CN112501070B - 原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和应用。其中，原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，按重量组分计，包括：混合蛋白胨10‑20份、酵母浸出粉5‑10份、氯化钠1‑5份、琼脂10‑15份、葡萄糖0.5‑1.0份、碳酸氢钠0.2‑0.8份、L‑半胱氨酸盐0.1‑0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1‑0.5份、血红素0.0001‑0.0005份、维生素K 0.00001‑0.00005份、水500‑1000份和无菌脱纤维绵羊血5‑10份。通过采用本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，大大缩短原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养周期，能快速原代分离牙龈卟啉单胞菌。

Description

原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基及其制备方法和应用。

背景技术

牙周炎是一种常见的口腔慢性炎症性疾病，多发于35岁以上人群。由牙龈及牙周支持组织上的微生物感染引起。其中，“红色复合体”是导致牙周炎的重要因素。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）是一类革兰氏阴性厌氧细菌，Pg在人体口腔、消化系统、心血管、大脑等部位均有分布。据研究报道，Pg作为“红色复合体”的“基石”细菌之一，可通过多种途径与宿主细胞相互作用引发病变部位炎症，与口腔炎症、口腔颌面部肿瘤、消化道肿瘤、阿尔兹海默症及其他系统性疾病相关。口腔是Pg最主要的栖居地，在牙周袋、龈沟、齿间、舌面、牙龈等部位均可检测到Pg。体外培养是研究Pg致病性及牙周炎、消化道肿瘤等相关疾病的重要方法。

已有技术中，牙周炎致病厌氧菌的培养基多采用TSB agar、Schaedler's agar等培养基，这些培养基营养成分丰富，可以培养的细菌较为广谱，不仅能有效培养Pg，还可以培养其他非目标杂菌，对Pg的原代分离产生很大阻碍；并且，因这些培养基还为其他非目标细菌提供丰富的营养，不能很好的满足Pg所需的全部要求；再者，Pg通常需要在厌氧条件下培养5-7天，才会形成特征性的黑色克隆，而长时间的培养，也有助于其他非目标杂菌的生长，从而为原代分离Pg带来了更大的困难，需要更长的筛选周期才能实现对Pg的分离。

因此，需要提供一种能够从诸多细菌中快速原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，能够在短时间内为临床研究提供高纯度的原代分离牙龈卟啉单胞菌。

本发明的目的之二在于提供一种上述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，按重量组分计，包括混合蛋白胨10-20份、酵母浸出粉5-10份、氯化钠1-5份、琼脂10-15份、葡萄糖0.5-1.0份、碳酸氢钠0.2-0.8份、L-半胱氨酸盐0.1-0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1-0.5份、血红素0.0001-0.0005份、维生素K 0.00001-0.00005份、水 500-1000份和无菌脱纤维绵羊血5-10份。

优选地，包括混合蛋白胨15份、酵母浸出粉6份、氯化钠2.5份、琼脂15份、葡萄糖1.0份、碳酸氢钠0.4份、L-半胱氨酸盐0.5份、可溶性焦磷酸钠0.25g、血红素0.0005份、维生素K 0.00005份、水1000份和无菌脱纤维绵羊血10份；或者，

混合蛋白胨10份、酵母浸出粉5份、氯化钠2份、琼脂10份、葡萄糖0.5份、碳酸氢钠0.3份、L-半胱氨酸盐0.4份、可溶性焦磷酸钠0.15g、血红素0.0004份、维生素K 0.00004份、水700份和无菌脱纤维绵羊血7份。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，包括如下步骤：

按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L-半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1 L，混匀，获得混合物溶液；

将混合物溶液高压灭菌，然后冷却处理；

按比例加入血红素储存液、维生素储存液和无菌脱纤维绵羊血至冷却后的混合物溶液中，混匀，获得液态培养基；

将液态培养基倒平板，冷却，获得固态培养基。

进一步地，所述混合物溶液高压灭菌的温度为120~125℃，时间为10~20分钟；

所述混合物溶液的冷却处理步骤包括：高压灭菌完成后，待温度降至65~75℃时，置于60℃水浴锅中。

进一步地，加入所述血红素储存液之前，还包括血红素储存液的制备步骤，具体步骤如下：

按比例将血红素和K₂HPO₄加入到去离子水中，混匀，煮沸灭菌，获得血红素储存液。

进一步地，按重量组分计，所述血红素为0.5份，所述K₂HPO₄为1.74份，所述去离子水为100份。

进一步地，加入所述维生素K储存液之前，还包括维生素K储存液的制备步骤，具体步骤如下：

按比例将维生素K和无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液。

进一步地，按重量组分计，所述维生素K为0.5份，所述无水乙醇为100份。

进一步地，加入所述无菌脱纤维绵羊血之前，需将所述无菌脱纤维绵羊血放入40~45℃水浴锅中预热。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用：

将上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放置于37℃培养箱中，厌氧条件下过夜；

取样，采用分区连续划线法，将样本接种至所述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上；

将接种后的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放于37℃培养箱中，厌氧条件下培养7天；

观察平板上的菌落形态，挑取黑色圆形的单克隆至TSB液体培养基中，进行PCR鉴定；

对鉴定为牙龈卟啉单胞菌阳性的菌液，继续采用分区连续划线法，接种至另一个原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上，厌氧条件下培养直至平板上长出单一的牙龈卟啉单胞菌克隆；

其中，厌氧条件为：90% N₂，5% CO₂，5% H₂；TSB液体培养基由重量组分为30份 的TSB和5份的酵母提取物加入到1L的无菌水配制而成。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：通过加入混合蛋白胨，可以最大限度地刺激细菌的生长；通过加入氯化钠，能够有效维持细菌渗透压平衡；通过加入碳酸氢钠，可使培养基具有去毒化作用；通过加入血红素，有效促进厌氧菌产生黑色素；通过加入L-半胱氨酸盐和可溶性焦磷酸钠，能特异性促进牙龈卟啉单胞菌的生长；通过加入维生素K和葡萄糖，为牙龈卟啉单胞菌提供必要的生长因子，同时低浓度的葡萄糖可抑制高水平酸及酒精的生成，从而促进克隆形成。本发明提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基配方简单，使用方便，能满足牙龈卟啉单胞菌生长过程中的营养需要，并有效限制其他非目标菌的生长，大大缩短原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养周期，可以在最短时间内为临床研究提供高纯度的原代牙龈卟啉单胞菌。

附图说明

图1是未接种样本至本发明实施例一提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上的结果图；

图2是将样本接种至本发明实施例一提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上的结果图；

图3是将样本接种至添加血红素、维生素K以及无菌脱纤维绵羊血的TSB agar培养基上的结果图；

图4是采用本发明实施例一提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基获得的牙龈卟啉单胞菌单克隆的平板图；

图5是未接种样本至本发明实施例二提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上的结果图；

图6是将样本接种至本发明实施例二提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上的结果图；

图7是采用本发明实施例二提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基获得的牙龈卟啉单胞菌单克隆的平板图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本发明实施例提供一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，按重量组分计，包括混合蛋白胨10-20份、酵母浸出粉5-10份、氯化钠1-5份、琼脂10-15份、葡萄糖0.5-1.0份、碳酸氢钠0.2-0.8份、L-半胱氨酸盐0.1-0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1-0.5份、血红素0.0001-0.0005份、维生素K 0.00001-0.00005份、水 500-1000份和无菌脱纤维绵羊血5-10份。通过加入混合蛋白胨，可以最大限度地刺激细菌的生长；通过加入氯化钠，能够有效维持细菌渗透压平衡；通过加入碳酸氢钠，可使培养基具有去毒化作用；通过加入血红素，有效促进厌氧菌产生黑色素；通过加入L-半胱氨酸盐和可溶性焦磷酸钠，能特异性促进牙龈卟啉单胞菌的生长；通过加入维生素K和葡萄糖，为牙龈卟啉单胞菌提供必要的生长因子，同时低浓度的葡萄糖可抑制高水平酸及酒精的生成，从而促进克隆形成。本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基成分简单，使用方便，能满足牙龈卟啉单胞菌生长过程中的营养需要，并有效限制其他非目标菌的生长，牙龈卟啉单胞菌能够快速形成单一典型的黑色特征菌落，可解决与其他产黑色素厌氧细菌不易区分、分离过程中各种非目标菌和真菌污染严重、分离周期长等难题，大大缩短原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养周期，在最短时间内能够为临床研究提供高纯度的原代牙龈卟啉单胞菌。

本发明实施例还提供一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1：按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L-半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1 L，混匀，获得混合物溶液；

步骤S2：将混合物溶液高压灭菌，然后冷却处理；

步骤S3：按比例加入血红素储存液、维生素储存液和无菌脱纤维绵羊血至冷却后的混合物溶液中，混匀，获得液态培养基；

步骤S4：将液态培养基倒平板，冷却，获得固态培养基。

优选地，在步骤S2中，混合物溶液高压灭菌的温度为120~125℃，时间为10~20分钟；混合物溶液的冷却处理步骤包括：高压灭菌完成后，待温度降至65~75℃时，置于60℃水浴锅中。将混合物溶液高压灭菌后，缓慢降温至65~75℃，使混合物溶液能够充分排气，避免快速降温形成大量气泡。

优选地，步骤S2还包括步骤S201，步骤S201包括如下步骤：按比例将血红素和K₂HPO₄加入到去离子水中，混匀，煮沸灭菌，获得血红素储存液；其中，步骤S201在步骤S3之前进行。煮沸灭菌获得血红素储存液后，室温放置，待用。采用血红素储存液用于原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备，有利于血红素的稳定性。

优选地，在步骤S201中，按重量组分计，血红素为0.5份，K₂HPO₄为1.74份，去离子水为100份。按比例制成血红素储存液后，向混合物溶液中加入血红素储存液的量为1份/1000份水。

优选地，步骤S2还包括步骤S202，步骤S202包括如下步骤： 按比例将维生素K和无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液；其中，步骤S202在步骤S3之前进行。采用维生素K储存液用于原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备，有利于维生素K的稳定性。

优选地，在步骤S202中，按重量组分计，维生素K为0.5份，无水乙醇为100份。按比例制成维生素K储存液后，向混合物溶液中加入维生素K储存液的量为0.1份/1000份水。

优选地，步骤S2还包括步骤S203，步骤S203包括如下步骤：将无菌脱纤维绵羊血放入40~45℃水浴锅中预热。通过在加入无菌脱纤维绵羊血前，进行了充分的预热，避免了无菌脱纤维绵羊血与培养基温差太大造成琼脂结块，从而提高了培养基的品质。

本发明实施例还提供一种上述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用：

将上述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放置于37℃培养箱中，厌氧条件下过夜；

取样，采用分区连续划线法，将样本接种至原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上；

将接种后的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放于37℃培养箱中，厌氧条件下培养7天；

观察平板上的菌落形态，挑取黑色圆形的单克隆至TSB液体培养基中，进行PCR鉴定；

对鉴定为牙龈卟啉单胞菌阳性的菌液，继续采用分区连续划线法，接种至另一个原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上，厌氧条件下培养直至平板上长出单一的牙龈卟啉单胞菌克隆；

其中，厌氧条件为：90% N₂，5% CO₂，5% H₂；TSB液体培养基由重量组分为30份的TSB和5份的酵母提取物加入到1L的无菌水配制而成。

通过采用本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，大大缩短原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养周期，能快速原代分离牙龈卟啉单胞菌。

实施例一：

在本实施例中，原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基按重量组分计，包括混合蛋白胨15份、酵母浸出粉6份、氯化钠2.5份、琼脂15份、葡萄糖1.0份、碳酸氢钠0.4份、L-半胱氨酸盐0.5份、可溶性焦磷酸钠0.25g、血红素0.0005份、维生素K 0.00005份、水1000份和无菌脱纤维绵羊血10份。

其中，原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法如下：

步骤S1：按上述比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L-半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1 L，混匀，获得混合物溶液；

步骤S2：将混合物溶液置于灭菌锅中121℃灭菌15分钟，待灭菌锅显示灭菌结束，温度降至70℃时，取出放于60℃水浴锅中，使其缓慢降温；

步骤S201：按重量组分计，将0.5份血红素和1.74份K₂HPO₄加入到100份去离子水中，混匀，121℃灭菌15分钟，获得血红素储存液，室温放置降温，待用；

步骤S202：按重量组分计，将0.5份维生素K和100份无水乙醇混匀， 0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液，避光保存，待用；

步骤S203：将4℃存放的无菌脱纤维绵羊血取出并放入42℃水浴锅中预热；

步骤S3：将步骤S201得到的血红素储存液按照1份/1000份水的量，步骤S202得到的维生素K储存液按照0.1份/1000份水的量，加入步骤S2得到的降温后的混合物溶液中，同时按比例将步骤S203得到的预热的无菌脱纤维绵羊血加入步骤S2得到的降温后的混合物溶液中，轻摇混匀后，得到液态培养基；

步骤S4：将液态培养基倒平板，制成约10 cm厚的血琼脂平板，常温放置，直至充分冷却，得到固态培养基，即为原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基。

将获得的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放置于37℃培养箱中，厌氧条件下（90% N₂，5% CO₂，5% H₂）过夜；从受试者口腔中取样，放于TSB液体培养基（TSB液体培养基由重量组分为30份的TSB和5份的酵母提取物加入到1L的无菌水配制而成）中，震荡混匀并瞬时离心，接种环沾取适量，采用连续分区划线法分别接种至本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基中和添加血红素、维生素K以及无菌脱纤维绵羊血的TSB agar培养基中，以未接种样本的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基为对照；将上述三种培养基置于37℃厌氧培养箱（90% N₂，5% CO₂，5% H₂）中培养7天；观察平板上的细菌克隆，其中，图1为未接种样本的结果图，图2为将样本接种至本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上的结果图，图3为将样本接种至添加血红素、维生素K以及无菌脱纤维绵羊血的TSB agar培养基上的结果图，从实验结果可以看出，本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基已有黑色特征性克隆长出，而未接种样本的培养基和添加血红素、维生素K以及无菌脱纤维绵羊血的TSB agar培养基未能筛选出黑色特征性克隆。

对将样本接种至本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上长出的黑色克隆，进行菌液PCR鉴定，针对Pg 16S rRNA编码序列进行特异扩增，确定阳性后，继续对菌液进行连续分区划线至本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上，以未接种菌液的本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基为对照；37℃厌氧培养箱（90% N₂，5% CO₂，5% H₂）中培养7天；观察平板上的细菌克隆，图4为采用本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基获得的牙龈卟啉单胞菌单克隆的平板图，可以看到平板上形成单一的墨黑色圆形特征克隆。

由以上实施例可知，本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基能满足牙龈卟啉单胞菌生长过程中的营养需要，大大缩短原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养周期。

实施例二：

本实施例与实施例一的区别在于原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基包含的各成分的量不同。

具体地，在本实施例中，原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基按重量组分计，混合蛋白胨10份、酵母浸出粉5份、氯化钠2.0份、琼脂10份、葡萄糖0.5份、碳酸氢钠0.3份、L-半胱氨酸盐0.4份、可溶性焦磷酸钠0.15g、血红素0.004份、维生素K 0.0004份、水700份和无菌脱纤维绵羊血7份。原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法和原代分离筛选牙龈卟啉单胞菌的方法与实施例一相同，在此不再复述。其中，图5为未接种样本的结果图，未筛选出黑色特征性克隆；图6为将样本接种至本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上的结果图，已有黑色特征性克隆长出；图7采用本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基获得的牙龈卟啉单胞菌单克隆的平板图，可以看到平板上形成单一的墨黑色圆形特征克隆。

由以上实施例可知，本发明实施例提供的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基能满足牙龈卟啉单胞菌生长过程中的营养需要，大大缩短原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养周期。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，其特征在于，按重量组分计，包括：

混合蛋白胨10-20份、酵母浸出粉5-10份、氯化钠1-5份、琼脂10-15份、葡萄糖0.5-1.0份、碳酸氢钠0.2-0.8份、L-半胱氨酸盐0.1-0.5份、可溶性焦磷酸钠0.1-0.5份、血红素0.0001-0.0005份、维生素K 0.00001-0.00005份、水500-1000份和无菌脱纤维绵羊血5-10份。

2.根据权利要求1所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基，其特征在于，包括：

混合蛋白胨15份、酵母浸出粉6份、氯化钠2.5份、琼脂15份、葡萄糖1.0份、碳酸氢钠0.4份、L-半胱氨酸盐0.5份、可溶性焦磷酸钠0.25g、血红素0.0005份、维生素K 0.00005份、水1000份和无菌脱纤维绵羊血10份；或者，

混合蛋白胨10份、酵母浸出粉5份、氯化钠2份、琼脂10份、葡萄糖0.5份、碳酸氢钠0.3份、L-半胱氨酸盐0.4份、可溶性焦磷酸钠0.15g、血红素0.0004份、维生素K 0.00004份、水700份和无菌脱纤维绵羊血7份。

3.一种如权利要求1或2所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

按比例将混合蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、葡萄糖、碳酸氢钠、L-半胱氨酸盐、可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，混匀，获得混合物溶液；

将混合物溶液高压灭菌，然后冷却处理；

按比例加入血红素储存液、维生素储存液和无菌脱纤维绵羊血至冷却后的混合物溶液中，混匀，获得液态培养基；

将液态培养基倒平板，冷却，获得固态培养基。

4.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述混合物溶液高压灭菌的温度为120～125℃，时间为10～20分钟；

所述混合物溶液的冷却处理步骤包括：高压灭菌完成后，待温度降至65～75℃时，置于60℃水浴锅中。

5.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，加入所述血红素储存液之前，还包括血红素储存液的制备步骤，具体步骤如下：

按比例将血红素和K₂HPO₄加入到去离子水中，混匀，煮沸灭菌，获得血红素储存液。

6.根据权利要求5所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，按重量组分计，所述血红素为0.5份，所述K₂HPO₄为1.74份，所述去离子水为100份。

7.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，加入所述维生素K储存液之前，还包括维生素K储存液的制备步骤，具体步骤如下：

按比例将维生素K和无水乙醇混匀，0.45μm滤膜过滤，获得维生素K储存液。

8.根据权利要求7所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，按重量组分计，所述维生素K为0.5份，所述无水乙醇为100份。

9.根据权利要求3所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的制备方法，其特征在于，加入所述无菌脱纤维绵羊血之前，需将所述无菌脱纤维绵羊血放入40～45℃水浴锅中预热。

10.权利要求1或2所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基的应用，其特征在于：

将如权利要求1或2所述的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放置于37℃培养箱中，厌氧条件下过夜；

取样，采用分区连续划线法，将样本接种至所述原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上；

将接种后的原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基放于37℃培养箱中，厌氧条件下培养7天；

观察平板上的菌落形态，挑取黑色圆形的单克隆至TSB液体培养基中，进行PCR鉴定；

对鉴定为牙龈卟啉单胞菌阳性的菌液，继续采用分区连续划线法，接种至另一个原代分离牙龈卟啉单胞菌的培养基上，厌氧条件下培养直至平板上长出单一的牙龈卟啉单胞菌克隆；

其中，厌氧条件为：90％N₂，5％CO₂，5％H₂；TSB液体培养基由重量组分为30份的TSB和5份的酵母提取物加入到1L的无菌水配制而成。

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