TWI505832B - 乳酸菌、其組合物與彼等於治療自體免疫疾病暨其倂發症之用途 - Google Patents

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Description

乳酸菌、其組合物與彼等於治療自體免疫疾 病暨其併發症之用途
本發明是有關於一種乳酸菌株及其應用，特別是有關於一種用於治療自體免疫疾病症狀及其併發症之乳酸菌株及其組合物。
自體免疫性疾病(Autoimmune disease)是一種人體內自己的免疫系統攻擊自己身體正常細胞的疾病，就是正常的免疫能力下降，而異常的免疫能力卻突顯的一種問題。所謂異常的免疫能力，就是認友為敵，把自己身體裡本來不是病毒或細菌的東西，當成病毒或細菌來攻擊，希望將之驅出體外。人體內免疫系統的抗體是保護身體的一種生理機制，原本是針對外來的抗原或體內不正常的細胞(如腫瘤細胞)進行攻擊與清除。但在一些情形下，免疫系統可能會產生出對抗自己身體內正常細胞(甚至細胞內的各種正常組成部份)的抗體，造成不正常的過度發炎反應或是組織傷害，進而影響身體健康造成疾病。
常見的自體免疫疾病包含有：乳糜瀉(Coeliac disease)、1型糖尿病(Type 1 Diabetes mellitus)、系統性紅斑性狼瘡(System Lupus Erythematosus；SLE)、修格連氏症候群或乾燥症候群(Sjögren's syndrome)、多發性硬化症(Multiple sclerosis；MS)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、自發性血小板缺乏紫斑症(idiopathic thrombocytopenic purpura)、類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis；RA)、再生不良性貧血、多發性肌炎及皮肌炎、硬皮症。
紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus；SLE)是一種慢性的全身性自體免疫疾病，會侵犯全身器官或組織，包括皮膚、關節、心臟、血管、肝臟、腎臟、腦部和神經系統。SLE的自然病程多表現為病情的加重與緩解交替，通常無法預知何時發病。任何年齡的人都可能得到紅斑性狼瘡，但它通常發生於年輕女性，有90%的患者是女性。全身性紅斑狼瘡的症狀千奇百怪，每個人均不儘相同。有些人可能一發病便侵犯重要的器官如中樞神經、腎臟、心臟等，也有人終其一生只有輕微關節症狀。以發生的頻率來說，約百分之九十以上的人會關節痛或關節炎，70-80%的患者有皮膚紅斑或盤狀紅斑，40-50%的患者有肋膜炎或心包膜炎，40-50%的患者會發生狼瘡腎炎，20-60%的患者有中樞神經侵犯，約60%的患者有白血球低下，20%的患者有血小板低下。
目前對SLE的致病原因仍不清楚，但認為與遺傳、免疫缺陷、病毒感染、UV及藥物等有關。近來研究發現， SLE病患之肝臟異常(例如肝腫大、脾腫大、黃疸、肝功能不正常、肝臟酵素不正常等)、心血管疾病〔CVD，例如心肌梗塞(MI)〕發生率比正常族群高出許多，並和動脈粥樣硬化有重要關聯。在動物模式研究中也發現SLE鼠會有顯著肝臟及心臟的發炎反應和細胞凋亡。
紅斑性狼瘡目前無法治癒，但它的症狀是可以治療的，藥物是紅斑狼瘡治療非常重要的一環，醫師會根據病情侵犯器官的不同及其嚴重度選擇適當藥物，其中常用來治療紅斑狼瘡的藥物有下列幾種：
(一)非類固醇消炎藥，簡稱NSAID
可用來治療關節炎、肋膜炎等較輕的發炎症狀。NSAID使用最大的問題就是腸胃的副作用，還好最近已經有新一代選擇性的第二型環氧化脢(COX-2)抑制劑上市。胃腸的副作用較傳統的NSAID少得多。
(二)抗瘧藥物
目前最常用的抗瘧藥物是羥基氯喹(hydroxychloroquine；商品名plaquenil)。臨床經驗顯示抗瘧藥物對紅斑狼瘡的皮膚症狀、關節炎及較輕的全身症狀有相當不錯的療效，也可減少狼瘡復發的機率。
(三)腎上腺皮質醇
即一般俗稱之"美國仙丹"或"類固醇"。腎上腺皮質醇是治療紅斑性狼瘡最重要的藥物。在病況嚴重，內臟器官受損時，如狼瘡腎炎、神經系統狼瘡、狼瘡肺炎、溶血性貧血或血小板低下等，必須使用大劑量類固醇，必要時醫師 還會考慮加上大量靜脈注射類固醇脈衝療法，以求能儘快控制病情，待病況控制後再逐漸將劑量減至最低。
(四)免疫抑制藥物
免疫抑制藥主要的作用，是抑制免疫系統的活性，達到控制自體免疫疾病的療效。這一類的藥物通常會和類固醇一起合用，一方面可以減少類固醇的用量，一方面對較頑固的病情也可以得到有效的控制。常用的免疫抑制劑包括移護寧(Imuran® azathioprine)、愛得星(Endoxan®，cyclophosphamide)、環孢靈(Cyclosporine)、氨基甲基嘌呤(methotrexate；MTX)等。
益生菌(probiotics或probiotic bacteria)一般係指源自於人體內、有益於腸道健康的活菌，亦可指外來補充、對身體可能有益的某些微生物，例如乳酸菌(lactic acid bacteria；LAB)和部分酵母菌。人體的免疫系統大約有70%存在於消化道，而早在19世紀末葉，就有俄籍科學家觀察到益生菌具有保健效果。過去研究報告顯示，有1/3以上的SLE病人會有胃腸道症狀，而10%之SLE病人在第一次發病時就有胃腸道病變。目前已知益生菌不僅能恢復腸道菌叢平衡，更具有激發黏膜免疫力、改善腸胃不適及泌尿生殖道菌叢。
近來，有研究嘗試利用乳酸桿菌治療紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus；SLE)。過去的研究顯示，單一乳酸菌可促進抗發炎細胞激素，例如介白素-10(interleukin-10；IL-10)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α；TNF-α)等產生，以治療例如SLE等自體免疫疾病。
然而，上述研究鮮少探討乳酸桿菌是否可應用於治療自體免疫疾病症狀(例如紅斑性狼瘡)及其併發症(如：心臟與肝臟病變)，亦未提出乳酸菌株可能涉及的調控機制。
有鑑於治療自體免疫疾病(例如紅斑性狼瘡)的藥物均有其副作用，且需要病患配合長期治療與控制之慢性疾病，亟需利用本土性的乳酸菌株，開發出可治療自體免疫疾病症狀及其併發症之產品，以同時改善、控制、治療或預防患者之自體免疫疾病(如紅斑性狼瘡等)相關之症狀及相關併發症，進而開發乳酸菌株之其他應用面。
因此，本發明之目的之一是在提供一種具有治療自體免疫疾病及其併發症之活性的乳酸菌屬物種(Lactobacillus sp.)之分離株。
其次，本發明之另一目的提供一種乳酸菌株，其係利用前述菌種之分離株用於製備治療自體免疫疾病症狀及其併發症之醫藥組合物。
再者，本發明之又一目的提供一種乳酸菌組合物，其係含有前述菌種之分離株，藉由經口投予途徑，可治療自體免疫疾病症狀及其併發症。
根據本發明之上述目的，提出一種具有治療自體免疫疾病及其併發症之活性的乳酸菌屬物種(Lactobacillus sp.)之分離株，其中此分離株可包括但不限於至少一者之副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei )GMNL-32(寄存編號為BCRC 910220與CCTCC M 204012)、羅伊氏乳酸桿菌(L.reuteri )GMNL-89(寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154)或羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263(寄存編號為BCRC 910452與CCTCC M 209263)或其任意組合，且上述乳酸菌株已寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，以及中國典型培養物保藏中心(CCTCC)(中國，武漢，武漢大學，430072)。
根據本發明之另一目的，提出一種乳酸菌株用於治療自體免疫疾病症狀及其併發症之醫藥組合物，其中此醫藥組合物包含有效劑量之乳酸菌株以及一藥學上可接受之載體，此乳酸菌株可包括但不限於上述乳酸菌屬物種之分離株之至少一者。
根據本發明之又一目的，提出一種乳酸菌組合物，其中此乳酸菌組合物包含有效劑量之乳酸菌株以及可食性材料，以治療自體免疫疾病及其併發症，其中前述乳酸菌株可包括但不限於上述乳酸菌屬物種之分離株之至少一者。
依據本發明一實施例，上述乳酸菌株用於治療自體免疫疾病症狀及其併發症之醫藥組合物時，菌體可為活的(live)或不活化的(inactive)。其次，上述醫藥組合物更包含藥學上可接受之載體，其可使用習知任何載體，此處不另贅述。在此補充的是，上述乳酸菌株可應用於健康食品、 添加物、醫藥組合物、飲食補充物、食品等日常生活易於使用之形式。在其他例示中，上述乳酸菌株可以是冷凍乾燥之形式，且此乳酸菌株更可包含其他成分，例如葡萄糖、麥芽糊精(maltodextrin)、嬰兒奶粉、果寡糖(fructo-oligosaccharides)、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、優格香料(yogurt spices)、其他難以分離的成分、或其上述之任意組合。再者，上述之乳酸菌株可用以專一性抑制基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9；MMP-9)、C-反應蛋白(C-reactive protein；CRP)、介白素-1 β(interleukin-1 β；IL-1 β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α；TNF-α)、IL-6及誘導型一氧化氮合成酶(inducible NO synthase；iNOS)的活性。
依據本發明一實施例，上述自體免疫疾病可例如紅斑性狼瘡。
應用本發明之乳酸菌屬物種之分離株、含彼之醫藥組合物與乳酸菌組合物用於治療自體免疫疾病症狀及其併發症時，藉由經口投予途徑，可同時專一性抑制自體免疫疾病對象的MMP-9、CRP、IL-1 β、TNF-α、IL-6及iNOS的活性，藉此治療自體免疫疾病引起的併發症(如：心臟與肝臟病變)，從而開發乳酸菌株之其他應用面。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： 第1圖係繪示根據本發明數個實施例之SLE小鼠的肝臟重與體重之重量比的長條圖。
第2A圖、第3A圖、第4A圖、第5A圖、第6A圖、第7A圖以及第8A圖係分別顯示根據本發明數個實施例之SLE小鼠肝臟組織的MMP-9之明膠-SDS-PAGE電泳膠片圖(第2A圖)；CRP(第3A圖)、IL-1 β(第4A圖)、TNF-α(第5A圖)、IL-6(第6A圖)、iNOS(第7A圖)及caspase-3(第8A圖)之西方轉漬法分析照片。
第2B圖、第3B圖、第4B圖、第5B圖、第6B圖、第7B圖及第8B圖係分別繪示根據本發明數個實施例之SLE小鼠肝臟組織的MMP-9/MMP-2(第2B圖)、CRP/actin(第3B圖)、IL-1 β/actin(第4B圖)、TNF-α/actin(第5B圖)、IL-6/actin(第6B圖)、iNOS/actin(第7B圖)及caspase-3/actin(第8B圖)之含量比的長條圖。
第9圖係顯示根據本發明數個實施例之SLE小鼠CD4+ /CD25+ 脾臟Treg細胞之流式細胞分析結果。
第10A圖至第10D圖係顯示根據本發明數個實施例之SLE小鼠心臟組織的麻省三色染色照片。
承前所述，本發明提供一種具有治療自體免疫疾病及其併發症之活性的乳酸菌屬物種(Lactobacillus sp.)之分離株，含彼醫藥組合物與乳酸菌組合物，用於治療自體免疫疾病症狀及其併發症，其中此乳酸菌屬物種之分離株包 含至少一種乳酸菌株，藉由經口投予途徑可同時降低自體免疫疾病症狀及其併發症(如：心臟與肝臟病變)。
本發明此處所稱之「乳酸菌屬物種之分離株」係指乳酸桿菌之分離株，其包含但不限於副乾酪乳酸桿菌(L.paracasei )GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌(L.reuteri )GMNL-89或羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263。前述副乾酪乳酸桿菌GMNL-32已於2003年3月19日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)，寄存編號為BCRC 910220；此菌株亦於2004年2月19日寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection；CCTCC；中國湖北省武漢市武昌珞珈山)，寄存編號為CCTCC M 204012。前述羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89已於2006年11月14日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910340；此菌株亦於2007年11月19日寄存於中國典型培養物保藏中心，寄存編號為CCTCC M 207154。前述羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263已於2009年11月6日寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910452；此菌株亦於2009年11月13日寄存於中國典型培養物保藏中心，寄存編號為CCTCC M 209263。
前述之副乾酪乳酸桿菌GMNL-32(亦稱GM-080)為已公開的菌種(寄存編號為BCRC 910220與CCTCC M 204012)，其相關之菌種特徵已公開於中華民國專利「新穎微生物株副乾酪乳酸桿菌GMNL-32及其治療過敏相關疾 病之用途」(公告號：TW I284149)，以及中華民國專利申請案「益生菌株GM-080用於治療心臟發炎與心臟細胞凋亡之組合物及其用途」(公開號：TW 201210603)。
前述之羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89亦為已公開之菌種(寄存編號為BCRC 910340與CCTCC M 207154)，其相關之菌種特徵已公開於中華民國專利「新穎乳酸桿菌、其組合物、及彼等於改善糖尿病及其併發症之用途」(公告號：TW I340021)，以及中華民國專利「具有抗發炎活性的乳酸桿菌分離株及其用途」(公告號：TW I346554)。
前述之羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263亦為已公開之菌種(寄存編號為BCRC 910452與CCTCC M 209263)，其相關之菌種特徵已公開於中華民國專利「新穎乳酸桿菌、其組合物、及彼等於改善糖尿病及其併發症之用途」(公告號：TW I340021)以及中華民國專利「益生菌株GM-263(ADR-1)用於治療糖尿病引發之腎纖維化的組合物及其用途」(公告號：TW I355939)。
一般而言，上述之乳酸菌株可利用各種習知培養方法獲得分離株。本發明此處所稱之「分離株」，係指前述之乳酸桿菌由單一菌落形成純培養之菌株，實質上並不含其他種類的菌株。
在應用時，上述乳酸菌株用於治療自體免疫疾病症狀及其併發症之醫藥組合物時，菌體可為活的(live)或不活化的(inactive)。其次，上述醫藥組合物更包含藥學上可接受之載體，其可使用習知任何載體，此處不另贅述。在此 補充的是，上述乳酸菌株可應用於健康食品、添加物、醫藥組合物、飲食補充物、食品等日常生活易於使用之形式。在其他例示中，上述乳酸菌株可以是冷凍乾燥之形式，且此乳酸菌株更可包含可食性材料，例如葡萄糖、麥芽糊精(maltodextrin)、嬰兒奶粉、果寡糖(fructo-oligosaccharides)、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、優格香料(yogurt spices)、其他難以分離的成分、或其上述之任意組合。再者，將上述一或多株純培養之乳酸菌株，與藥學上可接受之載體均勻混合，可製備成含有上述乳酸菌株的醫藥組成物。前述醫藥組合物之劑型可包括但不限於溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿、膠囊或上述之任意組合。前述醫藥組成物進一步藉由具有自體免疫疾病的動物模式(例如SLE小鼠)之分析後，證明可治療、緩和、控制、改善及/或預防自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變及其相關併發症。
申言之，本發明此處所稱治療及改善自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變及其相關併發症，係指含有上述乳酸菌株的醫藥組成物，藉由經口投予途徑，例如以每天總菌量為每公克約1×106 至約1×1011 菌落形成單位(colony-forming unit；CFU)(CFU/g)，連續經口投予至少12週，病患不僅於日常生活中易於使用，更可治療、緩和、控制、改善及/或預防自體免疫疾病(例如紅斑性狼瘡)引起動物體內與肝臟病變相關之蛋白質的表現(例如專一性抑 制MMP-9、CRP、IL-1 β、TNF-α、IL-6及iNOS等的活性)，同時治療、緩和、控制、改善及/或預防自體免疫疾病引起心臟病變相關之症狀(例如恢復心臟重量、減少心肌細胞之間的間隙等)。
以下利用數個實施例說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例一：動物評估模式的建立 1. 乳酸菌株之製備
此實施例係利用副乾酪乳酸桿菌GMNL-32(寄存編號為BCRC 910220)、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89(寄存編號為BCRC 910340)或羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263(寄存編號為BCRC 910452)，進行SLE動物實驗，以評估上述乳酸菌株藉由經口投予途徑治療紅斑性狼瘡引起的心臟與肝臟病變之效果。
上述三株乳酸菌株之每天總菌量可分別為每公克約1×109 CFU/g。上述三株乳酸菌株可以是冷凍乾燥之形式，並可包含其他成分，例如葡萄糖、麥芽糊精、嬰兒奶粉、果寡糖、硬脂酸鎂、優格香料、其他難以分離的成分、或其上述之任意組合。
2. SLE動物試驗模式的建立
此實施例之SLE小鼠係以紐西蘭黑白小鼠雜交第 一代(NZB/W F1)雌性小鼠(Jackson Lab，美國)為例，建立SLE動物試驗模式。首先，將SLE小鼠隨機分成3組實驗組及1組對照組，其中每組各為14週齡SLE小鼠8隻。實驗組之SLE小鼠每天餵食含不同乳酸菌株(分別為副乾酪乳酸桿菌GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89或羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263，每頭餵食約1×109 CFU/g)的飼料。對照組之SLE小鼠每天餵食含與上述乳酸菌株等重量的去離子水之基本飼料。
SLE小鼠之飼養溫度為於25±1℃、相對溼度為65±5%、並維持於12小時切換之光暗循環，以標準實驗室等級的飼料餵食，飼養期間不限制飼料及水的供應。SLE小鼠的飼養條件均依循國家衛生研究院公告的相關實驗動物管理指南進行。
所有SLE小鼠在餵食12週後秤重、犧牲後，取出肝臟、心臟及冠狀動脈並以蒸餾水清洗，分開左右心房與左右心室再進行秤重及後續分析。
3. 肝臟組織的萃取
將前述SLE小鼠肝臟置於溶解緩衝溶液(lysis buffer)中，以100mg組織/1mL溶解緩衝溶液之比例，進行約1分鐘，以均質化(homogenize)肝臟組織，進而溶解出肝臟細胞(hepatocytes)內的蛋白質。前述之溶解緩衝溶液可包含20mM的三羥甲基胺基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane；Tris)溶液、2mM的乙烯二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)、50mM的2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、10%的甘油、蛋白質酶抑制劑(proteinase inhibitor；Roche)、磷酸酶抑制劑混合液(phosphatase inhibitor cocktail；sigma)，pH 7.4。之後，所得之均質漿(homogenate)置於冰上約10分鐘，再以約12000×g之離心力離心40分鐘，共離心兩次。然後，取上清液並存放於-80℃，以於後續進行相關評估。
4. 西方轉漬法(Western blot)
此實施例係利用電泳分析與西方轉漬法(Western blot)評估上述三株乳酸菌株對於治療SLE引起的肝臟病變的效果。以下分述之。
將上述所得之上清液，利用10%之硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳分析(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)，以85伏特、3.5小時進行電泳。之後，將電泳膠片取下，於含有192mM的甘胺(glycine)與20%(v/v)的甲醇之25mM的Tris-HCl溶液(pH 8.3)平衡15分鐘。上述SDS-PAGE之製備及其相關設備應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。
前述SDS-PAGE之電泳膠，可接著進行西方轉漬法分析(Western blotting assay)。在此實施例中，利用西方轉漬套組，例如Bio-Rad Scientific Instruments Transfer Unit)，以85伏特、2.5小時，將前述電泳膠的蛋白質轉印 到轉印膜，其中轉印膜例如可為聚偏二氟乙烯轉印膜(polyvinylidene difluoride membrane，PVDF membrane；孔徑0.45m；Millipore,Bedford,MA,U.S.A.)。之後，加入5%脫脂奶粉溶於TBS緩衝液(Tris-Base、NaCl、Tween-20，pH 7.4)中作為Blocking溶液，於室溫約1小時後，加入一級抗體(first antibody)(以抗體結合溶液稀釋500倍，抗體結合溶液之配方後述)，於4℃反應至隔天。然後，以TBS緩衝液清洗三次，每次10分鐘。隨後，加入以TBS緩衝液稀釋500倍的二級抗體(secondary antibody)，於37℃反應1小時後，以TBS緩衝液清洗三次，每次10分鐘。而後，加入冷光呈色劑，例如增強型化學冷光(Enhanced ChemiLuminescence；ECL)西方轉漬光敏反應試劑(Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,USA)，並利用冷光螢光分析儀系統(GE LAS-4000,GE Healthcare Life Sciences Inc.,USA)分析判讀結果。
前述使用的一級抗體例如可針對CRP(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)、IL-1 β(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)、TNF-α(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)、IL-6(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)及iNOS(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)之單株抗體。前述使用的二級抗體例如可為結合山葵過氧化酶的山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG-HRP)、結合山葵過氧化酶的山羊抗兔IgG(goat anti-rabbit IgG-HRP)、或結合山葵過氧化酶的驢 抗山羊IgG (donkey anti-goat IgG-HRP)(以上產品出自Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Texas,USA)。
5. 明膠蛋白酵素電泳法(Gelatin Zymography Protease Assay)
將上述所得之肝臟上清液，進行下列基質金屬蛋白質酶活性測試。上述肝臟上清液注入含明膠(0.1%)之SDS-PAGE(8%)，以100-120伏特、進行電泳3-4小時。然後，將電泳膠片取下，於2.5%之Triton X-100溶液中搖晃沖洗30分鐘一至二次，使蛋白酵素功能還原。上述明膠-SDS-PAGE之製備及其相關設備應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。
之後，將上述電泳膠片置於含有40mM的Tris-HCl(pH 8.0)、10mM CaCl2 與0.01%NaN3 的溶液中，於37℃反應16小時。隨後，再以0.25%的考馬斯亮藍R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250；Sigma-Aldrich Inc.USA)染色30分鐘，再以脫色溶液(含有875mL dH2O、50mL甲醇以及75mL醋酸)進行脫色。所得電泳膠片上的血清MMP-9(約92kDa)、血清MMP-2(約62kDa)之色帶，利用市售的影像分析軟體/設備，例如光密度測定儀(densitometer；Appraise,Beckman-Coulter,Brea,CA,USA)，測量其色帶濃度後，計算出MMP-9/MMP-2之含量比。
上述實驗例所得之數據皆以平均值±平均標準誤差(mean±standard error of mean)表示，並利用SAS 9.1版進行分析，並以Tukey型多重比較檢定法(Tukey-type multiple comparison test)以t 化殘差(studentized)比較各組間差異顯著性，其中圖號＊表示各實驗組相較於對照組間具有差異顯著性(p <0.05)。
6. 免疫組織染色法(Immunohistochemistry,IHC)
將利用較佳化切片溫度(optimal cutting temperature；OCT)包埋劑包埋好的組織，以市售冷凍切片機切成5μm厚的組織切片，將切片附著於玻片上(此玻片可貯存於-20℃下)。接著，利用麻省三色(Masson Trichrome；Sigma-Aldrich Inc.USA)染色觀察，或以α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體進行間接免疫染色觀察，藉此觀察心臟組織及細胞的形態結構是否產生變化。上述之OCT包埋、組織切片、麻省三色等應為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，此處不再贅述。
實施例二：評估乳酸菌株對於治療SLE引起的肝臟病變之功效 1. 評估乳酸菌株對於SLE動物肝臟重量的影響
實施例一之SLE小鼠經餵食去離子水(對照組)、副乾酪乳酸桿菌GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89及羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263，餵食12週後，其肝臟重與體重 的結果如第1表所示，而肝臟重與體重之重量比的結果則如第1表以及第1圖所示。
請參閱第1表與第1圖，其中第1表係顯示根據本發明一實施例之SLE小鼠肝臟重(mg)、體重(g)以及肝臟重與體重之重量比的結果，而第1圖則繪示根據本發明數個實施例SLE小鼠的肝臟重與體重之重量比的長條圖，且第1表與第1圖之p <0.05。
由第1表與第1圖之結果可知，餵食不同乳酸菌株(分別為副乾酪乳酸桿菌GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89或羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263)之實驗組SLE小鼠的肝臟重與體重之重量比，與餵食含去離子水之基本飼料的對照組SLE小鼠相較，在統計學上並未無顯著差異。代表餵食上述乳酸菌株並不會對肝臟重與體重造成顯著影響。
2. 評估乳酸菌株對於SLE動物肝臟組織之MMP-9、CRP、IL-1 β、TNF-α、IL-6、iNOS及caspase-3表現量的影響
請參閱第2A圖、第3A圖、第4A圖、第5A圖、 第6A圖、第7A圖以及第8A圖，其係分別顯示根據本發明數個實施例之SLE小鼠肝臟組織的MMP-9之明膠-SDS-PAGE電泳膠片圖(第2A圖)；CRP(第3A圖)、IL-1 β(第4A圖)、TNF-α(第5A圖)、IL-6(第6A圖)、iNOS(第7A圖)及caspase-3(第8A圖)之西方轉漬法分析照片。
在第2A圖中，第1道代表市售蛋白質標記，第2-4道代表對照組，第5-7道代表餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32之實驗組，第8-10道代表餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89之實驗組，第10-13道代表餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之實驗組，並以MMP-2之表現量為內部控制(internal control)組。
在第3A圖、第4A圖、第5A圖、第6A圖、第7A圖以及第8A圖中，第1-3道代表對照組，第4-6道代表餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32之實驗組，第8-10道代表餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89之實驗組，第10-13道代表餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之實驗組，並以肌動蛋白(actin)之表現量為內部控制組。
另外，請同時參閱第2B圖、第3B圖、第4B圖、第5B圖、第6B圖、第7B圖及第8B圖，其係分別繪示根據本發明數個實施例之SLE小鼠肝臟組織的MMP-9/MMP-2(第2B圖)、CRP/actin(第3B圖)、IL-1 β/actin(第4B圖)、TNF-α/actin(第5B圖)、IL-6/actin(第6B圖)、iNOS/actin(第7B圖)及caspase-3/actin(第8B圖)之含量比的長條圖。
由第2A圖至第8B圖之結果可知，相較於餵食含去離子水之基本飼料的對照組SLE小鼠，餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之實驗組SLE小鼠，確實可有效降低其肝臟的發炎指標(例如血清MMP-9、CRP、IL-1 β、TNF-α、IL-6等)以及細胞凋亡(例如caspase-3)之含量。
實施例三：評估乳酸菌株對於CD4 + /CD25 + 脾臟調節型T(Treg)細胞之功效
將實施例一各組SLE小鼠之脾臟切成小塊後，浸於HB SS水溶液(1g/10mL)以及去氧核糖核酸酶I(Life Technologies,Inc.,USA)，於37℃反應15分鐘。上述HBSS水溶液含有膠原酶I型(0.05mg/mL)、膠原酶IV型(0.05mg/ml)、hyauronidase(0.025mg/ml)以及大豆胰蛋白酶抑制劑(1mg/ml；Life Technologies,Inc.,USA)。接著，利用離心收集細胞後，重新懸浮於HBSS分解溶液(digestion solution)中，於37℃反應15分鐘。然後，利用過濾移除未分解的組織塊，其餘的脾臟細胞以RPMI 1640培養液清洗。之後，利用Ficoll-Paque梯度來分離清洗後之脾臟細胞，以移除死細胞。
所得之細胞進行細胞測量分析。以直接共軛抗體將上述細胞的表面標記染色，上述直接共軛抗體為：異硫氰酸鹽(FITC)共軛anti-CD4+ 單株抗體、anti-CD25+ 單株抗體(BioLegen Inc.,CA,USA)。在表面染色之後，根據供應商 的操作手冊將細胞固定後，利用流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA,USA)分析其螢光強度，其結果如第9圖所示。
請參閱第9圖，其係顯示根據本發明數個實施例之SLE小鼠CD4+ /CD25+ 脾臟Treg細胞之流式細胞分析結果，其中左上角的方格顯示對照組之結果，左下角的方格顯示餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32之實驗組的結果，右上角的方格顯示餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89之實驗組的結果，而右下角的方格為餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之實驗組的結果。
由第9圖之結果可知，餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之實驗組SLE小鼠，可有效提升其CD4+ /CD25+ 脾臟Treg細胞之比例。
實施例四：評估乳酸菌株對於SLE動物心臟的影響 1. 評估乳酸菌株對於SLE動物心臟重量的影響
實施例一之對照組與實驗組SLE小鼠經餵食去離子水(對照組)或不同乳酸菌株(副乾酪乳酸桿菌GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263)12週後，其心臟重、左心室重、體重與脛骨長的相關結果如第2表所示。
由第2表之結果可知，相較於對照組SLE小鼠，餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之SLE小鼠，確實可增加其心臟重、左心室重、體重與脛骨長。
2. 評估乳酸菌株對於SLE動物心臟組織及細胞的形態結構的影響
請參閱第10A圖至第10D圖，其係顯示根據本發明數個實施例之SLE小鼠心臟組織的麻省三色染色照片，其中第10A圖代表對照組，第10B圖代表餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32之實驗組，第10C圖代表餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89之實驗組，第10D圖代表餵食羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263之實驗組。
由第10A圖至第10D圖之結果可知，相較於對照 組SLE小鼠(第10A圖)，餵食副乾酪乳酸桿菌GMNL-32(第10B圖)、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-89(第10C圖)、羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263(第10D圖)之SLE小鼠，確實可縮小心臟細胞之間的間隙。
需補充的是，本發明雖以特定的菌株、特定的分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明的乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物亦可使用其他分析方法或儀器進行。
由上述本發明實施例可知，本發明的乳酸菌屬分離株、含彼醫藥組合物與乳酸菌組合物用於治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變時，其優點在於上述乳酸菌株本身具有多種有益功能且無副作用，藉由經口投予途徑可方便病患在日常生活中易於使用，進而治療、緩和、控制、改善及/或預防自體免疫疾病(例如紅斑性狼瘡)相關症狀及引起的相關併發症(例如心臟與肝臟病變)，從而開發乳酸菌株之其他應用面。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範 圍所界定者為準。

Claims (6)

  1. 一種乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含一有效劑量之該乳酸菌株以及一藥學上可接受之載體，該乳酸菌株為副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei )GMNL-32(寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2003年3月19日，寄存編號為BCRC 910220)、羅伊氏乳酸桿菌(L.reuteri )GMNL-89(寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2006年11月14日，寄存編號為BCRC 910340)或羅伊氏乳酸桿菌GMNL-263(寄存於台灣新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2009年11月6日，寄存編號為BCRC 910452)，以降低肝臟發炎、肝細胞凋亡且縮小心臟細胞之間的間隙。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物之用途，其中該乳酸菌株為活的及/或經不活化的。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物之用途，其中該乳酸菌株用於專一性抑制一肝細胞之基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9；MMP-9)、C-反應蛋白(C-reactive protein；CRP)、介白素-1 β(interleukin-1 β；IL-1 β)、IL-6、誘導型一氧化氮合成酶(inducible NO synthase； iNOS)及caspase-3的活性。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物之用途，其中該自體免疫疾病為紅斑性狼瘡。
  5. 根據申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物之一投予途徑為一經口投予途徑。
  6. 根據申請專利範圍第1項所述之乳酸菌株用於製備治療自體免疫疾病引起的心臟與肝臟病變之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物之一劑型是選自於由一溶液、一懸浮液、一乳劑、一粉末、一錠劑、一丸劑、一糖漿、一口含錠、一片劑、一口嚼膠、一濃漿以及一膠囊所組成之一族群。
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