KR20180102655A - 구강 내 항-염증제로서 프로바이오틱스의 용도 - Google Patents

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마르커스 루돌프 괴츠
커스틴 홈그렌
니클라스 라르손
베른트 피에비흐
윌리엄 웨이드
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시므라이즈 아게
프로비 에이비
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Abstract

본 발명은 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방을 위한, 특히 치아 우식증 및/또는 치주 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 특정 미생물들 또는 이들의 혼합물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 특정 염증 인자들의 방출을 감소하거나 또는 억제하기 위한 구강 내 항-염증제로서의 미생물들 또는 이들의 혼합물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 생균제로서의 미생물을 하나 이상 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품, 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품뿐만 아니라 이들의 제조방법을 제공한다.

Description

구강 내 항-염증제로서 프로바이오틱스의 용도
본 발명은 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방을 위한, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방을 위한 특정 미생물 또는 이들의 혼합물에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 종양 괴사 인자 (TNF), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 아이소프로스탄 (isoprostanes), 기질 금속단백질분해효소 9 (MMP9) 및 NF-κB로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염증 인자의 방출을 감소 또는 억제하기 위한 구강 내 항-염증제로서의 미생물 또는 이들의 혼합물에 관한 것이다.
나아가, 본 발명은 활성 성분으로서 하나 이상의 항-염증 미생물을 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품뿐만 아니라 이들의 제조 방법을 제공한다.
잇몸의 염증 증상은 주로 치아 플라크의 형성에 의해 유발된다. 군집 박테리아 (Colonizing bacteria)는 타액 성분뿐만 아니라 음식 잔여물의 존재에 의해 치아의 표면에 바이오필름을 형성한다. 만일 초기 단계에서 충분히 제거하지 않는다면, 치아 표면의 플라크 막은 제거하기가 매우 어려운 치석을 침착하게 한다. 치은연 (gingival margin)에서 박테리아의 수 증가는 치은염 (gingivitis)으로 알려진 잇몸의 염증으로 이어진다. 민감한 개체들에서, 치은염은 치아 손실로 이어질 수 있는 치주염 (periodontitis)으로 진행될 수 있다. 특히, 그람-음성 박테리아에 존재하는 리포폴리사카라이드 (LPS)는, 작용 조직 (affected tissue)에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 및 인터류킨과 TNF-α와 같은 전-염증성 매개체 (pro-inflammatory mediators)를 방출하는 LPS-자극 대식세포들에 의한 비-특이적인 염증 반응의 원인일 수 있다. 전-염증성 매개체는 주변 조직의 세포외 기질을 파괴하는, 잔존하는 섬유아세포에서 추가적인 PGE2와 기질 금속단백분해효소 (MMPs)의 방출을 유도한다. 이것은 박테리아가 조직에 깊숙이 침투하게 하고, 상피의 외층과 치주 포켓 (periodontal pocket)을 형성하는 치근의 독립적인 염증 과정을 촉진하게 한다. 치아를 지탱하는 치조골 (alveolar bone)은 전진하는 박테리아 (advancing bacteria)보다 이를 먼저 재흡수하여 치아를 불안정하게 하고, 치료를 받지 않는다면 치아를 잃게 된다.
진행중인 잇몸의 파괴를 피하기 위해, 구강 내 염증 반응은 초기 단계에서 억제되거나 이상적으로 예방되어야 한다.
플라크와 치석의 물리적인 제거를 위한 개선된 방법부터 강력한 항균력을 갖는 구강 관리 제품의 사용에 이르는 여러 가지 접근들이 이 문제를 다루어왔다.
그러나, 구강 내 존재하는 모든 박테리아가 질병과 관련되어 있는 것은 아니며, 많은 박테리아들은 심지어 구강 건강을 장려한다. 그러므로, 구강 내 살고있는 박테리아를 비-특이적으로 제거하는 대신 구강 미생물총 (microbiota)의 건강한 조성을 위해 균형을 이루는 것이 바람직하다.
정상적인 구강 미생물총은 매우 복잡하며, 고세균, 진균류, 원생동물 및 바이러스뿐만 아니라 700종 이상의 박테리아를 포함한다. 락토바실리 (Lactobacilli) 및 비피도박테리아 (Bifidobacteria)와 같은 소화관 공생 생물의 감소는 프로바이오틱스로서 섭취될 때 항-염증성을 포함한 소화관 건강에 대해 유익한 효과를 보여주었다.
구강 내 박테리아의 프로바이오틱 작용은 몇몇 연구의 대상이 되어 왔지만 종 간 크게 변화하는 것으로 밝혀졌으며 크게 관련이 없는 영향에 의존할 수 있기 때문에 효과적인 적용을 위한 적절한 파라미터 (parameter)를 확립하기가 어렵다.
프로바이오틱 작용 중에서, 질병-관련 종들에 대한 일반적인 항-박테리아 효과, 치아 표면의 박테리아 부착의 감소 또는 예방뿐만 아니라 항염증 효과는 문헌에서 논의되어 왔다.
WO 2010/077795 A2는 스트렙토코시 (Streptococci) 및 락토바실리 (Lactobacilli)의 특정 균주로부터 선택된 치료적 유효량의 유익한 박테리아를 포함하는 구강 건강의 개선을 위한 조성물에 관한 것이다. WO 2010/077795 A2가 주로 흡인성 폐렴의 발병 감소와 관련있는 반면, 유익한 박테리아 쪽으로 구강 세균총 (flora)의 균형을 유지함으로써 치은염과 플라크를 예방할 수 있다고 언급되어 있고 이는 일반적으로 프로바이오틱스가 전신 염증 (systemic inflammation)을 매개하는 수용체 신호 부위 (receptor signaling site)와 경쟁할 수 있다고 언급되어 있다. 그러나, 이런 특성은 특히 다른 염증 인자들에 대해서는 더 이상 논의되지 않았으며, 이러한 효과는 기술된 박테리아 균주에 대해 평가되지 않았다.
DE 20 2009 011 370 U1에 따르면 프로바이오틱스를 함유하는 치아 및 구강 관리 제품은 치은염 및 치주염을 예방할 수 있는 것으로 기술되어 있으며, 락토바실리 (lactobacilli), 비피도박테리아 (bifidobacteria), 엔테로코시 (enterococci), 스포로락토바실리 (sporolactobacilli) 및 스트렙토코시 (streptococci)를 포함하는 다양한 프로바이오틱 박테리아를 나열하고 있다. 그러나, 구체적인 균주들은 언급되지 않았으며, 더 나아가 주장하고 있는 프로바이오틱 작용은 평가되어 있지 않다.
염증 질환을 감소/예방하기 위한 락토바실리, 비피도박테리아 또는 스트렙토코시와 같은 프로바이오틱스를 투여하는 방법은 US 2008/0241226A1에 개시되어 있다.
WO 2010/008879 A2는 물과 접촉하면 활성화될 수 있는 불활성의 프로바이오틱을 포함하는 제과 조성물을 제공한다. 프로바이오틱스로서, 락토바실리 및 비피도박테리아의 각각 다른 균주들이 개시되어 있다. WO 2010/008879 A2에 언급되어 있는 프로바이오틱 효과는 예를 들어 병원성 박테리아의 억제에 의한 잇몸 염증의 감소를 포함한다.
프로바이오틱 균주 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus) GG, ATCC 53103에 의한 구강 및 치아 건강의 개선은 US 20040101495에 개시되어 있다. 이와 관련하여, 면역계에 대한 프로바이오틱스의 자극 효과가 개시되어 있다.
전-염증성 (pro-inflammatory) 및 항-염증성 (anti-inflammatory) 사이토카인의 균형을 변화시키기 위한 프로바이오틱 박테리아의 능력은 WO 2012/022773 A1에 언급되어 있으며, 여기서 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) ATCC 55730은 잇몸의 열구전색액 (crevicular fluid)에서 염증 매개체 (inflammatory mediators)의 수준에 영향을 미침으로써 치은염을 감소시킬 수 있는 것으로 개시되어 있다. 그러나 WO 2012/022773 A1은 특정 병원균에 대한 항-박테리아 특성을 갖는 것으로 입증된, 유효량의 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) CECT 7481 및 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) CECT 7480을 포함하는 구강 건강을 위한 프로바이오틱 조성물과 주로 관련이 있다.
요약하자면, 구강 내 염증 반응, 특히 다른 염증 매개체의 억제와 관련된 구체적인 프로바이오틱 균주의 영향에 대해 알려진 것은 거의 없다. 놀랍게도, 본 발명에 이르는 광범위한 연구에서 밝혀진 바에 따르면, 보편적으로 알려진 프로바이오틱 박테리아의 몇몇 균주는 특정 투여량에서 전-염증성 인자의 방출 또한 증가시킬 수 있다. 그러므로, 프로바이오틱 구강 관리 제품의 조성은 적용을 위한 유익한 효과를 최적화하기 위해 (상업적으로) 이용가능한 균주의 전- 및 항-염증성 효과에 대한 상세한 연구가 여전히 요구된다.
본 발명의 목적은 구강 내 염증의 매우 효과적인 치료 및/또는 예방, 특히 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있는 미생물 또는 이들의 혼합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 종양 괴사 인자 (TNF), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 아이소프로스탄 (isoprostanes), 기질 금속단백질분해효소 9 (MMP9) 및 NF-κB와 같은 하나 이상의 염증 인자의 방출을 감소하거나 억제할 수 있는 미생물 또는 이들의 혼합물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 미생물을 전달하기 위한 구강 관리 조성물 또는 제품과 상기 조성물 또는 제품의 제조방법 또한 제공된다.
본 발명의 목적은 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방을 위한, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방을 위한 미생물 또는 둘 이상의 미생물을 포함하거나 또는 이루어지는 혼합물에 의해 충족되며,
상기 미생물(들)은 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) LL-G41 (CCTCC M 2016652), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313) 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) NS9 (NCIMB 8823)으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
광범위한 스크리닝에 의해, 본 발명에 따른 박테리아 균주는 특정한 전-염증성 인자의 방출에 대해 주로 부정적으로 뚜렷한 조절 활성을 보이는 반면, 동시에, 다른 전-염증성 인자의 방출은 무시해도 될 정도로 증가시키거나 또는 증가시키지 않는다. 선행기술은 특정한 전-염증성 인자의 억제 및 다른 것들의 강화와 관련하여 다른 박테리아 균주의 효능을 평가하지 않았으며, 단지 일반적으로 전-염증성 및 항-염증성 사이토카인의 균형에 대한 유익한 효과를 언급하고 있다. 본 발명은 이전에는 불가능했던 구강 내 염증 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 상업적으로 이용가능한 프로바이오틱 박테리아 균주의 최적화된 사용을 가능하게 한다.
락토바실러스 파라카제이 LPc-G110 균주는 부다페스트 조약 하에 중국, 우한 430072, 우한 대학교의 CCTCC (China Center for Type Culture Collection) 에 수탁번호 CCTCC M 2013691 (BioGrowing Co., Ltd., No.10666 Songze Rd., Qingpu Shanghai 201700, China)로 2013년 12월 23일에 기탁되었고, 락토바실러스 플란타룸 GOS 42 균주는 부다페스트 조약 하에 독일, 38124 Braunschweig, Inhoffenstr. 7B, 독일생물자원센터 (Leibniz Institut Deutsche Sammlung f
Figure pct00001
r Mirkoorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)에 수탁번호 DSM 32131 (Probi AB)로 2015년 9월 2일에 기탁되었다. 락토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스 LL-G41 균주는 부다페스트 조약 하에 중국, 우한 430072, 우한 대학교의 CCTCC (China Center for Type Culture Collection) 에 수탁번호 CCTCC M 2016652 (BioGrowing Co., Ltd., No.10666 Songze Rd., Qingpu Shanghai 201700, China)로 2016년 11월 17일에 기탁되었고, 락토바실러스 플란타룸 Heal19 균주는 부다페스트 조약 하에 독일, 38124 Braunschweig, Inhoffenstr. 7B, 독일생물자원센터 (Leibniz Institut Deutsche Sammlung fur Mirkoorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)에 수탁번호 DSM 15313 (Probi AB)으로 2002년 11월 27일에 기탁되었다. 락토바실러스 파라카제이 NS9 균주는 NCIMB (National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdom)에서 수탁번호 NCIMB 8823 (1956년 10월 1일의 날짜로 버밍엄 대학교에 의해 기탁됨)으로 공적으로 이용가능하다.
바람직한 항-염증성 프로바이오틱스 및 프로바이오틱 재료는 순차적 실험 (sequential testing)에서 그 효과를 보여주며, 상기 실험은 인간 1차 단핵구에서 그 항-염증 효과가 결정되고 - 기대되는 경우 - 섬유아세포 내 항-염증 효과를 평가함으로써 검증된다. 즉, 염증 파라미터로서, 인터류킨 1-β (IL-1-beta), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 종양 괴사 인자α (TNFalpha), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 8-아이소프로스탄 (8-isoprostanes) 및 기질 금속단백질분해효소 9 (MMP9)는, PGE2, IL-6, IL-8, 8-아이소프로스탄 및 NF-
Figure pct00002
B 활성화가 인간 잇몸 섬유아세포 내에서 검출되는 동안, 인간 1차 단핵구에서 검출되었다.
락토바실러스 플란타룸 Heal19는 항-염증 반응의 조절을 위한 강력한 물질 (potent agent)로서 선별되었다. 검증된 1차 인간 단핵구 모델에서, 이것은 선택된 바이오마커들의 발현을 현저하게 하향 조절하였다. 이 균주에 의해 약화된 주요 조절물 (key regulators)은 다음과 같다: 급성기 단백질 (acute phase proteins)의 분비 증가에서 나타나는 초기 염증의 자극제 (stimulators)인 IL1-β 및 PGE-2, 선천적 (innate) 면역에서 후천적 (acquired) 면역으로의 전환-스위치 (transition-switch)인 IL-6 또는 호중구의 화학주성 유도 (chemotactical recruitment)의 유도제인 IL-8뿐만 아니라 통증의 매개체인 아이소프로스탄. 더욱이, 락토바실러스 플란타룸 Heal19는 염증 마커인 IL-1 및 PGE2에 대해 약독화된 경우 덜 뚜렷하지만 유사한 효과를 보여준다.
락토바실러스 파라카제이 NS9는 약독화된 상태에서도 생존가능한 염증 반응의 강력한 조절제 (modulator) 역할을 한다. 검증된 1차 인간 단핵구 모델에서, 이것은 선택된 바이오마커들의 발현을 현저하게 하향 조절하였다. 이 균주에 의해 약화된 주요 조절물 (key regulators)은 다음과 같다: 급성기 단백질 (acute phase proteins)의 분비 증가에서 나타나는 초기 염증의 자극제 (stimulators)인 IL1-β 및 PGE-2, 선천적 (innate) 면역에서 후천적 (acquired) 면역으로의 전환-스위치 (transition-switch)인 IL-6 또는 국소 또는 조직 염증의 일반적인 마커인 TNF-α뿐만 아니라 통증의 매개체인 아이소프로스탄. 가장 흥미로운 것은, 심지어 파라프로바이오틱 (paraprobiotic)과 같이 약독화된 상태에서도 상기 언급한 모든 마커들은 비록 더 적은 정도일지라도 하향 조절되었다. 그럼에도 불구하고, 락토바실러스 파라카제이 NS9는 약독화된 상태에서도 염증 반응의 가장 강력한 조절제이다.
락토바실러스 델브루엑키 아종. 락티스 LL-G41은 생존 상태에서 염증 반응의 가장 강력한 조절자 중 하나이다. 검증된 1차 인간 단핵구 모델에서, 이것은 선택된 바이오마커들의 발현을 현저하게 하향 조절하였다. 이 균주에 의해 약화된 주요 조절물 (key regulators)은 다음과 같다: 급성기 단백질 (acute phase proteins)의 분비 증가에서 나타나는 초기 염증의 자극제 (stimulators)인 IL1-β 및 PGE-2, 선천적 (innate) 면역에서 후천적 (acquired) 면역으로의 전환-스위치 (transition-switch)인 IL-6 또는 국소 또는 조직 염증의 일반적인 마커인 TNF-α, 호중구의 화학주성 유도 (chemotactical recruitment)의 유도제인 IL-8뿐만 아니라 통증의 매개체인 아이소프로스탄. 가장 흥미로운 것은, 파라프로바이오틱 (paraprobiotic)과 같이 약독화된 상태에서도, PGE-2, IL-6 및 IL-8은 비록 더 적은 정도일지라도 하향 조절되었다.
앞서 기술한 것과 같이, 질병-관련 박테리아의 군집화 (colonization)와 플라크의 형성은 유해한 미생물의 축적을 위해 구강 내 미생물의 균형을 뒤집어 엎을 수 있으며, 이는 장내불균형 (dysbiosis)으로 불린다. 그러므로, 본 발명에 따른 구강 내 염증의 예방 및/또는 치료에서의 사용을 위한 미생물은 플라크 및 플라크 관련 질병의 예방 및/또는 치료에서의 사용을 포함하고, 유리하게는 구강 세균총 (flora)을 건강한 상태로 균형을 잡아줌으로써 구강 장내불균형을 피하기 위한 보조제 (aid)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 기술한 미생물(들)은 약독화된 (attenuated) 또는 사멸된 미생물(들), 바람직하게는 열-불활성화된 (heat-inactivated) 미생물(들), 바람직하게는 70 및 100 ℃ 사이의 온도에서 2 내지 8분동안 배양에 의해 열-불활성화된 것이다.
하기 기술된 연구에서, 본 발명에 따른 미생물은 불활성화된 상태에서도 전-염증성 인자의 방출에 대한 억제 효과를 제공할 수 있음이 입증되었다. 그러므로, 예를 들어 사멸된 또는 열에 의해 불활성화된 미생물도 사용될 수 있다. 놀랍게도, 열에 의해 불활성화된 균주는 특정 인자에 대해 동일하거나 약간 증가된 항-염증 활성을 나타낼 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 종양 괴사 인자 (TNF), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 아이소프로스탄 (isoprostanes), 기질 금속단백질분해효소-9 (MMP9) 및 NF-κB로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염증 인자의 방출을 감소 또는 억제하기 위한 구강 내 항-염증제로서 사용하기 위한 상기 언급된 미생물(들)에 관한 것이다.
처음으로, 프로바이오틱 균주가 여러 다른 전-염증성 인자의 방출을 효과적으로 억제할 수 있음이 개별적으로 설명되었다. 따라서 전반적으로 가장 효율적인 균주(들)을 선별함으로써 구강 내 염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 프로바이오틱스 균주의 사용을 최적화하는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 앞서 기술한 임의의 측면에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 미생물(들)의 단편 (fragments)은 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
미생물의 단편 (예. 분해된 세포의 잔해) 만을 포함하는 혼합물은 본 발명의 효과를 제공하기에 충분하기 때문에 본 발명에 따른 프로바이오틱 미생물의 전체 세포를 사용할 필요는 없을 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 또한 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbruekii subsp lactis) LL-G41 (CCTCC M 2016652), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313) 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) NS9 (NCIMB 8823)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물(들) 또는 이들의 단편들을 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품에 관한 것으로, 상기 미생물(들) 또는 이들의 단편들의 총 함량은 구강 내 염증을 치료 및/또는 예방하기에 충분하고, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염을 치료 및/또는 예방하기에 충분하며, 더 바람직하게 상기 미생물(들) 또는 이들의 단편들의 총 함량은, 각각의 경우 조성물의 총 중량을 기준으로, 0.01 내지 100 %의 범위이고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 %의 범위이며, 가장 바람직하게는 1 내지 10 %의 범위이고, 및/또는 상기 미생물(들) 또는 이들의 단편들의 총 함량은 1 x 103 내지 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU)의 범위, 보다 바람직하게는 1 x 105 내지 1 x 1010 CFU의 범위이다.
당업자는 본 발명에 따른 조성물 또는 제품에서 사용되는 프로바이오틱 유기체 (probiotic organisms)가 생물학적 물질을 나타내고, 그 활성은 배치 (batch)에 따라 달라질 수 있으며, 또한 제품 또는 제조방법에 의존하고 있다는 것을 알고 있다. 따라서, 주어진 범위 내에서 적당량을 조정할 수 있다.
나아가, 본 발명은 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 상기 기술된 조성물 또는 제품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 담체, 부형제 또는 추가 활성 성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분, 예를 들어 비-스테로이드성 소염제, 항생제, 스테로이드, 항-TNF-α 항체 또는 다른 생화학적으로 생산된 활성 성분 및/또는 물질뿐만 아니라 진통제 (analgesics), 덱스판테놀 (dexpanthenol), 프레드니솔론 (prednisolon), 포비돈 아이오딘 (povidon iodide), 클로르헥시딘-비스-D-글루코네이트 (chlorhexidine-bis-D-gluconate), 헥세티딘 (hexetidine), 염산벤지다민 (benzydamine HCl), 리도카인 (lidocaine), 벤조카인 (benzocaine), 마크로골 라우릴 에테르 (macrogol lauryl ether), 염화세틸피리디늄 (cetylpyridinium chloride)과 결합된 벤조카인 또는 송아지 혈액으로부터 단백질이 제거된 혈투석액과 결합된 마크로골 라우릴 에테르뿐만 아니라; 예를 들어 충진제 (fillers) (예. 셀룰로오스, 탄산칼슘), 가소제 또는 흐름 개선제 (flow improves) (예. 활석 (talcum), 스테아린산 마그네슘 (magnesium stearate)), 코팅제 (예. 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (polyvinyl acetate phthalate), 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 (hydroxyl propyl methyl cellulose phthalate)), 붕괴제 (예. 전분, 가교된 폴리비닐 피롤리돈 (cross-linking polyvinyl pyrrolidone)), 연화제 (예. 트리에틸시트레이트, 디부틸프탈레이트) 과립화제 (락토오즈, 젤라틴), 지연제 (retardation) (예. 분산액 중의 폴리 (메트)아크릴산 메틸/에틸/2-트리메틸 아미노메틸 에스테르 공중합체 (poly (meth)acrylic acid methyl/ethyl/2-trimethyl aminomethyl ester copolymerizates in dispersion), 비닐 아세테이트/크로톤산 공중합체 (vinyl acetate/ crotonic acid copolymerizates)), 응축제 (compaction) (예. 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 락토오스), 용매, 현탁 또는 분산제 (예. 물, 에탄올), 유화제 (예. 세틸 알코올, 레시틴), 유동성 조절제 (substances for modifying the rheological properties) (실리카, 소듐 알지네이트), 미생물 안정화제 (예. 염화벤잘코늄 (benzalkonium chloride), 소르빈산칼륨 (potassium sorbate)), 보존제 및 항산화제 (예. DL-α-토코페롤 (DL-alpha-tocopherol), 아스코르브산 (ascorbic acid)), pH 조절제 (젖산, 스트르산), 발포제 (blowing agents) 또는 비활성 기체 (예. 불소 염화탄화수소 (fluorinated chlorinated hydrocarbons), 이산화탄소), 염료 (산화철 (iron oxide), 산화티타늄 (titanium oxide)), 외용제의 기본 성분 (basic ingredients for ointment) (예. 파라핀, 비즈왁스) 및 문헌 (예. in Schmidt, Christin. Wirk- und Hilfsstoffe f
Figure pct00003
r Rezeptur, Defektur und Großherstellung. 1999; Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart oder Bauer, Fromming Fuhrer. Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie. 8. Auflage, 2006. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart) 에 개시된 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 제품은 코팅되거나 캡슐화된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 캡슐화는 제어된 방출을 허용하는 이점, 예를 들어 물과의 접촉시, 또는 장기간 동안의 연속적인 재방출의 이점을 가질 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 제품의 저장 수명을 개선하는 분해로부터 보호될 수 있다. 활성 성분들의 캡슐화를 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 캡슐화 재료뿐만 아니라 특정 요구들에 따라 조성물에 그것들을 적용하는 방법도 이용가능하다.
나아가, 본 발명에 따른 조성물 또는 제품은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 과립, 파우더 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 제품은 치약, 치아 겔, 치아 파우더, 치아 세정액, 치아 세정폼, 구강 세정제, 구강 스프레이, 치실, 츄잉껌 및 로젠지 (lozenges)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 조성물 또는 제품은 규산염, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 산화 알루미늄 및/또는 수산화 인회석 (hydroxyl apatite)와 같은 연마 시스템 (연마 및/또는 연마 구성 요소); 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 사코시네이트 및/또는 코카마이도프로필 베타인과 같은 계면활성제; 글리세롤 및/또는 소르비톨과 같은 습윤제; 카르복시 메틸 셀룰로오스, 폴리 에틸렌 글리콜, 카라기난 및/또는 라포나이트 ®과 같은 증점제; 사카린과 같은 감미료; 불쾌한 (unpleasant) 맛의 인상을 위한 향과 맛 교정제; 맛 조절 물질 (예를 들어, 이노시톨 포스페이트, 뉴클레오타이드, 예를 들어 일인산구아노신, 일인산아데노신 또는 다른 물질, 예를 들어 글루탐산나트륨 또는 2-페녹시 프로피온산); 멘톨 유도체 (예를 들어 L-멘틸 락테이트, L-멘틸 알킬 카보네이트, 멘톤 케탈 (menthone ketals))와 같은 냉각제; 아이실린 및 아이실린 유도체; 불화 나트륨 (sodium fluoride), 일불소 인산나트륨 (sodium monofluorophosphate), 주석 (II) 불화물 (tin difluoride), 4차 암모늄 플루오르화물 (quaternary ammonium fluorides), 구연산 아연 (zinc citrate), 황산 아연 (zinc sulfate), 피로인산주석 (tin pyrophosphate), 주석(II) 염화물 (tin dichloride), 다른 피로인산 (pyrophosphate)의 혼합물, 트리클로산 (triclosane), 염화세틸피리디늄 (cetylpyridinium chloride), 젖산 알루미늄 (aluminum lactate), 구연산 칼륨 (potassium citrate), 질산 칼륨 (potassium nitrate), 염화 칼륨 (potassium chloride), 염화 스트론튬 (strontium chloride), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 향료 물질 (aroma substances), 중탄산 나트륨 (sodium bicarbonate) 및/또는 향 교정제와 같은 안정화제 및 활성 성분;을 포함할 수 있다.
츄잉껌 또는 치아 관리 츄잉껌은 엘라스토머, 예를 들어 폴리비닐 아세테이트 (PVA), 폴리에틸렌, (저 (low) 또는 중 (medium) 분자), 폴리이소부탄 (PIB), 폴리부타디엔 (polybutadiene), 이소부텐/이소프렌 공중합체, 폴리비닐에틸에테르 (PVE), 폴리비닐부틸에테르, 비닐 에스테르 공중합체 및 비닐 에테르, 스티렌/부타디엔 공중합체 (SBR); 또는 비닐 엘라스토머, 예를 들어 비닐 아세테이트/비닐 라우레이트, 비닐 아세테이트/비닐 스테아레이트 또는 에틸렌/비닐 아세테이트; 및 엘라스토머, 예를 들어 EP 0 242 325, US 4,518,615, US 5,093,136, US 5,266,336, US 5,601,858 또는 US 6,986,709에 기재된 예시의 혼합물을 포함하는 츄잉껌 베이스로 이루어질 수 있다. 추가로, 츄잉껌 베이스는 추가 성분, 예를 들어 (미네랄) 충진제 (filler), 예를 들어 탄산칼슘 (calcium carbonate), 이산화티타늄 (titanium dioxide), 이산화규소 (silicone dioxide), 활석 (talcum), 산화알루미늄 (aluminum oxide), 제2인산칼슘 (dicalcium phosphate), 제3인산칼슘 (tricalcium phosphate), 수산화마그네슘 (magnesium hydroxide) 및 이들의 혼합물; 가소제 (plasticisers) (예를 들어, 라놀린 (lanolin), 스테아린산 (stearin acid), 스테아린산 나트륨 (sodium stearate), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 다이아세틴 (diacetin) (글리세롤 디아세테이트 (glycerol diacetate)), 트리아세틴 (triacetin) (글리세롤 트리아세테이트 (glycerol triacetate)), 및 트리에틸시트레이트 (triethyl citrate)); 유화제 (예를 들어, 레시틴 (lecithin) 및 지방산의 모노 (mono) 및 다이글리세라이드 (diglycerides), 예를 들어 글리세롤 모노스테아레이트 (glycerol monostearate)와 같은 인지질), 항산화제, 왁스 (예를 들어, 파라핀 왁스, 칸데릴라 왁스, 카나우바 왁스, 마이크로크리스탈린 왁스 및 폴리에틸렌 왁스), 지방 또는 지방 오일 (fatty oils) (예를 들어, 경화된 (hardened) (수소화된 (hydrogenated)) 식물 또는 동물 지방) 및 모노 (mono), 디 (di) 또는 트리글리세라이드 (triglycerides)를 포함할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 앞서 기술한 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품의 제조방법에 관한 것이다:
락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbruekii subsp lactis) LL-G41 (CCTCC M 2016652), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313) 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) NS9 (NCIMB 8823)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물(들) 또는 이들의 단편들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물(들)과 추가 성분, 바람직하게는 담체, 부형제 또는 추가 활성성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 결합하는 단계.
본 발명과 관련하여, 본 발명에 기술된 바는 본 발명에 기재된 미생물 또는 혼합물을 개체/환자에, 바람직하게는 이를 필요로 하는 개체/환자에, 바람직하게는 염증을 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 개체 또는 환자 각각의 치료 방법, 특히 구강 내 염증 (본 발명에 기술된 것과 같은)의 치료 및/또는 예방을 위한 치료 방법이다.
도 1은 인간 1차 단핵구에서 인터류킨 1β (A), 인터류킨 6 (B), 인터류킨 8 (C), 프로스타글란딘 E2 (D), 종양 괴사 인자α (E) 및 아이소프로스탄 (F)에 대한 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 항-염증 효과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼 (column)은 무처리 세포를, 오른쪽 컬럼은 약독화된 세포를 나타낸다.
도 2는 인간 잇몸 섬유아세포에서의 인터류킨에 대한 무처리군 (A) 및 약독화된 (B) 형태에서의 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691)의 항-염증 효과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼은 인터류킨 6을, 오른쪽 컬럼은 인터류킨 8을 나타낸다.
도 3은 인간 1차 단핵구에서 인터류킨 1β (A), 인터류킨 6 (B), 인터류킨 8 (C), 프로스타글란딘 E2 (D), 종양 괴사 인자α (E) 및 아이소프로스탄 (F)에 대한 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131)의 항-염증 효과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼은 무처리 세포를, 오른쪽 컬럼은 약독화된 세포를 나타낸다.
도 4는 인간 잇몸 섬유아세포에서 인터류킨에 대해 약독화된 형태에서 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131)의 항-염증 효과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼은 인터류킨 6을, 오른쪽 컬럼은 인터류킨 8을 나타낸다.
도 5는 인간 1차 단핵구에서 인터류킨 1β (A), 인터류킨 6 (B), 인터류킨 8 (C), 종양 괴사 인자α (D), 프로스타글란딘 E2 (E), 아이소프로스탄 (F) 및 금속단백질분해효소 9 (MMP-9, G)에 대한 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) (NCIMB 8823)의 항-염증 효과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼은 무처리 세포를, 오른쪽 컬럼은 약독화된 세포를 나타낸다.
도 6은 인간 1차 단핵구에서 인터류킨 1β (A), 인터류킨 6 (B), 인터류킨 8 (C), 프로스타글란딘 E2 (D), 아이소프로스탄 (E) 및 기질 금속단백질분해효소 9 (MMP-9, F)에 대한 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313)의 항-염증 효과를 나타낸다.
도 7은 인간 1차 단핵구에서 인터류킨 1β (A), 인터류킨 6 (B), 인터류킨 8 (C), 종양 괴사 인자α (D), 프로스타글란딘 E2 (E), 아이소프로스탄 (F) 및 기질 금속단백질분해효소 9 (MMP-9, G)에 대한 락토바실러스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii) LL-G41 (CCTCC M 2016652)의 항-염증 효과를 나타낸다. 왼쪽 컬럼은 무처리 세포를, 오른쪽 컬럼은 약독화된 세포를 나타낸다.
도 8은 인간 잇몸 섬유아세포에서 인터류킨 6 및 인터류킨 8에 대한 약독화된 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) (NCIMB 8823)의 항-염증 효과를 나타낸다.
하기 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시하기 위해 추가된 것이다.
실시예 1: 프로바이오틱 균주의 배양 및 처리 설정
본 발명의 균주는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 비피도박테리움 애니멀리스 (Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 락토바실러스 LAFTI (Lactobacillus LAFTI), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노수스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 캘로비오수스 (Lactobacillus cellobiosus), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 스트렙토코커스 서모필러스 (Streptococcus thermophiles) 및 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis)의 균주를 포함한 50 종 이상의 후보 프로바이오틱 균주 중에서 선별하였다.
최적의 성장 조건과 채취 (harvest) 시점을 확인하고 선별된 프로바이오틱 박테리아에 대한 집락 형성 단위 (CFU)를 결정하기 위해, 대수기 (log phase)와 성장기 (growth phase)의 말기를 결정하였다.
박테리아 성장
동결된 (-80 ℃) 프로바이오틱 저장품을 4 ℃에서 밤새 해동시키고, 다음날 아침에 1.2 ml의 박테리아에 6 ml의 멸균된 9% NaCl 용액을 첨가하였다. 시료를 원심분리 (5분, 5000 rpm)하고, 상등액은 제거하였으며, 펠렛은 8 ml의 9% NaCl로 세척하고 다시 5000 rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 그 후 펠렛은 1.2 ml의 9% NaCl에 재현탁하고, 1 ml의 시료를 50 ml의 37 ℃의 따뜻한 배지 (MRS Bouillon, Carl Roth KG, Karlsruhe)에 첨가하여 37 ℃에서 배양하였다. 배양은 50 ml의 멸균된 폴리프로필렌 튜브 (Greiner)에서 수행되었으며, 프로브는 생장 곡선을 평가하기 위해 상이한 시점에서 채취하였다.
OD-측정
OD 측정을 위해, 500 μl의 박테리아 현탁액을 제거하고 1,5 ml-PS-큐벳 (Brand)에서 1 ml의 MRS Bouillon에 희석하였다. OD-측정은 600 nm (ThermoScientific, Helios Epsilon)에서 수행하고, 1.5 ml의 MRS Bouillon는 blanc으로 사용하였다.
CFU의 측정
CFU의 측정을 위해, 박테리아를 희석하고 (1:10.000.000, 1:50.000.000 및 1: 100.000.000), MRS-한천-플레이트 (MRS Agar, X924, Carl Roth)에 놓아 37 ℃에서 2일동안 배양하였다. 그 후 성장한 콜로니를 계수하고 CFU를 측정하였다.
박테리아는 편평기 (plateau phase)에 도달하기 시작하는 7 내지 8 시간까지 처음부터 대수기 (log phase)에 도달하였다. 시딩되는 박테리아의 양은 곡선의 모양을 변화시키지 않는다. 대수기에서 박테리아를 수확하기 위해 가장 가파른 성장기에서의 5시간을, 대수기가 끝날 때 그것들을 수확하기 위한 7시간을 선택하였다.
실시예 2: 프로바이오틱스를 이용한 인간 단백구의 자극 설정
프로바이오틱스를 이용한 단핵구 세포 배양물의 자극은 분말로 얻은 균주를 이용함으로써 설정되었다.
먼저, 성장한 박테리아 (대수기로부터 선택된), 성장된 박테리아 배양물의 상층액, 용해된 분말 및 분말 상층액의 직접적인 적용과 같은 몇몇 적용 형태들을 실험하였다. 결과에 따르면, 대수기 말기의 박테리아는 동결된 균주의 두 개의 배치 (batch)와 함께 실험하였다. 상등액을 사용하는 대신에, 상기 두 균주의 열-불활성화를 설정하고 활성화된 박테리아와 불활성화된 박테리아를 비교하였다.
사이토카인의 측정; 1차 인간 단핵구에서의 MMP -9와 PGE2
인간 1차 단핵구를 건강한 인간 혈액 기증자의 연막 (buffy coats)으로부터 분리하였다. ELISA 실험을 위해 세포를 24-웰-플레이트에 시딩 (seeding)하였다. 세포를 LPS와 함께 24시간동안 배양하였다. LPS 처리 30분 전에 프로바이오틱스 (5회 투여량)를 첨가하였다. 24시간 후에, 상층액은 제거하고, 원심분리하여 제조사의 지시에 따라 EIAs (PGE2, from AssayDesign, isoprostane, from Cayman) 또는 ELISAs (all cytokines, Immunotools, MMP-9, GE Healthcare)에서 IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8, MMP-9, 아이소프로스탄-8 및 PGE2 농도를 측정하였다. 각각의 투여량은 2 명의 다른 기증자의 2 개의 연막에서 2-3회 측정하였다.
먼저, 인간 단핵구의 자극을 위해 다양한 유형의 프로바이오틱 동결건조 분말 제제를 시험하였다.
프로바이오틱스를 수확하고 원심분리하였다. 세포를 새 배지에 용해시키고 인간 단핵구에 적용시켰다.
그 후 단핵구를 30분동안 프로바이오틱스와 배양한 다음, LPS를 첨가하고, 24시간 후에 상층액을 제거하여 염증 파라미터의 결정을 위해 사용한다.
실시예 3: 열-불활성화된 균주의 실험
열 불활성화의 설정
열 불활성화는 두 개의 집단 (batch)에 설정하였다. 박테리아 생장 대수기 말기에서, 박테리아 현탁액의 표본을 제거하고, 새 50 ml 튜브에 첨가하였으며, 수조 (water batch)에서 80 ℃에서 5분동안 배양하였다. 80 ℃에서 5분동안 박테리아가 불활성화되어 성장이 멈췄다.
균주의 열 불활성화된 집단을 시험한 결과, IL-1 및 TNF의 증가 효과는 열 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 나아가, 열 활성화는 두 균주에 의한 PGE2 억제에 영향을 주지 않거나 약간만 영향을 주었다.
실시예 4: 인간 단핵구에 대한 프로바이오틱스의 스크리닝 및 NF -ĸB 활성화에 대한 효과
IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, PGE2, 8-아이소프로스탄 및 MMP-9를 결정하는 LPS-유도된 인간 1차 단핵구에서 이들의 활성화되고 약독화된 (열-불활성화된 형태) 다양한 프로바이오틱 균주를 선별하였다.
실시예 1-4에 따른 균주의 전형적인 항-염증 패턴을 도 1 및 3에 나타내었다.
NIH-3T3 섬유아세포에서 TNF에 의해 유도된 NF-ĸB 활성화에 대한 효과를 확인하기 위한 실험은 NF-ĸB 의존적 프로모터에 의해 안정적으로 형질전환된 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 섬유아세포 세포주에서 수행되었다. 세포를 프로바이오틱의 존재 또는 부존재 하에 TNF로 자극하였다. 자극 6시간 후, 세포를 용해시키고 광도계 (Luminometer)에서 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 가장 강력한 균주가 선별되었다.
실시예 5: 인간 잇몸 섬유아세포에 대해 선별된 프로바이오틱스의 스크리닝
선별된 균주를 인간 잇몸 섬유아세포에 적용시켰다. 섬유아세포의 배양은 제조사의 지시에 기재된 대로 유지시켰다. 자극에 앞서, ELISA 실험을 위해 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 무처리 (무자극 대조군) 또는 IL-1β 와 함께 24시간동안 배양하였다. 프로바이오틱스 (5회 투여량, 스크리닝 분석의 결과에 따름)를 IL-1 처리 전에 30분동안 첨가하였다. 24시간 후에, 상층액을 제거하고, 원심분리하여, 제조사의 지시에 따라 EIA (PGE2, from AssayDesign, isoprostane form Cayman) 또는 ELISA (IL-6, IL-8, Immunotools)에서 IL-6, IL-8, 아이소프로스탄 및 PGE2 농도를 측정하였다. 각각의 투여량은 적어도 2-3회 측정하였다. 균주들은 IL-6을 억제하는 효과를 보였다.
실시예 5에 따른 균주의 항-염증 패턴을 도 2 및 4에 나타내었다.
실시예 6: 프로바이오틱 로젠지 (lozenge) 또는 정제 ( comprimate )
No 블록 성분 아이소말트 정제 ( Isomalt Comprimates)
위약
(Placebo)		 프로바이오틱
(Probiotic only)		 향 첨가
(+ Flavor)
1 A 스테아린산 마그네슘 1,800% 1,800% 1,800%
2 아세설팜 0,050% 0,050% 0,050%
3 수크랄로스 0,025% 0,025% 0,025%
4 프로바이오틱 재료 　 1,000% 1,000%
5 향 (예. 134229 옵타민트 페퍼민트 (Optamint peppermint) s/d) 　 　 0,500%
6 B 아이소말트 98,125% 97,125% 96,625%
총합 100,00% 100,00% 100,00%
제조 방법:
●성분 1 및 6을 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기 (vacuum compartment drier)에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1, 2, 3, 4 및 5를 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 A). 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 형태로 적용된다.
●이후 블록 A를 성분 6에 첨가하고 5분동안 완전히 혼합한다.
●분말 혼합물을 15 - 20 kN의 조정된 압력으로 정제기 EK0 (Korsch AG, 베를린)에서 정제로 압축한다.
목표 파라미터 (target parameters):
◎정제 직경: 20 mm
◎정제 중량: 2,0 g.
●밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에서 실온 (RT) 저장한다. 5 개의 로젠지 (lozenges) 당 제습을 위해 1 g의 건조제 (desiccant)가 사용된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 7: 치약 파우더 (Powder dentifrice)
No 블록 성분 치아 파우더 ( Toothpowder )
위약
(Placebo)		 프로바이오틱
(Probiotic only)		 향 첨가
(+ Flavor)
1 A 탄산 마그네슘 3,00% 3,00% 3,00%
2 중탄산 나트륨 2,00% 2,00% 2,00%
3 불화 나트륨 0,25% 0,25% 0,25%
4 사카린 나트륨 0,60% 0,60% 0,60%
5 B 프로바이오틱 재료 　 4,00% 4,00%
6 향 (예. 134229 옵타민트 페퍼민트 s/d) 　 　 2,00%
7 C 탄산 칼슘 94,15% 90,15% 88,15%
총합 100,00% 100,00% 100,00%
제조 방법:
●성분 7을 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1, 2, 3 및 4를 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 A).
●성분 5와 6을, 필요하다면, 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 B). 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 형태로 적용된다.
●이후 블록 A와 B는 결합시키고, 완전히 혼합한다.
●혼합물을 성분 7에 첨가하고 5분동안 완전히 혼합한다.
●분말 혼합물은 실온에서 1회분 당 1 g의 건조제와 함께 각각 0.5 g의 분획으로 저장되어 밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에 구성된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 8: 치약 파우더 (Powder dentifrice)
No 블록 성분 치약 정제 (Toothpaste tablets)
1 A 탄산 마그네슘 3,00 %
2 중탄산 나트륨 2,00 %
3 불화 나트륨 0,25 %
4 사카린 나트륨 0,60 %
5 소듐 라우릴설페이트 0,50 %
6 스테아린산 마그네슘 1,00 %
7 B 향 (예. 134229 옵타민트 페퍼민트 s/d) 2,00 %
8 프로바이오틱 재료 6,67 %
9 C 탄산 칼슘 17,00 %
10 마이크로크리스탈린 셀룰로오스 66,98 %
총합 100,00%
제조 방법:
●성분 6, 9 및 10을 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 A).
●성분 7 및 8을 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 B). 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 형태로 적용된다.
●이후 블록 A와 B를 결합시켜 완전히 혼합한다.
●성분 9 및 10을 결합시키고 완전히 혼합한다 (블록 C).
●두 혼합물 (블록 A/B 및 블록 C)을 결합시키고 5분동안 완전히 혼합한다.
●분말 혼합물을 15 - 20 kN의 조정된 압력으로 정제기 EK0 (Korsch AG, Berlin)에서 정제로 압축한다.
목표 파라미터 (target parameters):
◎정제 직경: 9 mm
◎정제 중량: 0,3 g.
●밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에서 실온 (RT) 저장한다. 3개의 정제 (tablets) 당 제습을 위해 1 g의 건조제 (desiccant)가 사용된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 9: 츄잉 껌 (Chewing gum)
No 성분 츄잉껌 (식물성 유지 및 향 내 프로바이오틱 스 포함)
(Chewing gum with Vegetable Oil, Probiotics in Flavor) 		츄잉껌 (식물성 유지 및 오일 내 프로바이오틱스 포함)
(Chewing gum with Vegetable Oil, Probiotics in Oil)
1 껌 베이스 (e.g. Geminis T) 30,00 % 블록 A 30,00 % 블록 A
2 아이소말트 (여기서는: 아이소말트 ST-PF (Isomalt ST-PF)) 65,00 % 블록 B 65,00 % 블록 B
3 코팅된 수크랄로스 (Sucralose coated)(왁스 내 10%) 1,00 % 1,00 %
4 기름이 제거된 대두 레시틴 (Deoiled Soy Lecithin) (여기서는: Emulpur IP) 0,30 % 0,30 %
5 식물성 유지 - 트리글리세라이드 1,60 % 블록 C 1,60 % 블록 C
6 프로바이오틱 재료 0,80 % 블록 D 0,80%
7 향 (예. 203191 옵타민트 페퍼민트) 1,30 % 1,30 % 블록 D
제조 방법:
●성분 2를 50 ℃ 및 최대 10 mbar의 압력에서 16시간동안 진공 분획 건조기에서 건조시킨다.
●모든 성분들은 중량을 정확하게 잰다.
●성분 1을 균일한 덩어리가 얻어질 때까지 츄잉껌 실험-반죽기 (lab-kneader)에서 45 - 59 ℃까지 가열하면서 반죽한다. 가열은 모든 혼합 공정동안 작동된다.
●이어서, 성분 2, 3 및 4를 첨가하고 혼합물이 균일하고 분말이 더 이상 보이지 않을 때까지 반죽한다.
●제조 방법에 따라, 성분 6은 성분 5 (블록 C) 또는 성분 7 (블록 D) 중 하나로 가공된다. 프로바이오틱 재료는 그람 (gram) 당 약 105 내지 1012 집락 형성 단위 (CFU)의 활성을 갖는 동결건조된 상태로 적용한다. 상기 성분들은 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 혼합한다.
●먼저, 블록 C를 츄잉껌 덩어리에 넣고 균일한 덩어리가 얻어질 때까지 혼합한다.
●마지막으로, 블록 D를 그에 따라 처리한다. 첨가 후, 조성물은 츄잉껌 덩어리가 얻어질 때까지 반죽해야 한다. 덩어리를 믹스에서 꺼내고 엠보싱 세트 “평판 (slabs)”을 사용하여 엠보싱 롤러 (embossing roller로 미니-스틱 (mini-sticks)을 만든다.
●밀봉된 알루미늄 봉지 (sachets)에서 실온 (RT) 저장한다. 7개의 츄잉껌 당 제습을 위해 1 g의 건조제 (desiccant)가 사용된다 (진공 분획 건조기에서 105 ℃에서 3시간동안 저장되도록 작동시킨다).
실시예 10: 프로바이오틱 비들렛 ( Probiotic beadlets )
성분 프로바이오틱 비들렛 (저함량, 향료 미포함, 염료 및 젤란검 포함)
중량 % (wt. % ) 		프로바이오틱 비들렛 (저함량, 아로마, 염료 및 젤란검 포함)
중량 % (wt. % ) 		프로바이오틱 비들렛 ( 고함량 , 아로마, 염료 및 젤란검 미포함, 고 함량의 물)
중량 % (wt. % ) 		프로바이오틱 비들렛 ( 고함량 , 아로마, 염료 및 젤란검 미포함, 저함량의 물)
중량 % (wt. % )
알지네이트 1,75 1,65 1,44 1,57
아라비아 검 1,25 1,18 0,60 0,65
밀 섬유 1,125 1,06 0,52 0,57
염료 0,0125 0,018 - -
향료 - 1,41 - -
글리세롤 0,1875 - - -
프로바이오틱 1,125 1,35 7,20 7,83
젤란 검 0,0625 0,059 - -
물 100까지 첨가 100까지 첨가 100까지 첨가 100까지 첨가
load 약 20% 약 20% 약 74% 약 74%
제조 방법:
알지네이트 비들렛 (beadlets)의 석출을 위한 염화 칼슘 용기 (bath)의 제조:
●2%의 염화 칼슘 용액은 증류수와 염화 칼슘으로부터 제조한다. CaCl2는 완전히 용해되니 주의해야 한다.
알지네이트 용액의 제조(알지네이트 대신 펙틴 (pectin) 또는 젤란 검 (gellan gum)을 사용할 수도 있음):
●교반기가 있는 반응 용기에서 배치 (batch) 크기에 적합한 경우, 물을 공급한다.
●교반기를 작동시키고, 고속으로 교반하면서, 알지네이트, 아라비아 검 (gum arabicum), 밀 섬유 (wheat fiber) 및 프로바이오틱의 각각의 함량뿐만 아니라 요구되는 젤란 검을 선택적으로 첨가하였다.
●혼합물을 교반하면서 80℃로 가열하고, 이 온도에서 5분간 유지한다 - 이 단계에서 겔 형성 성분들이 용해된다.
●이후, 가열을 멈추고, 뜨거운 겔 용액을 덩어리가 없어질 때까지 적어도 30분동안 더 교반한다.
●이어서, 용액을 교반하면서 냉각기로 39 - 43℃로 냉각시킨다.
●추가 용기에서, 아로마와 염료는 필요에 따라 제공되며, 완전히 혼합한다. 아로마가 사용되지 않는 경우, 염료는 글리세롤과 혼합된다.
●염료 분산액이 균일하게 혼합되면, 배치 (batch) 용기에 알지네이트 용액과 함께 첨가한다. 혼합 용기는 물을 사용한 약 10% 함량의 알지네이트 용액으로 수회 세척하고 분산액에 첨가한다.
●알지네이트 분산액은 적어도 5분동안 추가로 교반한다.
●다음으로, 배치는 잠재적으로 남아있는 공기를 제거하기 위해 낮은 속도에서 적어도 15분동안 추가로 교반한다.
비들렛의 침전을 위한 염화 칼슘 용액으로의 알지네이트 용액의 적하 (dripping):
●알지네이트 분산액을 두 개의 배출구가 있는 단단히 밀폐가능한 압력 안정 반응 용기에 옮긴다. 하나의 배출구에 가압된 공기를 가한다. 두번째 출입구는 튜브를 통해 적하 장치의 노즐로 이어진다.
●반응 용기를 가열판에서 담금질하고, 알지네이트 용액은 약 45℃의 온도에 도달하도록 한다. 용액은 자석 교반기로 약간 교반한다.
●반응 용기에 압력을 가한 후, 알지네이트 용액을 발진기에 의해 움직이는 노즐을 향해 압력을 가한다. 압력 및 발진기의 진동수의 적용에 의해, 노즐의 끝에서 생성되는 물방울의 크기가 조절될 수 있다.
●노즐 끝에 형성된 알지네이트 용액의 방울은 염화칼슘 용액이 순환하는 깔때기 형태로 수집 용기로 떨어진다.
●경화된 알지네이트 비들렛은 깔때기를 통해 염화칼슘 용액과 함께 통과하여 여과기에 수집되고, 수집된 염화칼슘 용액은 적하 장치 아래의 깔때기 안으로 거꾸로 퍼내어 재활용된다.
비들렛을 45 ℃의 배기 공기 온도에 도달할 때까지 80℃의 공급 공기 온도에서 Aeromatic flowbed-dryer 안에서 건조시킨다.

Claims (11)

  1. 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방을 위한, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방을 위한 미생물 또는 둘 이상의 미생물을 포함하거나 또는 이루어지는 혼합물로서,
    상기 미생물(들)은 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) LL-G41 (CCTCC M 2016652), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313) 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) NS9 (NCIMB 8823)으로 이루어진 군에서 선택된 것인 미생물 또는 혼합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미생물(들)은 약독화된 (attenuated) 또는 사멸된 미생물(들)이고, 바람직하게는 열-불활성화된 미생물(들), 바람직하게는 70 내지 100℃에서 2 내지 8분간 배양에 의한 열-불활성화된 미생물인 미생물 또는 혼합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 8 (IL-8), 종양 괴사 인자 (TNF), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 아이소프로스탄 (isoprostanes), 기질 금속단백질분해효소-9 (MMP9) 및 NF-κB로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염증 인자의 방출을 감소 또는 억제하기 위한 구강 내 항-염증제로서의 미생물 또는 혼합물.
  4. 구강 내 염증의 치료 및/또는 예방을 위한, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방을 위한 앞서 기술한 청구항들 중 어느 한 항에서 정의한 하나 이상의 미생물(들)의 단편들 (fragments).
  5. 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbruekii subsp lactis) LL-G41 (CCTCC M 2016652), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313) 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) NS9 (NCIMB 8823)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물(들) 또는 이들의 단편들을 포함하는 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품으로서,
    상기 미생물(들) 또는 이들의 단편들의 총 함량은 구강 내 염증을 치료 및/또는 예방하기에 충분하고, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염을 치료 및/또는 예방하기에 충분하며, 더 바람직하게 상기 미생물(들) 또는 이들의 단편들의 총 함량은, 각각의 경우 조성물의 총 중량을 기준으로, 0.01 내지 100 %의 범위이고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 %의 범위이며, 가장 바람직하게는 1 내지 10 %의 범위이고, 및/또는 상기 미생물(들) 또는 이들의 단편들의 총 함량은 1 x 103 내지 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU)의 범위, 보다 바람직하게는 1 x 105 내지 1 x 1010 CFU의 범위인 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품.
  6. 제5항에 있어서,
    구강 내 염증의 치료 및/또는 예방을 위한, 바람직하게는 치은염 및/또는 치주염의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 또는 제품.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    담체, 부형제 또는 추가 활성성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 조성물 또는 제품.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 또는 제품은 코팅된 또는 캡슐화된 조성물 또는 제품.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 또는 제품은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 과립, 파우더 또는 캡슐의 형태인 조성물 또는 제품.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 또는 제품은 치약, 치아 겔, 치아 파우더, 치아 세정액, 치아 세정폼, 구강 세정제, 구강 스프레이, 치실, 츄잉껌 또는 로젠지 (lozenges)로 이루어진 군에서 선택되는 조성물 또는 제품.
  11. 하기 단계를 포함하는 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 구강용 약학 조성물, 구강 관리 제품 또는 영양 또는 기호 (pleasure)를 위한 제품의 제조방법:
    -락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) LPc-G110 (CCTCC M 2013691), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) GOS 42 (DSM 32131), 락토바실러스 델브루엑키 아종 락티스 (Lactobacillus delbruekii subsp lactis) LL-G41 (CCTCC M 2016652), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) Heal19 (DSM 15313) 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei) NS9 (NCIMB 8823)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물(들) 또는 이들의 단편들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물(들)과 추가 성분, 바람직하게는 담체, 부형제 또는 추가 활성성분으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 결합하는 단계.
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