CN111904985B - 副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用 - Google Patents

副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株副干酪乳杆菌L.p R3‑10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开的副干酪乳杆菌L.p R3‑10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液，在体外具有抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌细胞炎症因子IL‑6、TNF‑α、PGE2的作用；且在体内炎症模型中均能显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集，以及显著促进中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除；同时也能显著促进斑马鱼尾鳍的损伤修复。本发明公开的副干酪乳杆菌L.p R3‑10在治疗和/或预防口腔炎症性疾病方面有巨大的潜在应用前景。

Description

副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病 药物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用。
背景技术
牙周病主要包括牙龈炎和牙周炎，是常见的口腔疾病之一，也是导致成人牙齿丧失的最主要原因。牙龈炎是由于龈缘附近牙齿表面的牙菌斑累积而引起的。特别是革兰氏阴性菌产生的内毒素脂多糖(LPS)，随着牙菌斑的成熟，其含量增加，引发非特异性炎症免疫反应。这一反应是由牙龈上皮细胞、成纤维细胞和白细胞分泌的促炎因子(如肿瘤坏死因子-α[TNF-α]和白介素-1[IL-1])、趋化因子(如IL-8)和前列腺素(如前列腺素E2[PGE2])介导的。这些炎症介质影响各种细胞过程，包括中性粒细胞和巨细细胞的募集和趋化。若牙龈炎不能及时有效地进行治疗，炎症会随着病症的加重逐渐向牙槽骨、牙周膜和牙骨质发展，可导致慢性牙周炎。牙周炎的临床表现主要有：牙龈出血、牙龈炎症、牙槽骨吸收、牙齿松动，最后导致牙齿缺失。因此，牙龈炎症应该在早期得到预防或治疗。牙周炎的治疗是在消除炎症的基础上，进行组织的修复和重建。预防和治疗牙龈炎可以通过定期采取口腔卫生措施清除或控制牙菌斑，例如清洁牙间隙和使用含抗菌药物的口腔护理产品。然而，这些方法是不加区别的，可能会清除对宿主有益的细菌。因此，需要开发替代和/或辅助牙周病传统治疗的疗法。
益生菌具有重建宿主微生物群落、调节免疫炎症反应等改善宿主微生态的作用，已广泛应用于胃肠道疾病的治疗。口腔与胃肠道相通，同样存在复杂的微生态。因此，采用益生菌调节口腔微生态菌群平衡，为各种口腔疾病的防治提供了一个新的策略。益生菌已被证明可以调节口腔微生物群，特别是抑制病原体的生长，如变形链球菌和白色念珠菌。益生菌一方面通过代谢产物发挥抑制致病菌作用，此外，益生菌在进入口腔环境后，可与口腔病原菌竞争口腔黏膜上皮细胞或牙齿表面的结合位点以减少口腔致病菌自身的黏附。另外，益生菌还能够改善牙周的临床参数、降低促炎细胞因子的水平。当前国内市场上的益生菌制品主要针对肠道问题，而针对口腔领域的益生菌产品较少。同时，国际益生菌专利申请集中于美、日、俄传统研发强国，而我国缺乏拥有自主知识产权的功能性菌株。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民口腔、胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。
因此，提供一株副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei R3-10，L.p R3-10)，其保藏编号为CGMCC No.19520。
副干酪乳杆菌L.p R3-10(Lactobacillus paracasei R3-10)在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物、护理制品中的应用；所述副干酪乳杆菌L.p R3-10的保藏编号为CGMCC No.19520，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年03月30日，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei。
进一步，所述炎症性疾病为牙龈炎或牙周炎。
进一步，所述护理制品为牙膏、牙用凝胶、牙粉、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫、漱口剂、口喷剂、牙线或锭剂。
进一步，所述的副干酪乳杆菌L.p R3-10在抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌细胞炎症因子IL-6、TNF-α、PGE2中的应用。
进一步，所述的副干酪乳杆菌L.p R3-10在抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的应用。
进一步，所述的副干酪乳杆菌L.p R3-10在促进中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除的应用。
进一步，所述的副干酪乳杆菌L.p R3-10在促进斑马鱼尾鳍损伤修复的应用。
进一步，所述副干酪乳杆菌L.p R3-10为未灭活的菌悬液或未灭活的发酵上清液。
进一步，所述副干酪乳杆菌L.p R3-10为热灭活的菌悬液或热灭活的发酵上清液。
本发明所述副干酪乳杆菌L.p R3-10，在体外具有抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌细胞炎症因子IL-6、TNF-α、PGE2的作用，具备应用于体内治疗炎症的潜能；并通过斑马鱼炎症模型证实其具有抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的作用，以及显著促进中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除的作用，表现出良好的预防或治疗口腔炎症性疾病的益生功效；同时具有促进斑马鱼尾鳍损伤修复的作用，具有增强口腔组织的自身修复能力的潜力。
本发明所述在体外炎症模型中具有抑制炎症因子IL-6、TNF-α、PGE2分泌的作用，同时在体内能显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集，和显著促进中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除，以及也能显著促进斑马鱼尾鳍损伤修复的菌株，包括菌株灭活与未灭活的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物中的应用，副干酪乳杆菌L.p R3-10是从健康婴幼儿粪便中分离筛选得到的，在体外炎症模型中能够显著抑制细胞炎症因子IL-6、TNF-α、PGE2的分泌，在体内能够显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集，和显著促进中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除，以及显著促进斑马鱼尾鳍的损伤修复，具备应用于体内预防或治疗口腔炎症性疾病的潜能，此为利用副干酪乳杆菌L.p R3-10开发预防和/或治疗口腔炎症性疾病的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明L.p R3-10在MRS琼脂平板上的菌落形态；
图2附图为本发明L.p R3-10在厌氧血琼脂平板上的菌落形态；
图3附图为本发明L.p R3-10革兰染色镜下形态，1000倍镜；
图4附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子IL-6的影响；
图5附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子TNF-α的影响；
图6附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子PGE2的影响；
图7附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的影响的直观图；
图8附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的影响的统计图；
图9附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除的影响的直观图；
图10附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活与未灭活的发酵上清液、菌悬液对中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除的影响的统计图；
图11附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的发酵上清液、菌悬液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的直观图；
图12附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的发酵上清液、菌悬液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的统计图；
图13附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的发酵上清液、菌悬液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的直观图；
图14附图为本发明副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的发酵上清液、菌悬液对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响的统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1L.p R3-10的前体菌株L.p R3(副干酪乳杆菌)的分离培养及鉴定
(1)样本来源
从学校教职工家庭中挑选出0-6个月的健康婴儿作为志愿者。采样前两周需正常饮食并且近期无肠道感染史与抗生素服用史，采样当天取晨便，收集后迅速使用南京法迈特公司的智能微生物分离系统进行粪菌分离。分离完成后迅速收集粗提粪菌液，加入冻存保护液后置于-80℃超低温冰箱中冻存备用。
(2)L.p R3的分离培养与鉴定
取1mL的粗提粪菌液加入到9mL的生理盐水，充分混匀后进行梯度稀释。吸取稀释浓度为10-5～10-7的菌液各100μL，分别密集涂布于MRS培养基、BBL培养基、M17培养基及厌氧血平板，37℃厌氧条件培养48h-72h。初步根据菌落特征和革兰染色镜检，挑选单菌落在上述对应琼脂培养基上进行分区划线纯培养。收获纯培养后的适量菌体细胞置于菌种保藏管，-80℃冰箱保存备用。纯菌株转种于MRS琼脂平板分区划线传代2代后，挑取单个菌落做革兰染色镜检及触酶试验，将具有典型乳杆菌形态特征同时触酶试验阴性的革兰阳性杆菌初步认定为乳杆菌。
(3)L.p R3的生化鉴定与测序鉴定
送交东莞市美康生物科技有限公司进行菌株测序鉴定。公司采用TIANampBacteria DNA Kit(Tiangen,Beijing)提取菌液中的DNA。通过细菌通用引物27F/1492R，利用PCR扩展得到接近全长的细菌16S rDNA片段，通过DNA测序获得该细菌16S rDNA片段的DNA序列，并通过将该序列与GenBank和RDP数据库中已有的DNA序列进行比对分析，得到序列最相似的物种信息，并根据序列的相似性推定所鉴定微生物的物种信息。经鉴定确定编号YSJ03菌株为副干酪乳杆菌，命名为L.p R3。
实施例2 L.p R3-10的诱导与鉴定
(1)低营养梯度耐受法诱导L.p R3成为L.p R3-10
从-80℃冰箱取出冻存的L.p R3，放入37℃温水浴使其快速融化。将融化后的菌液倒入厌氧血琼脂平板中，置于37℃厌氧条件静置培养48h。观察平板中菌落生长情况以及有无溶血环形成，革兰染色镜下观察菌株形态，确认无污染后，转种MRS琼脂平板上，置于37℃厌氧条件培养24h，挑取平板上的单个菌落接种于6mL MRS液体培养基中，37℃厌氧条件培养活化16-18h。将活化后的菌液以3％(v/v)接种量接种至100mL MRS肉汤中，120rpm/min，37℃振荡培养16-18h。于3500rpm/min条件下离心10min，弃上清，用PBS(pH 7.2-7.4)重悬洗涤2次后收获菌细胞。用PBS调整菌液浓度为2麦氏浊度，分装在无菌的2mL EP管中，每管分装1mL菌悬液，分装15管，37℃振荡培养。从0h开始，每隔12h取出1支EP管，吸取100μL菌液，涂布于MRS培养基表面，37℃厌氧条件下培养48h。挑取存活时间最长的单个菌落，再同样进行上述过程，依次循环10代，得到低营养梯度耐受诱导的L.p R3-10菌株。
(2)L.p R3-10培养特性
用接种环挑取L.p R3-10菌落，分区划线接种于MRS琼脂平板和厌氧血琼脂平板，MRS琼脂平板进行37℃需氧条件培养48h，厌氧血琼脂平板进行37℃厌氧条件培养48h；观察MRS平板中菌落生长情况以及厌氧血琼脂平板上有无溶血环形成，结果见图1-图2；结果显示，L.p R3-10为兼性厌氧菌，在MRS平板上菌落呈圆形、中等大小、凸起、微白色、湿润、边缘整齐，在厌氧血琼脂平板上不溶血。
(3)L.p R3-10革兰染色观察菌体形态
挑取MRS琼脂平板上的L.p R3-10菌落，涂片进行革兰染色，油镜下观察菌细胞的形态，结果见图3；结果显示，L.p R3-10为革兰染色阳性的杆菌，无芽孢、无荚膜，成短链排列。
(4)L.p R3-10生化鉴定
使用法国梅里埃生物公司的API 50CHL细菌生化鉴定系统进行鉴定。首先按照API50CHL鉴定试剂条说明书，将活化后的L.p R3-10菌悬液调整到2麦氏浊度，分别加到试剂条上的50个微生化孔中，并用无菌液体石蜡覆盖生化孔。35℃条件静置培养24h观察一次结果，继续培养至48h，再次观察结果。结果判定：25号管颜色由紫变黑为阳性，其余各管颜色由紫变黄为阳性，否则为阴性。将菌株的反应结果用API鉴定软件进行分析，获得菌株的鉴定结果。L.p R3-10生化反应结果见表1。鉴定结果为副干酪乳杆菌酪蛋白亚种1，鉴定率99.7％，T值0.79。
表1 L.p R3-10生化反应结果
Figure GDA0003231609080000071
其中，0号管为空白对照管。
实施例3副干酪乳杆菌L.p R3-10发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)的制备
将副干酪乳杆菌L.p R3-10活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养15h后，调整发酵菌浓度为2×108CFU/mL，4℃，6000r/min离心10min，得到培养上清液和菌体沉淀，上清液经0.22μm滤膜过滤后得发酵上清液(胞外分泌物)；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为2×108CFU/mL得到菌悬液(菌体)。发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)经100℃加热20min后，制成热灭活的发酵上清液(胞外分泌物)、热灭活的菌悬液(菌体)。
实施例4副干酪乳杆菌L.p R3-10对LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子IL-6、TNF-α、PGE2的影响
将对数生长期的人牙龈成纤维细胞，经胰酶消化、吹打制备成细胞数为4×104个/mL的细胞悬液，接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL，置37℃、5％CO2培养箱中孵育24h，吸弃上清液，然后每孔加入0.5mL DMEM培养液，进行分组试验。空白组加入0.5mL灭活或未灭活的PBS，模型组加入0.5mL 10μg/mL灭活或未灭活的LPS，菌悬液组加入0.25mL灭活或未灭活菌悬液+0.25mL 20μg/mL LPS，发酵上清液组加入0.25mL灭活或未灭活发酵上清液+0.25mL20μg/mL LPS，孵育24h后，收集细胞上清，用ELISA试剂盒(南京草本源生物科技有限公司)检测IL-6、TNF-α、PGE2的分泌。每组分别设6个复孔。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure GDA0003231609080000081
Figure GDA0003231609080000082
数据表示，用单因素方差分析。各实验组与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
结果见图4、图5、图6；由图4可知，与空白组(1.51±0.12pg/mL(灭活)、1.53±0.14pg/mL(未灭活))相比，模型组的炎症因子IL-6分泌量(163.97±14.48pg/mL(灭活)、172.44±9.68pg/mL(未灭活))显著增加(P<0.005)，说明本次LPS刺激有效。副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液、发酵上清液组的IL-6分泌量分别为106.02±5.78pg/mL、54.20±11.80pg/mL，与模型组(163.97±14.48pg/mL(灭活))相比差异性显著(P<0.01)。另外，与模型组(172.44±9.68pg/mL(未灭活))相比，副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液均能显著降低LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子IL-6(74.80±6.87pg/mL、49.41±4.86pg/mL)(P<0.005)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活和未灭活的菌悬液、发酵上清液均具有抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌细胞炎症因子IL-6的作用。
由图5可知，与空白对照组(31.67±5.16pg/mL(灭活)、37.14±5.02pg/mL(未灭活))相比，模型组的炎症因子TNF-α分泌量(463.04±41.78pg/mL(灭活)、378.15±16.63pg/mL(未灭活))均显著增加(P<0.005)，说明本次LPS刺激有效。副干酪乳杆菌L.pR3-10灭活的菌悬液、发酵上清液组的TNF-α分泌量分别为292.26±44.18pg/mL、76.13±13.60pg/mL，与模型组(463.04±41.78pg/mL(灭活))相比差异性显著(P<0.005)。另外，与模型组(378.15±16.63pg/mL(未灭活))相比，副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液均能显著降低LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子TNF-α(214.81±13.28pg/mL、70.55±4.99pg/mL)(P<0.005)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活和未灭活的菌悬液、发酵上清液均具有抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌细胞炎症因子TNF-α的作用。
由图6可知，与空白对照组(34.38±4.90pg/mL(灭活)、42.75±5.24pg/mL(未灭活))相比，模型组的炎症因子PGE2分泌量(112.36±7.82pg/mL(灭活)、104.85±9.90pg/mL(未灭活))均显著增加(P<0.005)，说明本次LPS刺激有效。副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液，发酵上清液组的PGE2分泌量分别为86.95±1.85pg/mL、59.78±1.31pg/mL，与模型组(112.36±7.82pg/mL(灭活))相比差异性显著(P<0.05)。另外，与模型组104.85±9.90pg/mL(未灭活))相比，副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液均能显著降低LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌炎症因子PGE2(63.80±4.16pg/ml、54.23±3.43pg/mL)(P<0.01)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活和未灭活的菌悬液、发酵上清液均具有抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞分泌细胞炎症因子PGE2的作用。
实施例5副干酪乳杆菌L.p R3-10对中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集的影响
挑选发育至3dpf(days post fertilization)的健康斑马鱼Tg(corola:eGFP)置于6孔细胞培养板中，25条/孔，空白组加入未灭活或灭活的PBS，模型组加入未灭活或灭活的PBS，菌悬液组加入未灭活或灭活菌悬液，发酵上清液组加入未灭活或灭活发酵上清液，每孔3mL，预处理1h后，在体视显微镜下用手术刀将斑马鱼尾鳍切断，再置于6孔细胞培养板中，20条/孔，然后空白组(未切尾)加入PBS，模型组加入PBS，菌悬液组加入未灭活或灭活菌悬液、发酵上清液组加入未灭活或灭活发酵上清液，每孔3mL，孵育6h后，用三卡因将斑马鱼麻醉，在荧光显微镜下观察中性粒细胞和巨噬细胞在尾鳍伤口处聚集情况并拍照记录。以离切口处150μm以内的区域为计数范围，统计中性粒细胞和巨噬细胞的数量。采用SPSS19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure GDA0003231609080000101
数据表示，用单因素方差分析。各实验组与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
结果见图7和图8；由图7和图8可知，空白组的斑马鱼尾鳍处几乎没有中性粒细胞和巨噬细胞聚集(0.65±0.17个(灭活)、0.60±0.15个(未灭活))。而在切尾6h时，模型组的斑马鱼尾鳍伤口处有大量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时模型组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞为19.70±1.20个(灭活)、20.90±1.86个(未灭活)，与空白组(0.65±0.17个(灭活)、0.60±0.15个(未灭活))相比较差异性显著(P<0.005)，说明本次斑马鱼炎症模型建立成功。
由图7和图8可知，副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处仅有少量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞为12.75±0.67个、10.50±0.48个，与模型组(19.70±1.20个(灭活))相比较均差异性显著(P<0.005)。另外，副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处仅有少量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞为11.70±0.56个、8.85±0.37个，与模型组(20.90±1.86个(未灭活))相比较均差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活和未灭活的菌悬液、发酵上清液在体内均能显著抑制中性粒细胞和巨噬细胞往斑马鱼尾鳍炎症处聚集，表现出预防炎症性疾病的功效。
实施例6副干酪乳杆菌L.p R3-10对中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除的影响
在体视显微镜下用手术刀将发育至3dpf的健康斑马鱼Tg(corola:eGFP)的尾鳍切断，置于6孔细胞培养板中，25条/孔，每孔加入3mL PBS，孵育6h后，在荧光显微镜下挑选尾鳍伤口处聚集中性粒细胞和巨噬细胞(约20个)较多的斑马鱼进行实验。将斑马鱼置于6孔细胞培养板中，20条/孔，然后空白组(未切尾)加入未灭活或灭活的PBS，模型组加入未灭活或灭活的PBS，菌悬液组加入未灭活或灭活菌悬液，发酵上清液组加入未灭活或灭活发酵上清液，每孔3mL，孵育6h后，用三卡因将斑马鱼麻醉，在荧光显微镜下观察巨噬细胞和中性粒细胞在尾鳍伤口聚集情况并拍照记录。以离切口处150μm以内的区域为计数范围，统计中性粒细胞和巨噬细胞的数量。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用±SEM数据表示，用单因素方差分析。各实验组与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
结果见图9和图10；由图9和图10可知，空白组的斑马鱼尾鳍处几乎没有中性粒细胞和巨噬细胞聚集(0.64±0.14个(灭活)、0.68±0.15个(未灭活))。而在切尾12h时，模型组的斑马鱼尾鳍伤口处有大量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时模型组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞为18.08±1.02个(灭活)、17.18±0.91个(未灭活)，与空白组(0.64±0.14个(灭活)、0.68±0.15个(未灭活))相比较差异性显著(P<0.005)，说明本次斑马鱼炎症模型建立成功。
由图9和图10可知，副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处仅有少量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液，发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞为14.40±0.83个、8.91±0.60个，与模型组(18.08±1.02个(灭活))相比较均差异性显著(P<0.01)。另外，副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处仅有少量中性粒细胞和巨噬细胞聚集；同时副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液、发酵上清液组斑马鱼尾鳍伤口处的中性粒细胞和巨噬细胞为11.04±0.49个、7.04±0.47个，与模型组(17.18±0.91个(未灭活))相比较均差异性显著(P<0.005)。因此，上述结果表明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活和未灭活的菌悬液、发酵上清液在体内炎症模型中均能显著促进中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼尾鳍炎症处清除，表现出治疗炎症性疾病的作用。
实施例7副干酪乳杆菌L.p R3-10对斑马鱼尾鳍损伤修复的影响
挑选发育正常野生型AB系斑马鱼(3dpf)置于6孔细胞培养板中，于体视显微镜下用手术刀将斑马鱼尾鳍切断，并在0dpa(day post amputation)时拍照记录，然后转移至96孔细胞培养板中，模型组加入PBS，菌悬液组加入未灭活或灭活菌悬液，发酵上清液组加入未灭活或灭活发酵上清液，每孔200μL，每组20条，孵育至3dpa后，用三卡因将斑马鱼麻醉，置于体视显微镜下拍照记录。利用Image J软件分别统计在0dpa和3dpa时斑马鱼尾鳍长度为D1和D2。D1和D2之间的差值就是斑马鱼尾鳍再生生长度。采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用
Figure GDA0003231609080000121
数据表示，用单因素方差分析。各实验组与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005。
结果见图11-14；由图11和图12可知，模型组的斑马鱼尾鳍未长完整，尾鳍再生长长度为63.44±2.45μm。副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活的菌悬液和发酵上清液组的斑马鱼尾鳍几乎已经长完整，尾鳍再生长长度分别为76.03±2.62μm和85.67±3.28μm，与模型组(63.44±2.45μm(灭活))相比差异性显著(P<0.005)。
由图13和图14可知，模型组的斑马鱼尾鳍未长完整，尾鳍再生长长度为59.96±4.93μm。副干酪乳杆菌L.p R3-10未灭活的菌悬液和发酵上清液组的斑马鱼尾鳍几乎已经长完整，尾鳍再生长长度分别为83.20±2.13μm和88.88±3.26μm，与模型组(59.96±4.93μm(未灭活))相比差异性显著(P<0.01)。
因此，上述结果表明副干酪乳杆菌L.p R3-10灭活和未灭活的菌悬液、发酵上清液能够促进斑马鱼尾鳍的损伤修复，具有增强口腔组织的自身修复能力的潜力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物、护理制品中的应用，所述副干酪乳杆菌L.p R3-10的保藏编号为CGMCC No.19520。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物、护理制品中的应用，其特征在于，所述炎症性疾病为牙龈炎或牙周炎。
3.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌L.p R3-10在制备预防或治疗口腔炎症性疾病药物、护理制品中的应用，其特征在于，所述护理制品为牙膏、牙用凝胶、牙粉、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫、漱口剂、口喷剂、牙线或锭剂。
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