios, tais como interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator de necrose tumoral (TNF), prostaglandina E2 (PGE2), isoprostanos, metalopeptidase matriz 9 (MMP9) e NF-KB.

[0016] O objetivo da presente invenção é atingido fornecendo-se a cepa Lactobacillus plantarum GOS 42, que foi depositada por Probi AB de Solvegatan 41, 22370 Lund, Suécia no Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7 B, D-38124 Braunschweig, em conformidade com os requisitos do Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2015 e recebeu o número de acesso de depósito DSM 32131 e composições da mesma.

[0017] A cepa da invenção foi isolada da saliva de voluntários humanos saudáveis e foi selecionada dentre mais de 50 cepas probióticas candidatas, incluindo cepas de Bacillus subtilis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifdobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus LAFTI, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus thermophilus e Lactococcus lactis.

[0018] Por triagens extensivas, a cepa bacteriana de acordo com a invenção foi identificada exibindo atividade de modulação distinta principalmente de uma maneira inibitória enquanto, ao mesmo tempo, não intensifica ou intensifica apenas de modo insignificante a liberação de outros fatores pró-inflamatórios. A presente invenção agora permite um uso otimizado de uma cepa bacteriana probiótica para a prevenção e/ou o tratamento de condições inflamatórias, especialmente aquelas que ocorrem na cavidade oral, o que não era possível anteriormente.

[0019] Conforme explicado acima, a colonização da mucosa oral por bactérias associadas a doenças e a formação de placa pode induzir o equilíbrio microbiano na cavidade oral a um acúmulo de micro-organismos prejudiciais, que é também denominado disbiose. Portanto, o micro-organismo para uso na prevenção e/ou no tratamento de inflamação na cavidade oral de acordo com a invenção inclui o uso na prevenção e/ou no tratamento de placa e placas associadas a doenças e auxilia vantajosamente a evitar disbiose oral equilibrando a flora bucal a um estado saudável.

[0020] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o micro-organismo descrito acima está atenuado ou morto, de preferência, inativado por calor, idealmente por incubação por 2 a 8 minutos a uma temperatura entre 70 e 100 °C.

[0021] Nos estudos descritos abaixo, foi demonstrado que o micro-organismo de acordo com a invenção pode fornecer efeitos inibitórios sobre a liberação de fatores pró- inflamatórios mesmo em um estado inativado. Portanto, é possível usar a cepa inovadora quando a mesma está morta ou inativada por calor. Notavelmente, as cepas inativadas por calor podem mostrar atividade anti-inflamatória igual ou mesmo ligeiramente intensificada em relação a certos fatores.

[0022] Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao micro-organismo mencionado acima para uso como agente anti- inflamatório especialmente para reduzir ou inibir a liberação de um ou mais fatores inflamatórios selecionados a partir do grupo que consiste em interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator de necrose tumoral (TNF), prostaglandina E2 (PGE2), isoprostanos, metalopeptidase matriz 9 (MMP9) e NF-KB.

[0023] De acordo com outro aspecto da presente invenção, os fragmentos da cepa inovadora de microorganismo, conforme definido em qualquer um dos aspectos descritos acima, podem ser usados no tratamento e/ou na prevenção de inflamação, especialmente na cavidade oral, e, de preferência, no tratamento e/ou na prevenção de gengivite e/ou periodontite.

[0024] Pode não ser necessário usar células inteiras da cepa inovadora da invenção visto que misturas que compreendem apenas fragmentos (por exemplo, detritos de células degradadas) dos micro-organismos são suficientes para fornecer os efeitos da invenção.

[0025] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende Lactobacillus plantarum GOS 42 ou fragmentos do mesmo e um carreador, excipiente e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. A quantidade total do micro-organismo ou fragmentos do mesmo é, de preferência, suficiente para tratar e/ou prevenir a inflamação, especialmente na cavidade oral, de preferência para tratar e/ou prevenir gengivite e/ou periodontite. De preferência, a quantidade total do micro-organismo ou fragmentos do mesmo está na faixa de 0,01 a 100%, mais preferencialmente, na faixa de 0,1 a 50%, com máxima preferência, na faixa de 1 a 10%, em cada caso em relação ao peso total da composição, e/ou em que a quantidade total do micro-organismo (micro-organismos) ou os fragmentos do mesmo está na faixa de 1 x 103 a 1 x 1011 unidades de formação de colônia (UFC), mais preferencialmente, na faixa 1 x 105 a 1 x 1010 UFC e, idealmente, de 1 x 108 a 1 x 109 UFC.

[0026] Em uma modalidade preferencial, o microorganismo (bactérias) da invenção está presente em uma composição a uma concentração de aproximadamente 1 x 103 a 1 x 1014 unidades de formação de colônia (UFC) por grama, de preferência, aproximadamente 1 x 105 a 1 x 1012 UFC/grama, enquanto, em outras modalidades, as concentrações são aproximadamente 1 x 109 a 1 x 1013 UFC/grama, aproximadamente 1 x 105 a 1 x 107 UFC/grama ou aproximadamente 1 x 108 a 1 x 109 UFC/grama. Entretanto, será percebido que é mais importante a UFC geral em vez da concentração.

[0027] Em uma modalidade, as bactérias da invenção estão em um carreador farmaceuticamente aceitável ou produto alimentício adequado para administração oral a um mamífero, de preferência, como um suplemento alimentar em pó, uma formulação peletizada ou uma formulação líquida. O mamífero, de preferência, é um ser humano.

[0028] O versado na técnica está ciente de que o organismo probiótico usado em uma composição ou produto de acordo com a invenção representa material biológico cuja atividade pode variar com o lote e depende também do método de processamento ou produção. Portanto, a quantidade adequada pode ser ajustada consequentemente dentro da dada faixa.

[0029] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição ou um produto conforme descrito acima para uso em medicamento, de preferência, no tratamento e/ou na prevenção de inflamação, especialmente na cavidade oral, e, com máxima preferência, para uso no tratamento e/ou na prevenção de gengivite e/ou periodontite.

[0030] Uma composição de acordo com a invenção pode compreende, ainda, um ou mais componentes selecionados a partir do grupo que consiste em carreadores, excipientes ou outros ingredientes ativos, tais como, por exemplo, agentes ativos do grupo de antiflogísticos não esteroides, antibióticos, esteroides, anticorpos anti-TNF-alfa ou outros agentes ativos e/ou substâncias produzidos biotecnologicamente assim como analgésicos, dexpantenol, prednisolona, iodeto de polividona, clorexidina-bis-D- gluconato, hexetidina, HCl de benzidamina, lidocaína, benzocaína, éter laurílico de macrogol, benzocaína em combinação com cloreto de cetidil piridínio ou éter laurílico de macrogol em combinação com hemodialisado sem proteína de sangue de bezerro, assim como, por exemplo, cargas (por exemplo, celulose, carbonato de cálcio), plastificante ou aprimoradores de fluxo (por exemplo, talco, estearato de magnésio), revestimentos (por exemplo, ftalato acetato de polivinila, ftalato de hidroxil propil metil celulose), desintegrantes (por exemplo, amido, polivinilpirrolidona de reticulação), amaciante (por exemplo, citrato de trietila, ftalato de dibutila), substâncias para granulação (lactose, gelatina), retardação (por exemplo, copolimerizados de éster metílico/etílico/2-trimetil aminometílico de ácido poli (met)acrílico em dispersão, copolimerizados de acetato de vinila / ácido crotônico), compactação (por exemplo, celulose microcristalina, lactose), solventes, agentes de suspensão ou dispersão (por exemplo, água, etanol), emulsificantes (por exemplo, álcool cetílico, lecitina), substâncias para modificar as propriedades reológicas (sílica, alginato de sódio), substâncias para estabilização microbiana (por exemplo, cloreto de benzalcônio, sorbato de potássio), conservantes e antioxidantes (por exemplo, DL- alfa-tocoferol, ácido ascórbico), substâncias para modificar pH (ácido láctico, ácido cítrico), agentes de sopro ou gases inertes (por exemplo, hidrocarbonetos clorados fluorados, dióxido de carbono), corantes (óxido de ferro, óxido de titânio), ingredientes básicos para pomada (por exemplo, parafinas, cera de abelhas) e outros conforme descrito na literatura (por exemplo, em Schmidt, Christin. Wirk- und Hilfsstoffe für Rezeptur, Defektur und Groβherstellung. 1999; Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart oder Bauer, Fromming Führer. Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie. 8. Auflage, 2006. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart).

[0031] Uma composição ou um produto de acordo com a presente invenção pode ser também revestido ou encapsulado.

[0032] A encapsulação de uma composição de acordo com a invenção pode ter a vantagem de permitir a liberação controlada, por exemplo, mediante contato com água, ou uma liberação contínua durante um período de tempo prolongado. Além disso, a composição pode ser protegida contra degradação, aprimorando a vida útil do produto. Métodos para encapsulação de ingredientes ativos são bem conhecidos na técnica e diversos materiais de encapsulação, assim como métodos de como aplicar os mesmos a uma composição de acordo com requisitos específicos estão disponíveis.

[0033] Além disso, uma composição ou um produto de acordo com a invenção pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, tabletes, grânulos, pó ou cápsulas.

[0034] A composição ou o produto de acordo com a invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em pasta dental, gel dental, pó dental, líquido de limpeza dos dentes, espuma de limpeza dos dentes, enxaguatório bucal, aspersão bucal, fio dental, goma de mascar e pastilhas.

[0035] Tais composições ou produtos podem conter sistemas abrasivos (componentes abrasivos e/ou de polimento), tais como silicatos, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, óxido de alumínio e/ou hidroxil apatita, tensoativos, tais como, por exemplo, lauril sulfato de sódio, lauril sarcosinato de sódio e/ou cocamidopropil betaína, umectantes, tais como glicerol e/ou sorbitol, agentes espessantes, por exemplo, carboximetilcelulose, polietilenoglicois, carragenas e/ou Laponite®, adoçantes, tal como sacarina, agentes corretores de aroma e sabor para impressões de sabor desagradável, substâncias modificadoras de sabor (por exemplo, fosfato de inositol, nucleotídeos, por exemplo, monofosfato de guanosina, monofosfato de adenosina ou outras substâncias, por exemplo, glutamato de sódio ou ácido 2-fenóxi propiônico), agentes de resfriamento, tais como derivados de mentol (por exemplo, lactato de L-mentila, carbonato de L-mentil alquila, mentona cetais), icilina e derivados de icilina, estabilizantes e agentes ativos, tais como fluoreto de sódio, fosfato de monofluoro sódico, difluoreto de estanho, fluoretos de amônio quaternário, citrato de zinco, sulfato de zinco, pirofosfato de estanho, dicloro de estanho, misturas de diferentes pirofosfatos, triclosano, cloreto de cetil piridínio, lactato de alumínio, citrato de potássio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, cloreto de estrôncio, peróxido de hidrogênio, substâncias de aroma, bicarbonato de sódio e/ou agentes corretores de cheiro.

[0036] As gomas de mascar ou gomas de mascar para cuidado dental podem compreender uma base de goma de mascar que compreende elastômeros, por exemplo, acetato de polivinila (PVA), polietileno, poli-isobutano (peso molecular baixo ou médio) (PIB), polibutadieno, copolímeros de isobuteno/isopreno, éter polivinil etílico (PVE), éter polivinil butílico, copolímeros de ésteres vinílicos e éteres vinílicos, copolímeros de estireno/butadieno (SBR) ou elastômeros de vinila, por exemplo, com base em acetato de vinila/laurato de vinila, acetato de vinila/estearato de vinila ou etileno/acetato de vinila e misturas dos elastômeros mencionados, como, por exemplo, o exemplo descrito nos documentos EP 0 242 325, US 4.518.615, US 5.093.136, US 5.266.336, US 5.601.858 ou US 6.986.709. Adicionalmente, as bases de goma de mascar podem conter outros ingredientes, por exemplo, cargas (minerais), por exemplo, carbonato de cálcio, dióxido de titânio, dióxido de silicone, talco, óxido de alumínio, fosfato dicálcico, fosfato tricálcio, hidróxido de magnésio e misturas dos mesmos, plastificantes (por exemplo, lanolina, ácido esteárico, estearato de sódio, acetato de etila, diacetina (diacetato de glicerol), triacetina (triacetato de glicerol) e citrato de trietila), emulsificantes (por exemplo, fosfatídeos, tais como lecitina e diglicerídeos de ácidos graxos, por exemplo, monoestearato de glicerol), antioxidantes, ceras (por exemplo, ceras de parafina, ceras de candelila, ceras de carnaúba, ceras microcristalinas e ceras de polietileno), gorduras e óleos graxos (por exemplo, gorduras vegetais ou animais endurecidas (hidrogenadas)) e mono, di ou triglicerídeos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[0037] A Figura 1 mostra os efeitos anti-inflamatórios de Lactobacillus plantarum GOS 42 (DSM 32131) em monócitos primários humanos sobre interleucina 1 beta (A), interleucina 6 (B), interleucina 8 (C), prostaglandina E2 (D), fator de necrose tumoral alfa (E) e isoprostano (F). A coluna da esquerda refere-se a células não tratadas, a coluna da direita a células atenuadas.

[0038] A Figura 2 mostra os efeitos anti-inflamatórios de Lactobacillus plantarum GOS 42 (DSM 32131) na forma atenuada sobre interleucina em fibroblastos gengivais humanos. A coluna da esquerda refere-se à interleucina 6, a coluna da direita à interleucina 8.

[0039] Os exemplos a seguir são adicionados para ilustrar a presente invenção sem limitar o escopo.

EXEMPLO 1: ESTABELECIMENTO DO CULTIVO E MANUSEIO DE CEPAS PROBIÓTICAS

[0040] A cepa da invenção foi selecionada dentre mais de 50 cepas probióticas candidatas, incluindo cepas de Bacillus subtilis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifdobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus LAFTI, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus thermophilus e Lactococcus lactis.

[0041] A fim de identificar as condições de proliferação ideais e pontos de colheita e determinar as unidades de formação de colônia (UFC) para as bactérias probióticas a serem triadas, a primeira fase logarítmica e o final da fase de proliferação foram determinados.

PROLIFERAÇÃO BACTERIANA

[0042] Os estoques probióticos congelados (-80 °C) foram descongelados de um dia para o outro a 4 °C e 6 ml de solução estéril de NaCl 9% adicionados a 1,2 ml de bactérias na manhã seguinte. As amostras foram centrifugadas (5 min, 5.000 rpm), o sobrenadante descartado, o pélete lavado com 8 ml de NaCl 9% e, novamente, centrifugado por 5 min a 5.000 rpm. O pélete foi, então, ressuspenso em 1,2 ml de NaCl 9% e 1 ml da amostra adicionada a 50 ml de meio morno a 37 °C (MRS Bouillon, Carl Roth KG, Karlsruhe) e incubado a 37 °C. As incubações foram realizadas em um tubo de polipropileno estéril de 50 ml (Greiner), e sondas foram coletadas em diferentes pontos no tempo para avaliar a curva de crescimento.

DETERMINAÇÃO DE OD

[0043] Para determinação de OD, 500 μl da suspensão bacteriana foram removidos e diluídos em 1 ml de MRS Bouillon em um cadinho PS de 1,5 ml (Brand). A determinação de OD foi realizada a 600 nm (ThermoScientific, Helios Epsilon), 1,5 ml de MRS Bouillon foi usado como branco.

DETERMINAÇÃO DE UFC

[0044] Para determinação de UFC, as bactérias foram diluídas (1:10.000.000, 1:50.000.000 e 1: 100.000.000), colocadas em placas em placas de ágar MRS (MRS Agar, X924, Carl Roth) e incubadas por 2 dias a 37 °C. As colônias cultivadas foram, então, contadas e a UFC foi calculada.

[0045] As bactérias atingiram a fase logarítmica logo no início até 7 a 8 horas quando começaram a atingir a fase de platô. A quantidade de bactérias a serem inoculadas não mudou o formato da curva. 5 horas foram escolhidas como o ponto na fase de proliferação mais íngreme para coletar as bactérias na fase logarítmica e 7 horas para coletar as mesmas ao final da fase logarítmica.

EXEMPLO 2: ESTABELECIMENTO DA ESTIMULAÇÃO DE MONÓCITOS HUMANOS COM PROBIÓTICOS

[0046] A estimulação das culturas celulares de monócitos com a cepa probiótica inovadora foi estabelecida com o uso das cepas obtidas como pó. Em primeiro lugar, foram testadas diversas formas de aplicação, tal como com o uso das bactérias cultivadas (coletadas da fase logarítmica), do sobrenadante das culturas bacterianas cultivadas, aplicação direta do pó dissolvido e do sobrenadante em pó. De acordo com os resultados, as bactérias ao final da fase logarítmica foram testadas com dois lotes da cepa congelada. Em vez de usar sobrenadantes, a inativação por calor dessas duas cepas foi estabelecida e comparou-se as bactérias inativadas com as bactérias ativadas.

MEDIÇÃO DE CITOCINA; MMP-9 E PGE2 EM MONÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS

[0047] Os monócitos primários humanos foram isolados de cremes leucocitários de doadores de sangue humanos saudáveis. As células foram inoculadas em placas de 24 cavidades para experimentos ELISA. As células foram incubadas com LPS por 24 h. Os probióticos (5 doses) foram adicionados 30 min antes do tratamento com LPS. Após 24 h, os sobrenadantes foram removidos, centrifugados e investigados quanto às concentrações de IL-1beta, TNFalfa, IL-6, IL-8, MMP-9, isoprostano-8 e PGE2 em EIAs (PGE2, da AssayDesign, isoprostano, da Cayman) ou ELISAs (todas as citocinas, Immunotools, MMP-9, GE Healthcare) com o uso do protocolo do fabricante. Cada dose foi investigada 2 a 3 vezes em dois cremes leucocitários de 2 doadores diferentes.

[0048] Em primeiro lugar, diferentes tipos de preparações probióticas em pó liofilizado para a estimulação de monócitos humanos foram testados.

[0049] Os probióticos foram coletados e, então, centrifugados. As células foram dissolvidas em meio fresco e aplicadas aos monócitos humanos.

[0050] Os monócitos foram, então, incubados com os probióticos por 30 minutos, então, LPS foi adicionado e, após 24 horas, o sobrenadante foi removido e usado para a determinação dos parâmetros inflamatórios.

EXEMPLO 3: TESTE DE CEPAS INATIVADAS POR AQUECIMENTO ESTABELECIMENTO DE INATIVAÇÃO POR AQUECIMENTO

[0051] A inativação por calor foi estabelecida para dois lotes. Ao final da fase logarítmica de proliferação bacteriana, uma alíquota da suspensão bacteriana foi removida, adicionada a um tubo fresco de 50 ml e incubada por 5 min a 80 °C em um banho de água. 5 minutos a 80 °C inativaram as bactérias e, assim, interromperam sua proliferação.

[0052] Testando-se os lotes inativados por calor da cepa, concluiu-se que os efeitos de intensificação sob IL-1 e TNF não foram afetados por tratamento térmico. Além disso, a ativação térmica não afetou ou afetou apenas ligeiramente a inibição PGE2 por ambas as cepas.

EXEMPLO 4: TRIAGEM DOS PROBIÓTICOS EM MONÓCITOS HUMANOS E EFEITOS SOBRE ATIVAÇÃO DE NF-KAPPAB

[0053] Várias cepas probióticas foram triadas em sua forma ativada e atenuada (forma inativada por calor) em monócitos primários humanos induzidos por LPS (determinando IL-1beta, IL-6, IL-8, TNFalfa, PGE2, 8-isoprostano e MMP-9).

[0054] Um padrão anti-inflamatório típico da cepa inovadora de acordo com os Exemplos 1 a 4 é dado na Figura 1.

[0055] Os experimentos para testar os efeitos sobre a ativação de NF-kappaB induzida por fibroblastos TNFin NIH- 3T3 foram realizados em uma linhagem de células fibroblastos que continha estavelmente transfectado o gene Luciferase por um promotor dependente de NF-kappaB. As células foram estimuladas com TNF na presença ou na ausência dos probióticos. Após 6 h de estimulação, as células foram lisadas e a atividade de luciferase medida em um Luminômetro.

EXEMPLO 5: TRIAGEM DE PROBIÓTICOS SELECIONADOS EM FIBROBLASTOS GENGIVAIS HUMANOS

[0056] A cepa selecionada da invenção foi aplicada a fibroblastos gengivais humanos. As culturas de fibroblasto foram mantidas conforme descrito no protocolo do fabricante. Antes da estimulação, as células foram inoculadas em placas de 24 cavidades para experimentos ELISA. As células foram incubadas sem (controle não estimulado) ou com IL-1beta por 24 h. Os probióticos (5 doses, dependendo do resultado de ensaios de triagem) são adicionados 30 min antes do tratamento com IL-1. Após 24 h, os sobrenadantes foram removidos, centrifugados e investigados quanto às concentrações de IL-6, IL-8, isoprostano e PGE2 em EIA (PGE2, de AssayDesign, isoprostano de Cayman) ou ELISA (IL-6, IL- 8, Immunotools), com o uso do protocolo do fabricante. Cada dose foi investigada pelo menos 2 a 3 vezes. As cepas mostraram alguns efeitos de inibição de IL-6.

[0057] Um padrão anti-inflamatório da cepa de acordo com o Exemplo 5 é dado na Figura 2. EXEMPLO 6: PASTILHA OU COMPRIMIDO PROBIÓTICO

MÉTODO DE PRODUÇÃO:

[0058] • os componentes 1 e 6 são secos em um secante de compartimento a vácuo a 50 °C e uma pressão de no máximo 1 kPa (10 mbar) por 16 horas

[0059] • todos os componentes pesaram exatamente o mesmo que os componentes 1, 2, 3, 4 e 5 combinados e completamente misturados (bloco A). O material probiótico é aplicado na forma liofilizada que tem uma atividade de cerca de 105 a 1012 unidades de formação de colônia (UFC) por grama.

[0060] • o bloco A é subsequentemente adicionado ao componente 6 e misturado completamente por 5 minutos

[0061] • a mistura em pó é prensada em tabletes em uma prensa de tabletes EK0 (Korsch AG, Berlim) a uma pressão ajustada de 15 a 20 kN parâmetros-alvo:

[0062] o diâmetro de tablete: 20 mm

[0063] o peso de tablete: 2,0 g

[0064] • armazenamento à TA em sachês de alumínio vedados. Para 5 pastilhas 1 g de dessecante é usado para desumidificação (ativada por 3 h de armazenamento a 105 °C em um secante de compartimento a vácuo) EXEMPLO 7: DENTIFRÍCIO EM PÓ

MÉTODO DE PRODUÇÃO:

[0065] • o componente 7 é seco em um secante de compartimento a vácuo a 50 °C e uma pressão de no máximo 1 kPa (10 mbar) por 16 horas

[0066] • todos os componentes foram pesados exatamente

[0067] • os componentes 1, 2, 3 e 4 são combinados e misturados completamente juntos (bloco A)

[0068] • os componentes 5 e 6 são, se necessário, combinados e misturados completamente (bloco B). O material probiótico é aplicado na forma liofilizada que tem uma atividade de cerca de 105 a 1012 unidades de formação de colônia (UFC) por grama.

[0069] • os blocos A e B são subsequentemente combinados e misturados completamente juntos

[0070] • a mistura é adicionada ao componente 7 e misturada completamente por 5 minutos

[0071] • a mistura em pó é constituída em porções de 0,5 g cada armazenada à TA juntamente com 1 g de dessecante por porção (ativada por 3 h de armazenamento a 105 °C em um secante de compartimento a vácuo) em sachês de alumínio vedados EXEMPLO 8: DENTIFRÍCIO EM PÓ

MÉTODO DE PRODUÇÃO:

[0072] • os componentes 6, 9 e 10 são secos em um secante de compartimento a vácuo a 50 °C e uma pressão de no máximo 1 kPa (10 mbar) por 16 horas

[0073] • todos os componentes foram pesados exatamente

[0074] • os componentes 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são combinados e misturados completamente juntos (bloco A)

[0075] • os componentes 7 e 8 são combinados e misturados completamente juntos (bloco B) O material probiótico é aplicado na forma liofilizada que tem uma atividade de cerca de 105 a 1012 unidades de formação de colônia (UFC) por grama.

[0076] • os blocos A e B são subsequentemente combinados e misturados completamente juntos

[0077] • os componentes 9 e 10 são combinados e misturados completamente juntos (bloco C)

[0078] • as duas misturas (Bloco A/B e Bloco C) são combinadas e misturas completamente por 5 minutos

[0079] • a mistura em pó é prensada em tabletes em uma prensa de tabletes EK0 (Korsch AG, Berlim) a uma pressão ajustada de 15 a 20 kN parâmetros-alvo

[0080] o diâmetro de tablete: 9 mm

[0081] o peso de tablete: 0,3 g

[0082] • armazenamento à TA em sachês de alumínio vedados. Para 3 tabletes, 1 g de dessecante é usado para desumidificação (ativada por 3 h de armazenamento a 105 °C em um secante de compartimento a vácuo) EXEMPLO 9: GOMA DE MASCAR

MÉTODO DE PRODUÇÃO:

[0083] • o componente 2 é seco em um secante de compartimento a vácuo a 50 °C e uma pressão de no máximo 1 kPa (10 mbar) por 16 horas

[0084] • todos os componentes foram pesados exatamente

[0085] • o componente 1 é temperado a 45 a 59 °C em uma amassadeira de laboratório para goma de mascar com amassamento aquecido até uma massa homogênea ser obtida. O calor ocorre durante todo o processo de mistura

[0086] • os componentes 2,3 e 4 são adicionados subsequentemente e amassados até a mistura ser homogênea e nenhum pó estar visível

[0087] • de acordo com a fórmula, o componente 6 é trabalhado formando o componente 5 (bloco C) ou o componente 7 (bloco D). O material probiótico é aplicado na forma liofilizada que tem uma atividade de cerca de 105 a 1012 unidades de formação de colônia (UFC) por grama. Os componentes são misturados até uma suspensão uniforme ser obtida.

[0088] • Primeiramente, o bloco C é adicionado à massa de goma de mascar e amassado novamente até uma massa homogênea ser obtida.

[0089] • Por fim, o bloco D é processado de modo correspondente. Após a adição, a composição tem que ser amassada até uma massa de goma de mascar uniforme ser obtida.

[0090] • a massa é tirada do misturador e é formada em mini bastões por um rolete de gofragem com o uso de “chapas” de conjunto de gofragem

[0091] • armazenamento à TA em sachês de alumínio vedados. Para 7 gomas de mascar, 1 g de dessecante é usado para desumidificação (ativada por 3 h de armazenamento a 105 °C em um secante de compartimento a vácuo) EXEMPLO 10: MICROESFERAS PROBIÓTICAS

MÉTODO DE PRODUÇÃO:

[0092] Produção do banho de cloreto de cálcio para precipitação das microesferas de alginato:

[0093] • uma solução de cloreto de cálcio 2% é produzida a partir de água destilada e cloreto de cálcio. Toma-se o cuidado de que o CaCl2 seja completamente dissolvido.

[0094] Produção da solução de alginato (em vez de alginato também pectina ou goma gelana pode ser usada):

[0095] • em um vaso de reação com um agitador e que é adequado para o tamanho do lote, água é fornecida

[0096] • o agitador é ligado e, durante agitação em um alto nível, as respectivas quantidades de alginato, goma arábica, fibra de trigo e probiótico assim como a goma gelana opcionalmente necessária são adicionados

[0097] • a mistura é aquecida a 80 °C durante agitação e mantida nessa temperatura por 5 minutos - durante essa etapa os componentes de formação e gel são dissolvidos

[0098] • em seguida, o calor é desligado e a solução de gel quente é adicionalmente agitada por pelo menos 30 minutos até estar sem massas informes

[0099] • subsequentemente, a solução é resfriada por refrigeração a 39 a 43 °C durante agitação

[00100] • em outro vaso, o aroma e o corante são fornecidos se necessário e misturados completamente, no caso de nenhum aroma ser usado, o corante é misturado com glicerol

[00101] • quando a dispersão de corante é misturada homogeneamente, a mesma é adicionada ao vaso de lote com a solução de alginato. O vaso de mistura é lavado diversas vezes com aproximadamente 10% da quantidade de solução de alginato usados de água e adicionados à dispersão

[00102] • a dispersão de alginato é agitada adicionalmente por pelo menos 5 minutos.

[00103] • Subsequentemente, o lote é agitado por mais pelo menos 15 minutos a uma baixa velocidade para remover o ar potencialmente presente.

GOTEJAMENTO DA SOLUÇÃO DE ALGINATO NA SOLUÇÃO DE CLORETO DE CÁLCIO PARA PRECIPITAÇÃO DAS MICROESFERAS:

[00104] • a dispersão de alginato é movida para um vaso de reação estável em pressão hermeticamente vedável que têm duas saídas. Em uma saída, ar pressurizado é aplicado. A segunda saída leva aos bocais da unidade de gotejamento por meio de um tubo.

[00105] • o vaso de reação é temperado sobre uma placa de calor de modo que atinja uma temperatura de aproximadamente 45 °C. A solução é ligeiramente agitada com um agitador de ímã.

[00106] • após aplicação de pressão ao vaso de reação, a solução de alginato é prensada em direção aos bocais, que são ajustados em oscilação por um oscilador. Por adaptação de pressão e da frequência do oscilador, o tamanho das gotas resultantes nas pontas dos bocais pode ser ajustado.

[00107] • As gotas de solução de alginato que se formam nas pontas dos bocais caem em um vaso de coleta na forma de um funil em que a solução de cloreto de cálcio preparada no início circula.

[00108] • as microesferas de alginato passam com a solução de cloreto de cálcio através do funil e são coletadas em uma peneira, a solução de cloreto de cálcio coletada é bombeada de volta para o funil abaixo da unidade de gotejamento e, assim, é reciclada.

[00109] As microesferas são secas em um secante de leito fluido Aeromatic a uma temperatura de ar de abastecimento de 80 °C até uma temperatura de ar de escape de 45 °C ser atingida.

Claims (11)

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o micro-organismo Lactobacillus plantarum GOS 42 (DSM 32131), juntamente com um carreador e/ou excipiente, em que o carreador e/ou excipiente é selecionado do grupo que consiste em plastificantes, melhoradores de fluxo, desintegrantes, amaciantes, substâncias para granulação, substâncias para retardamento, substâncias para compactação, emulsificantes, substâncias para modificar as propriedades reológicas, substâncias para estabilização microbiana, conservantes, antioxidantes, substâncias para modificar o pH, corantes, ingredientes para pomadas, componentes abrasivos e/ou para polimento, tensoativos, umectantes, agentes espessantes, adoçantes, agentes corretores de aroma e sabor, substâncias modificadoras de sabor, agentes refrigerantes, estabilizadores e agentes corretores de cheiro.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o micro-organismo está presente como células vegetativas e/ou esporos.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o micro-organismo está atenuado ou morto.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a quantidade total do micro-organismo está na faixa de 0,1 a 50%, mais preferencialmente na faixa de 1 a 10%, em cada caso em relação ao peso total da composição, e/ou em que a quantidade total do micro-organismo está na faixa de 1 x 103 a 1 x 1011 unidades de formação de colônia (UFC), mais preferencialmente na faixa de 1 x 105 a 1 x1010 UFC.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a quantidade total de micro-organismo está na faixa de 0,1 a 50% em relação ao peso total da composição; e/ou a quantidade total do micro-organismo está na faixa de 1 x 105 a 1 x 1010 UFC.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a quantidade total do micro-organismo está na faixa de 1 a 10% em relação ao peso total da composição; e/ou em que a quantidade total do micro-organismo está na faixa de 1 x 108 a 1 x 109 UFC.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição é revestida ou encapsulada.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição é na forma de uma solução, suspensão, emulsão, tablete, grânulo, pó ou cápsula.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição é selecionada a partir do grupo que consiste em pasta dental, gel dental, pó dental, líquido de limpeza dos dentes, espuma de limpeza dos dentes, enxaguante bucal, spray bucal, fio dental, goma de mascar e pastilha.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um componente de alimento animal e/ou componente de bebida para animais.