CN113881751A - 口腔菌液载体的应用 - Google Patents

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CN113881751A CN202111115108.1A CN202111115108A CN113881751A CN 113881751 A CN113881751 A CN 113881751A CN 202111115108 A CN202111115108 A CN 202111115108A CN 113881751 A CN113881751 A CN 113881751A
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徐昌隆
潘彬惠
徐升
许志华
王方岩
施江敏
陈耀宣
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms

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Abstract

本发明公开了口腔菌液载体的应用，属于微生态及生物组学检测技术领域。本发明公开口腔菌液载体的应用，所述口腔菌液载体无菌条件下置于口腔内过夜，提取口腔内菌液；其中，所述口腔菌液载体包括任何可利用口腔前庭沟的物质。所述口腔菌液载体应用于提取口腔菌液研究口腔微生态及释放相关菌群代谢产物调节口腔微生态，该口腔菌液载体可吸收口腔中的原生态唾液，通过一系列宏基因组学、蛋白组学、转录组学等生物组学技术，可以发现口腔原生态的构成特点，进一步探索口腔及全身相关疾病与口腔微生态的联系，此外，可通过口腔菌液载体人工干预口腔原生态环境，为口腔保健及全身相关性疾病的治疗提供新的靶点。

Description

口腔菌液载体的应用
技术领域
本发明涉及微生态及生物组学检测技术领域，特别是涉及一种口腔菌液载体的应用。
背景技术
微生物存在于人类生活的各个角落，影响着人类生活的方方面面。人类的口腔中存在许多不同微生物的栖息地。成年人口腔中约有500-1000亿细菌，其中占主要部分的有200多种。口腔中各个物种通过与宿主互作对宿主的健康及疾病产生影响。多种口腔微生物的协同和相互作用，可以帮助人体抵御外界不良刺激的入侵。然而，口腔微生物同时也在某些疾病的起始及恶化中扮演着重要的角色，此时口腔微生态平衡被打破，致病菌特别是兼性厌氧菌大量繁殖，通过直接入侵，或引起免疫-炎症反应并扩散至全身循环中，从而导致了疾病的发生。大量的研究表明，失衡的口腔菌群不仅与龋齿、牙周炎、口腔癌症等多种口腔疾病相关，还在全身系统性疾病的发生发展中起着重要的作用。炎症性肠病、胃肠癌症、肝硬化、胰腺癌、糖尿病、不良妊娠结局、肥胖、多囊卵巢综合征，以及某些神经、免疫、心血管系统疾病，都被证明与口腔致病菌群息息相关。除此之外，作为全身微生态系统的一份子，与身体其他部位相比，口腔中的菌群独特且易于获得。因此，通过研究受试者口腔中的微生态系统以研究系统性疾病，是一种无创、简单且有效的手段。
目前，临床上研究口腔微生态系统的方式包括牙菌斑、漱口水、唾液采集器等多种方法，但是这些方法都存在一定的局限性。如唾液采集器或者使用漱口水采集唾液，由于受试者口腔暴露容易影响口腔微生态环境，且最终研究结果极易受唾液供者的口腔唾液分泌条件影响，因此无法客观、准确地反映真实的口腔微生态情况；牙菌斑的局部内环境及菌群的构成较为稳定，能更好地反映口腔的微生态情况，因此被广泛应用于临床试验，但是牙菌斑的供给量较少，对提取技术的要求较高，大大局限了后续的进一步研究。由此可见，提取口腔菌群方式的多样性、不稳定性将导致信息提取的不准确性、混杂性。因此，目前研究中亟需一种简易、稳定且精确的提取口腔微生态信息的方式。
口腔前庭沟为位于唇、颊与牙列、牙龈及牙槽骨、牙弓之间的蹄铁形的潜在腔隙，此处温暖潮湿，密闭性好，是口腔微生物特别是厌氧致病菌易于聚集性生长之处。利用此间隙容纳异物的能力，可构建一种吸水性强、异物感弱的载体模型，利用该载体对口腔原生态菌液进行提取，研究口腔微生态及相关代谢产物的构成，从而更好地获取真实的口腔微生态情况，不仅为口腔相关疾病提供一种新的治疗方式，也可利用该载体人工干预口腔原生态环境，从而为口腔保健提供一种新的方式。除此之外，这也为全身系统性疾病相关机制的研究及治疗提供新的靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种口腔菌液载体的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过提供的口腔菌液载体提取口腔菌液，可以针对目前研究口腔微生态环境所需载体的局限性，提供一种更为有效且便捷的技术手段。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供口腔菌液载体的应用，所述口腔菌液载体无菌条件下置于口腔内过夜，提取口腔内菌液；其中，所述口腔菌液载体包括任何可利用口腔前庭沟的物质。
优选的是，所述口腔菌液载体的材料来源于天然或者人工合成的物质。
优选的是，所述口腔菌液载体包括天然纤维制品、人工合成纤维制品或有机高分子材料。比如：纯棉纱布、纯纤纱布、混纺纱布、有机高分子水凝胶材料等，但是不限于此，只要是天然柔和，与口腔黏膜接触无刺激，不被微生物所发酵，无侵袭性，无明显异物感，无异味，无污染的口腔菌液载体均可以使用。
优选的是，所述口腔菌液载体置于口腔前庭沟内。
优选的是，所述口腔菌液载体上还包括人工干预口腔菌群的制剂。所述制剂可以为化学制剂或者生物制剂，更具体的可以为凝胶、益生菌、益生元等，但不限于此。
本发明还提供了所述的口腔菌液载体在研究口腔微生态结构以及释放相关菌群代谢产物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的口腔菌液载体应用在探究口腔微生态结构的研究中，口腔菌液载体可吸收口腔中的原生态唾液，通过一系列宏基因组学、蛋白组学、转录组学等生物组学技术研究发现：以棉条为例的口腔菌液载体具有良好的反映口腔菌群代谢情况的作用，且此效果显著于单纯通过唾液采集器提取的唾液；还可以更为丰富、均匀、完整的反映口腔微生态情况，显著影响口腔的微生态组成以及显著改变口腔的整体群落结构和差异标记物，所以本发明通过试验证明了可以良好地利用口腔菌液载体在口腔前庭沟提取口腔菌液研究口腔微生态及释放相关菌群代谢产物调节口腔微生态。综上所述，本发明可以为进一步探索口腔及全身相关疾病与口腔微生态的联系提供新的方向和方法，也可通过口腔菌液载体人工干预口腔原生态环境，为口腔保健及全身相关性疾病的治疗提供新的靶点。
附图说明
图1为口腔前庭沟示意图；
图2为受试者A分别通过唾液采集器(Sali 1)及棉条(Cott 1)采集的菌液标本的分析结果；
图3为受试者B分别通过唾液采集器(Sali 2)及棉条(Cott 2)采取的菌液标本的分析结果；
图4为根据受试者A分别通过唾液采集器(Sali 1)及棉条(Cott 1)采集的菌液标本分析结果绘制的Rank Abundance曲线；
图5为根据受试者B分别通过唾液采集器(Sali 2)及棉条(Cott 2)采取的菌液标本分析结果绘制的Rank Abundance曲线；
图6为为基于属(genus)水平的最大丰度排名物种柱状图；A:受试者A分别通过唾液采集器(Sali 1)及棉条(Cott 1)采集的菌液标本中物种丰度排名前20的菌类；B:受试者B分别通过唾液采集器(Sali 2)及棉条(Cott 2)采集的菌液标本中物种丰度排名前10的菌类；
图7为龋齿组第0天和第8天之间比对绘制韦恩图；
图8为正常组第0天和第8天之间比对绘制韦恩图；
图9为龋齿组第0天和正常组第0天比对绘制韦恩图；
图10为龋齿组第8天和正常组第8天比对绘制韦恩图；
图11为龋齿组与正常对照组之间基于属水平的物种注释及丰度信息；
图12为龋齿组与正常对照组之间的物种复杂度分析(Alpha Diversity)，展示的是所有样本不同组别间的物种总数的散点分布，即丰富度；
图13为龋齿组与正常对照组之间的物种复杂度分析(Alpha Diversity)，展示的是所有样本不同组别间Shannon指数的比较图；
图14为龋齿组与正常对照组之间基于Weighted Unifrac距离PCoA分析；
图15为龋齿组与正常对照组之间基于Unweighted Unifrac距离PCoA分析；
图16为龋齿组与正常对照组之间PCA分析；
图17为龋齿组与正常对照组之间NMDS分析；
图18为龋齿组与正常对照组中基于属水平的物种显著性差异分析；A为正常对照组益生菌棉条干预之后存在显著差异的物种；B为龋齿组益生菌棉条干预之后存在显著差异的物种；
图19为为龋齿组与正常对照组中的物种LDA值分布柱状图；A为龋齿组和正常对照组之间的差异物种；B为正常对照组益生菌棉条干预前后的差异物种；C为龋齿组益生菌棉条干预前后的差异物种；
图20为总离子流色谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
实施例
本发明以无菌棉条构建的口腔菌液载体为例，对其提取的口腔菌液进行了后续的相关分析。
利用无菌棉条及唾液采集器分别提取受试者的唾液标本，采取16S扩增子分析技术及靶向代谢组学技术，观察对比无菌棉条中的微生物组成及相应的短链脂肪酸浓度，从而研究无菌棉条对于反映口腔微生态的有效性；其次，利用浸润益生菌的棉条建立口腔微生态的人工干预模型，采取16S扩增子分析技术,观察对比干预前后龋齿受试者与正常对照组受试者的口腔微生态变化。
一、材料与方法
1、药物和试剂
无菌棉球：南昌市恩惠医用卫生材料有限公司；康宁Corning无菌冻存管：Corning股份有限公司；无菌镊子：扬州市霞光医疗器械有限公司；唾液采集器：杭州新景生物试剂开发有限公司；冻干菌粉：上海奕农生物科技有限公司。
2、试验分组
受试者和分组：
受试者来自温州医科大学附属第二医院消化内科研究生，该研究严格遵守赫尔辛基宣言。
10名受试者分为2组(n＝5/组)：龋齿组、正常对照组。
3、样品采集
棉条菌液采集有效性观察：
选取正常对照组中的2名受试者，分别通过无菌棉条及唾液采集器采集口腔唾液，对比分析其唾液中的菌群组成及短链脂肪酸含量。具体操作过程如下：
3.1无菌棉条留取棉条唾液：
(1)将无菌棉球制成长约1cm的无菌棉条；
(2)受试者分为2组(n＝1/组，受试者A和B)。由同一工作人员于受试者
入睡前将无菌棉条用无菌镊子置于口腔内过夜，位置为双侧下颌第一磨牙与正对颊粘膜之间的空隙；
(3)嘱受试者勿有意识地将棉条移位，并嘱受试者入睡至次晨勿饮水、漱口、饮食、刷牙；
(4)次晨5点由同一工作人员用无菌镊将无菌棉条取出，置于2ml冻存管中，记录湿重，并记录取出棉条位置，保存于-80℃冰箱中。
3.2唾液采集器采集液体唾液:
(1)受试者分为2组(n＝1/组，受试者A和B)。在采集唾液样本前30分钟，取出受试者口腔中棉条，嘱受试者用饮用水将口腔内的杂物洗漱干净；
(2)用舌尖抵住上颚或下颚齿根以富集唾液，向采集漏斗中轻轻吐入唾液，直至液体唾液(非气泡)达到刻度线高度；
(3)工作人员手持唾液采集管，令其处于直立，并用另一只手协助将采集漏斗旋下；
(4)从采集管底部取下采集管管盖，并用管盖将采集管拧紧；
(5)上下颠倒采集管5次，使唾液与唾液保存液充分混匀，丢弃使用过的采集漏斗。
3.3益生菌棉条干预口腔微生态：
将浸润冻干菌粉的益生菌棉条，分别置于龋齿组及正常对照组的口腔中过夜，次晨取出。重复7日后，检测受试者口腔中的细菌，观察分析组成变化。具体步骤如下：
(1)受试者分为2组(n＝5/组，龋齿组和正常对照组)。第0天，利用无菌棉条留取分别留取两组受试者的口腔菌液，具体方法如前所述；
(2)益生菌棉条制备：①将无菌棉球制成长约1cm的无菌棉条；②用1ml 0.9％生理盐水将冻干菌粉融化后浸润无菌棉条，使棉条充分吸收富含益生菌的液体；
(3)将益生菌棉条置于两组受试者的口腔中过夜，位置为双侧下颌第一磨牙与正对颊粘膜之间的空隙，次晨取出丢弃，重复7天；
(4)第8天，再次利用无菌棉条留取两组受试者的口腔菌液，方法如前所述。
4、试验方法
采集所得样本检测菌群组成及短链脂肪酸含量
4.1 16S rDNA扩增子测序
4.1.1主要试剂
CTAB裂解液、琼脂糖凝胶(基因组DNA--胶浓度：1％电压：100v电泳时间：40min；PCR产物--胶浓度：2％电压：80v电泳时间：40min)、酚(PH8.0)、氯仿、异戊醇、酶和缓冲液(New England Biolabs公司)、产物纯化试剂盒(Thermo Scientific公司)、TruSeq DNAPCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒(Illumina公司)。
4.1.2主要仪器平台
水浴锅、高速离心机、PCR Bio-rad T100梯度PCR仪。
4.2方法
4.2.1测序部分
4.2.1.1基因组DNA的提取和PCR扩增
采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。
以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物(表1)，New England Biolabs公司的
Figure BDA0003275303180000061
High-Fidelity PCR Master Mix with GCBuffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。
引物对应区域：
16S V4区引物(515F和806R)：鉴定细菌多样性；
18S V4区引物(528F和706R)：鉴定真核微生物多样性；
ITS1区引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)：鉴定真菌多样性；
此外，扩增区域还包括：16S V3-V4/16S V4-V5/16SV5-V7；古菌16S V4-V5/古菌16S V8；18S V9和ITS2区。
表1引物序列
Figure BDA0003275303180000071
4.2.1.2 PCR产物的混样和纯化
PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。
4.2.1.3文库构建和上机测序
使用
Figure BDA0003275303180000072
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
4.2.2信息分析部分
4.2.2.1测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样本的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；拼接得到的Raw Tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。质量控制流程操作如下：a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75％的Tags。经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。
4.2.2.2 OTU聚类和物种注释
利用Uparse算法对所有样本的全部Effective Tags进行聚类，默认以97％的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA138的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。使用MUSCLE软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
4.2.2.3样本复杂度分析(Alpha Diversity)
使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree指数，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线，Rank abundance曲线，物种累积曲线并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析；Alpha多样性指数组间差异分析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
Alpha多样性指数具体描述如下：
计算菌群丰度(Community richness)的指数有:
Chao-the Chao1 estimator；
ACE-the ACE estimator；
计算菌群多样性(Community diversity)的指数有:
Shannon-the Shannon index；
Simpson-the Simpson index。
测序深度指数有：
Coverage-the Good’s coverage。
系统发育多样性的指数有：
PD_whole_tree-PD_whole_tree index。
4.2.2.4多样本比较分析(Beta Diversity)
用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Unifrac距离、构建UPGMA样本聚类树。使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCA，PCoA和NMDS图。PCA分析使用R软件的ade4包和ggplot2软件包，PCoA分析使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包，NMDS分析使用R软件的vegan软件包。使用R软件进行Beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。
LEfSe分析使用LEfSe软件，默认设置LDA Score的筛选值为4。Metastats分析使用R软件在各分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species)下，做组间的permutation test，得到p值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate方法对于p值进行修正，得到q值。Anosim，MRPP和Adonis分析分别使用R vegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。AMOVA分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用R软件做组间T_test检验并作图。
4.2.2.5环境因子关联分析
在进行Spearman相关性分析时，首先用R中psych包的corr.test函数计算物种和环境因子的Spearman相关系数值并检验其显著性，然后用pheatmap包中的pheatmap函数进行可视化。
Mantel test使用的是R中的vegan包，根据物种矩阵和提供的环境因子数据矩阵，首先使用vegdist函数对两类数据进行距离矩阵的转化，然后用mantel函数对两类矩阵进行spearman相关性分析得到r和P值。
对于CCA和RDA，使用的是vegan包中的cca和rda函数进行的排序分析，通过envfit函数可以计算出每个环境因子对物种分布影响的r2和P值，然后用筛选出具有显著影响的环境因子做CCA和RDA分析。通过vegan包中的bioenv函数，能够筛选出与物种矩阵相关性(spearman)最大的环境因子或组合，将筛选得到的环境因子再进行针对性的CCA和RDA分析。VIF(Variance inflation)使用的是vegan包中的vif.cca函数对冗余约束的环境因子进行筛选，然后使用非冗余的环境因子进行CCA和RDA分析。
VPA(variance partial analysis)属于部分分析方法(partial method)，使用vegan包中的rda(X,Y,Z)来分析主环境因子(Y)和协环境因子(Z)对物种分布(X)的影响，可以量化某类环境因子对物种分布的解释量。
4.2.2.6网络图
基于物种丰度，计算各菌属之间的相关系数值(斯皮尔曼相关系数SCC或皮尔森相关系数PCC)，得到相关系数矩阵，设定过滤条件：(a)设定cutoff值(>0.6)过滤掉弱相关的连接；(b)过滤掉节点自连接；(c)去掉节点丰度小于％0.005的连接；根据过滤后的相关系数值，以菌属为节点，值为边，使用graphviz-2.38.0进行网络图的绘制。
4.2.2.7功能注释
FunGuild是真菌的环境功能数据库，基于已有文献支持，对真菌的生态功能进行了归类，构建了FunGuild数据库。基于扩增子分析得到的物种信息，可以查询文献中已有的物种在环境中的生态功能。
FAPROTAX是原核生物环境功能数据库，作者基于已发表文献证据，将细菌及古菌在环境中的生态作用进行归类，汇总整理为FAPROTAX数据库。基于扩增子物种注释结果，可以对数据库进行查询，获得已有文献支持的物种的环境功能信息。
Tax4Fun功能预测是通过基于最小16S rRNA序列相似度的最近邻居法实现的，其具体做法为提取KEGG数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列并利用BLASTN算法将其比对到SILVA SSU Ref NR数据库(BLAST bitscore>1500)建立相关矩阵，将通过UProC和PAUDA两种方法注释的KEGG数据库原核生物全基因组功能信息对应到SILVA数据库中，实现SILVA数据库功能注释。测序样品以SILVA数据库序列为参考序列聚类出OTU，进而获取功能注释信息。
PICRUSt的全称是Phylogenetic Investigation of Communities byReconstruction of Unobserved States。它基于Greengene数据库中OTU的tree，和OTU上的基因信息，推断它们的共同祖先的基因功能谱，同时对Greengenes数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱，最后将测序得到的菌群组成“映射”到数据库中，就能进行菌群代谢功能预测了。
BugBase以OTU表(有参聚类，参考序列：Greengenes 97％OTU dataset)作为输入文件，首先，通过预测的16S拷贝>数对OTU表进行标准化处理；然后，使用预先处理好的数据库和BugBase工具自动选择的阈值来预测微生物表型。
靶向代谢组学检测
4.3试剂及仪器
4.3.1主要试剂
磷酸(国药)，乙醚(国药)，乙酸(sigma≥99.5％)，丙酸(sigma>99.0％)，丁酸(sigma>99.0％)，异丁酸(sigma>99.0％)，戊酸(sigma>98.0％)，异戊酸(sigma>99.0％)，己酸(阿拉丁≥99.5％)，异己酸(sigma＞98％)。
4.3.2主要仪器平台
Thermo TRACE 1310-ISQ气-质联用仪(Thermo，美国)、涡旋仪(QL-866)、冷冻离心机(湘仪，H1850R)。
4.4实验方法
4.4.1标准品配置
量取乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸纯标准品适量，用乙醚配制成0.02μg/mL，0.1μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL十个混合标准浓度梯度。短链脂肪酸的信息见表2。母液及工作标准溶液均保存0℃。
4.4.2样品前处理
取适量样本，加50μL15％磷酸，再加75μg/mL的内标(异己酸)溶液10μL和乙醚140μL匀浆1min，于4℃12000rpm离心10min，取上清上机测试。
4.4.3GC-MS检测方法
色谱条件：色谱柱Agilent HP-INNOWAX毛细管柱(30m*0.25mm ID*0.25μm)；分流进样，进样量1μL，分流比10:1。进样口温度250℃；离子源温度230℃；传输线温度250℃，四极杆温度150℃。程序升温起始温度90℃；然后以10℃/min升温至120℃；再以5℃/min升温至150℃；最后以25℃/min升温至250℃维持2min。载气为氦气，载气流速1.0mL/min。MS条件：电子轰击电离(EI)源，SIM扫描方式，电子能量70eV。
表2短链脂肪酸物质信息
编号 中文名 英文名 CAS
1 乙酸 Acetic acid 64-19-7
2 丙酸 Propionic acid 79-09-4
3 异丁酸 Isobutyric acid 79-31-2
4 丁酸 Butyric acid 107-92-6
5 异戊酸 Isovaleric acid 503-74-2
6 戊酸 Valeric acid 109-52-4
7 己酸 Caproic acid 142-62-1
4.5方法验证
4.5.1总离子流色谱图(TIC)
如图20所示，从TIC图可看出，8个短链脂肪酸均能够区分，其中内标(异己酸)出峰时间为9.35分钟，与其他短链脂肪酸标准品明显分离，表明方法良好。
4.5.2标准曲线和定量限
对短链脂肪酸标准液的浓度系列分别进行GC-MS检测，以标准品的浓度为横坐标，标准品与内标的峰面积比值为纵坐标考察线性。得到的各物质的线性回归方程见下表3。相关系数r>0.99。
表3 7种短链脂肪酸标准品的线性回归方程、精密度、重复性和定量限
Figure BDA0003275303180000121
4.5.3方法学
4.5.3.1精密度
将混标浓度为25μg/mL的标准样品连续进样六次，计算日内精密度，以RSD表示。每天处理一份5μg/mL标准样品于第一天、第二天、第三天测定，计算日间精密度，以RSD表示。日内精密度在1.57％～3.75％之间，日间精密度在6.15％～11.08％之间，表明仪器的精密度良好。结果详见表2。
4.5.3.2重复性
重复处理六份样本，按“4.4.2样本前处理”进行，得到浓度计算重复性，以RSD表示。结果详见表3。
4.5.3.3回收率
以低中高浓度质控样本按照“4.4.2样本前处理”平行处理六份(低浓度-LQC质控样本，中浓度MQC质控样本，高浓度-HQC质控样本，以下表格均使用简写LQC、MQC、HQC)，在同一天测定回收率，由于短链脂肪酸各物质属于内源性物质，因此回收率＝(实际值-理论值)/加入量*100％。结果详见表4。
表4回收率结果
Figure BDA0003275303180000122
Figure BDA0003275303180000131
二、实验结果
1、根据建立的样品前处理及仪器分析方法，对液体唾液样品及棉条唾液样本进行短链脂肪酸定量分析。结果见表5。
表5样本短链脂肪酸定量结果
Figure BDA0003275303180000132
短链脂肪酸取样量单位为μL，短链脂肪酸定量单位为μg/mL，ND表示notdetected。
注：表格中的浓度(μg/mL)＝(峰面积比值-b)/a，a值和b值的来源见表3，a为斜率,b为截距
除己酸外的6种酸：含量(μg/mL)＝浓度(μg/mL)*100/取样量(μL)
己酸：含量(μg/mL)＝浓度(μg/mL)*150/取样量(μL)
为了研究口腔菌液载体中微生物代谢情况，我们分析了棉条及唾液中的短链脂肪酸含量。对比发现，棉条中的短链脂肪酸含量显著高于唾液中的短链脂肪酸含量。上述数据表明，以棉条为例的口腔菌液载体具有良好的反映口腔菌群代谢情况的作用，且此效果显著于单纯通过唾液采集器提取的唾液。
2、根据聚类得到OTUs结果和研究需求，对棉条唾液及液体唾液进行均一化处理，分析液体唾液与棉条唾液之间共有、特有的OTUs。通过韦恩图可以发现，棉条唾液与液体唾液之间存在大量重叠的功能单位，而图3可以看到棉条唾液相比于液体唾液拥有的功能单位总数更多，即棉条这一口腔菌液载体可检测到的微生物更丰富。
将样本中的OTUs按相对丰度(或者包含的序列数目)由大到小排序得到对应的排序编号，再以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度(也可用该等级OTU中序列数的相对百分含量)为纵坐标,将这些点用折线连接，即绘制得到Rank Abundance曲线，它可直观的反映样本中物种的丰富度和均匀度。在图4中，Sali 1:受试者A通过唾液采集器采集的菌液标本Cott 1:受试者A通过棉条采集的菌液标本；在图5中，Sali 2:受试者B通过唾液采集器采集的菌液标本Cott 2:受试者B通过棉条采集的菌液标本。如图4和图5所示，曲线中棉条唾液在横坐标上的跨度更大，表示棉条唾液中的物种更丰富于液体唾液；棉条唾液在纵坐标水平更为平坦，表明棉条中物种分布更为均匀。由此表明，以棉条为例的口腔菌液载体可以更为丰富且均匀的反映口腔微生态情况。
3、如图12-13所示，根据对比可以发现，棉条唾液与液体唾液之间的菌群构成相似，且棉条唾液中相对可测的微生物较液体唾液更为完整。该检测表明，以棉条为例的口腔菌液载体可更为完整的反映口腔微生态情况。
4、根据聚类得到OTUs结果和研究需求，分析不同样本(组)之间共有、特有的OTUs，韦恩图的绘制是对所有样本进行均一化处理之后进行的。如图7-10所示，图中每个圈代表一组样本，圈和圈重叠部分的数字代表样本(组)之间共有的OTUs个数，没有重叠部分的数字代表样本(组)的特有OTUs个数。C0:正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8:正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0:龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8:龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。通过上图可以看出，龋齿组和正常对照组之间的口腔菌群组成存在显著的差异，且益生菌棉条干预可以影响龋齿组和正常对照组中的口腔菌群。由此得出，以棉条为例的口腔菌液载体能够显著影响口腔的微生态组成。
5、如图11所示，纵向为样本信息，横向为物种注释信息，图中左侧的聚类树为物种聚类树；热图对应的值为每一行物种相对丰度经过标准化处理后得到的Z值，即一个样本在某个分类上的Z值为样本在该分类上的相对丰度和所有样本在该分类的平均相对丰度的差除以所有样本在该分类上的标准差所得到的值。C0:正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8:正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0:龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8:龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。由图可见，龋齿组及对照组之间存在菌群差异，且无论是龋齿组还是正常对照组，益生菌棉条干预之后的口腔菌群组成均存在差异。该检测提示，可通过以棉条为例的口腔菌液载体人工干预口腔微生态。
6、如图12-13所示，图中A展示的是所有样本不同组别间的物种总数的散点分布，即丰富度；B为Shannon指数的比较图，反映的是不同样本间物种多样性和均一性的差别。C0:正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8:正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0:龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8:龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。通过Wilcoxon秩和检验，发现测得的物种数在C8-T8两组间具有明显的差异(p<0.05)，显著性p值为0.0345。测得的物种数在C0-T8、T0-T8、C8-T0等两组间不具有明显的差异(p>0.05)，p值为0.1297、0.1650、0.4047等。Shannon指数在C8-T0、C0-T0、C8-T8两组间具有明显的差异(p<0.05)，显著性p值为0.0037、0.0221、0.0376。Shannon指数在C0-T8、T0-T8、C0-C8两组间不具有明显的差异(p>0.05)，p值为0.1806、0.2738、0.3989。由此可见，益生菌棉条可影响口腔菌液的丰富度及多样性，虽然不具有显著的统计学意义。上述数据表明，以棉条为例的口腔菌液载体可对口腔微生态造成一定的影响。
7、如图14-17所示，Beta Diversity是对不同样品的微生物群落组成进行比较分析。通常用Unifrac距离(以物种间的遗传序列信息为参考)和Bray-Curtis距离(考虑物种的有无和丰度两个方面)进行降维分析。图中A为基于Weighted Unifrac距离PCoA分析，B为基于Unweighted Unifrac距离PCoA分析，横坐标表示一个主成分，纵坐标表示另一个主成分，百分比表示主成分对样本差异的贡献值。C为PCA分析，横坐标表示第一主成分，百分比则表示第一主成分对样本差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，百分比表示第二主成分对样本差异的贡献值。D为NMDS分析，图中的每个点表示一个样本，点与点之间的距离表示差异程度，同一个组的样本使用同一种颜色表示。Stress小于0.2时，说明NMDS可以准确反映样本间的差异程度。C0:正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8:正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0:龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8:龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。由此可见，龋齿组和正常对照组之间的口腔菌群存在差异，且益生菌棉条干预下的口腔菌群存在明显的差异。以上表明，可利用以棉条为例的口腔菌液载体干预口腔微生态环境。
8、从属水平的物种丰度出发，通过T-test得到差异物种信息。结果如图18所示，图中A为正常对照组益生菌棉条干预之后存在显著差异的物种；B为龋齿组益生菌棉条干预之后存在显著差异的物种。C0:正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8:正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0:龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8:龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。P﹤0.05：有显著的统计学差异。右图所示，益生菌棉条干预之后，正常对照组马赛菌属及节杆菌属显著升高，毛螺旋菌属显著降低；而在龋齿组中，泛菌属及嗜二氧化碳噬细胞菌属在益生菌棉条干预之后显著升高。由此可见，以棉条为例的口腔菌液载体能够显著改变口腔的整体群落结构。
9、利用LEfSe分析对组间的物种丰度数据通过秩和检验的方法检测不同分组间的差异物种并通过LDA(线性判别分析)实现降维从而评估差异物种的影响大小，即得到LDAscore，最后绘制差异物种的LDA值分布柱状图，如图19所示。LDA值分布柱状图中展示了LDAScore大于设定值(默认设置为4)的物种，即组间具有统计学差异的标记物。展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小(即为LDA Score)。图中A为龋齿组和正常对照组之间的差异物种；B为正常对照组益生菌棉条干预前后的差异物种；C为龋齿组益生菌棉条干预前后的差异物种。C0:正常对照组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；C8:正常对照组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息；T0:龋齿组第0天，即益生菌棉条干预前口腔菌液的物种信息；T8:龋齿组第8天，即益生菌棉条干预后口腔菌液的物种信息。图中所见，龋齿组和正常对照组之间，普氏菌属存在显著差异，益生菌棉条干预之后，在正常对照组中，变形杆菌和丙型变形杆菌显著升高，而厚壁菌显著降低；在龋齿组中，黄杆菌显著升高。由此可以提示，以棉条为例的口腔菌液载体能够显著改变口腔的差异标记物。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.口腔菌液载体的应用，其特征在于，所述口腔菌液载体无菌条件下置于口腔内过夜，提取口腔内菌液；其中，所述口腔菌液载体包括任何可利用口腔前庭沟的物质。
2.如权利要求1所述的口腔菌液载体的应用，其特征在于，所述口腔菌液载体的材料来源于天然或者人工合成的物质。
3.如权利要求2所述的口腔菌液载体的应用，其特征在于，所述口腔菌液载体包括天然纤维制品、人工合成纤维制品或有机高分子材料。
4.如权利要求1所述的口腔菌液载体的应用，其特征在于，所述口腔菌液载体置于口腔前庭沟内。
5.如权利要求1所述的口腔菌液载体的应用，其特征在于，所述口腔菌液载体上还包括人工干预口腔菌群的制剂。
6.如权利要求1-5任一项中所述的口腔菌液载体在研究口腔微生态结构以及释放相关菌群代谢产物中的应用。
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