KR101296533B1 - 마비성 조류독소를 생산하는 단리된 시아노박테리아 종의 대량 취득 및 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 마비성 조류독소를 생산하는 단리된 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법으로서, 아르기닌, 메티오닌 및 알란토산이 보충된 MLA 배지에 시아노박테리아 필라멘트를 접종하는 단계; 시아노박테리아를 배양하는 단계; 일정 용량의 배양 배지를 수거하고 제거된 용량을 새로운 배양 배지로 벌충하는 단계; 배양을 연속 모드로 유지하는 단계; 시아노박테리아를 함유하는 배지를 원심분리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

마비성 조류독소를 생산하는 단리된 시아노박테리아 종의 대량 취득 및 생산 방법{METHOD TO OBTAIN AND TO PRODUCE MASSIVELY AN ISOLATED SPECIES OF CYANOBACTERIA THAT PRODUCES PARALYZING PHYCOTOXINS}

본 발명은 시아노박테리아(광합성 남조류)의 생산 방법에 관한 것이고, 구체적으로는, 산업적 규모로 마비성 독소 등의 원하는 대사산물을 생산하는 데 유용한, 제어된 조건 하에서 수행되는 대량 인공적 방법의 개발에 관한 것이다. 이 방법은 고효율, 고수율, 간편성 및 높은 수익성을 특징으로 한다.

네오색시톡신(neosaxitoxin) 및 색시톡신(saxitoxin)은 속(genus) 알렉산드륨 종(Alexandrium sp.), 피리디늄 종(Piridinium sp.) 및 짐노디늄 종(Gimnodinium sp.)의 와편모조류(dinoflagellate) 종에 의해 생산되는 마비독의 성분이며, 따라서 이것들은 일반적으로 적조로 알려진 유해 조류 대증식에 의해 오염된 여과 섭식성 이매패류 및 육식성 복족류에 때때로 존재한다(Lagos, N. (1998) Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386). 이들 조류독소(phycotoxin)는 해양 와편모조류뿐만 아니라 담수 시아노박테리아(광합성 남조류)에 의해서도 생산된다.

패류 마비성 조류독소를 생산할 수 있는 문헌에 기재된 시아노박테리아는 단 5종이며, 이들은 각각, 생산된 조류독소의 양 및 유형에 관하여 특징적인 조성(마비성 조류독소의 프로파일)을 갖는다:

- 실린드로스퍼몹시스 라시보르스키( Cylindrospermopsis raciborskii ): 브라질에서 단리됨(Lagos, N., Onodera, H., Zagatto, P.A., Andrinolo, D., Azevedo, S.M.F.Q., and Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Brazil. TOXICON, 37: 1359-1373; Molica, R., Onodera, H., Garcia, C., Rivas, M., Andrinolo, D., Nascimento, S., Meguro, H., Oshima, Y., Azevedo, S., and Lagos, N., 2002, Toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Tabocas reservoir in Caruaru, Pernambuco, Brazil, Phycologia, 41 (6): 606-611).

- 아파니조메논 플로스-아쿠아( Aphanizomenon flos-aquae ): 포르투갈에서 단리됨(Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araujo, F., Lagos, N., and Oshima, Y., 2000, Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon, 38: 1689-1702).

- 아나바에나 써시날리스( Anabaena circinalis ): 오스트레일리아에서 단리됨(Lagos, 1999).

- 링비아 월레이( Lyngbya wollei ): 북아메리카에서 단리됨(Lagos, 1999).

- 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘( Aphanizomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm )(Pereira P LMECYA40). 이 광합성 단세포 남조류는 이러한 종류 중에서 테트라하이드로퓨린만을, 즉 네오색시톡신 및 색시톡신을, 네오색시톡신은 78∼82%의 비율로, 색시톡신은 22∼18%의 비율로 생산하는 유일한 시아노박테리아이다.

본원에 제시된 방법은, 단순한 프로파일의 마비성 조류독소를 생산하는 시아노박테리아의, 제어된 조건 하에서 수행되는 연속 배양법이다. 이 프로파일은 배양되는 종에 따라 달라지며, 네오색시톡신 및 색시톡신 또는 고니아울라톡신(gonyaulatoxin) 2 및 3을 포함한다. 또한, 이 배양법은 종래에 알려진 것보다 조류의 습중량당 이들 약리 활성 화합물의 생산 비율을 더 높일 수 있는 미량영양소 첨가를 포함한다.

네오색시톡신, 색시톡신 및 고니아울라톡신은 상기에 언급된 시아노박테리아에 의해 2차 대사산물로서 생산되며 테트라하이드로퓨린의 기본 구조를 갖는 화합물이다. 이들 화합물은, 모든 2차 대사산물과 마찬가지로, 세포 내부에도 존재하지만 배양 배지로 방출되기도 한다. 이같은 방식으로, 이들 생성물의 두 공급원이 세포 펠릿 분획과 시아노박테리아를 배양하는 배지에서 생성된다.

개방형 또는 자연 조명 반응기에서, 또 빛을 형광등, 또는 백색광 LED를 비롯한 유사한 수단 등의 인공 수단에 의해 제공하는 폐쇄형의 조명 반응기에서의 이러한 시아노박테리아의 대량 연속 배양은 시아노박테리아의 지속적 및 연속적 생산을 가능하게 하며, 이것은 이들 시아노박테리아로부터 정제할 수 있는 주요 화합물인 네오색시톡신의 산업적 수준의 생산에 매우 필요하다. 그러나, 배양된 시아노박테리아 및 배양 조건에 따라, 네오색시톡신뿐만 아니라 색시톡신 및 다른 색시톡신 유사체(예컨대 고니아울라톡신 등)를 나중에 정제할 수 있다. 이들 화합물은 모두 마비성 조류독소군에 속한다.

높은 시아노박테리아 수율의 연속 산업적 생산 방법은 이전에 수행된 바 없었다. 지금까지, 특징적인 특유의 조류독소 프로파일을 갖는 시아노박테리아, 예를 들어, 네오색시톡신과 색시톡신만을 각각 소정의 5:1의 비로 함유하거나, 임의의 다른 마비성 조류독소 없이 고니아울라톡신만을 함유하는 특유의 조성물의 인공적 생산 방법의 개발은 알려진 바 없었다.

다른 유익한 특징은, 본 발명에 기재된 특정한 배양 조건 및 절차를 이용할 경우 얻어지는 조류독소의 매우 높은 생산성이며, 이는 시아노박테리아가 이들 조류독소, 특히 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘의 경우, 네오색시톡신(이것은 주요 성분이며 대량 생산하고자 하는 가장 관심있는 성분임)의 최상의 공급원이 될 수 있게 한다.

이 시아노박테리아 종, 즉 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘은 색시톡신 및 주로 네오색시톡신의 생산자로서, 포르투갈의 저수지인 크레이토 레이크(Crato Lake)로부터 채취되고 단리되어 LMECYA 41로 코드화되었으며, 처음에는 그 모폴로지를 고려해서, 또 후에는 16S rRNA 유전자 서열에 기초하여, 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘으로 동정되었다(Paulo Pereira, et al., 2001. 5th International conference on toxic cyanobacteria, July 15-20, 2001, Queensland, Australia).

처음에, 이 균주는 저수지로부터 취수한 원수 시료에서 채집하였으며, 이것은 제2의 주된 종인 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘 필라멘트를 최초 시료에 존재하는 종의 총 질량의 32∼40%로 많이 포함하였다. 그 후, 실험실에서, 모두 멸균 배양 배지 속에서 역상 현미경을 사용하여 관찰하면서, 클램프(소형 멸균 단리용 링)로 취한 클로닝 소적의 사상체를 개별적으로 통상적인 기법에 의해 반복해서 연속 세척하고 단리하여, 단일 사상체를 얻었으며, 이것을 배지 5 ㎖를 함유한 10 ㎖ 멸균 플라스크로 옮겼다. 이 단일 시아노박테리아의 배양물(단일 조류 배양물)을, 후속 생산을 위한 적절한 발육 상태에 도달할 때까지 25℃에서 2∼4주 동안 배양하였다. 이 최초의 단리물로부터, 필라멘트의 수를 항상 가이드로서 이용하고 항상 대수 증식기 상태로, 필요에 따라 연속 번식을 행함으로써, 단일 조류 시아노박테리아의 대량 증식 및 생산을 시작하였다. 이러한 단일 조류 배양물의 증식 및 발육 단계 동안, 균주를 16시간:8시간의 명암 주기 하에 유지하였다. 세지윅 래프터(Sedgewick Rafter) 및 팔머-말로니(Palmer-Maloney) 카운팅 셀에서 루골 염색을 이용하여 필라멘트를 카운팅함으로써, 배양물의 발육을 제어하였다.

순수한 배양물을 얻기 위한 시아노박테리아의 이러한 단리 방법은 상기에 언급된 마비성 조류독소를 생산할 수 있는 임의의 시아노박테리아에 적용될 수 있다.

순수한 배양물이 얻어지면, 이것은 본 발명에 따른 시아노박테리아의 대량 생산을 위한 접종물로서 사용된다.

제어된 조건 하에 마비성 조류독소를 생산할 수 있는 시아노박테리아의 대량 생산이 가능한 본 발명의 이점은 다음과 같다:

ㆍ 마비성 조류독소를 생산할 수 있는 시아노박테리아를 제어된 조건 하에 연속적 및 지속적으로 생산할 수 있다는 점;

ㆍ 배양 배지가 매우 기본적이라서, 고가의 영양소를 포함하지 않고 빛 조절만을 필요로 하기 때문에(이는 시아노박테리아의 취급이 비교적 용이하다는 것을 의미함) 생산비가 낮다는 점;

ㆍ 환경적 조건 및 변화에 영향을 받지 않고 마비성 조류독소(색시톡신, 네오색시톡신 및 고니아울라톡신)의 연속 공급원을 제공한다는 점;

ㆍ 종래에 달성된 적 없었고 지금까지 어떠한 산업적 공정에서도 알려진 바 없었던 매우 바람직한 비용 생산 효율 관계.

[발명의 목적]

본 발명의 일반적인 목적은, 제어된 조건 하에 저비용으로, 색시톡신, 네오색시톡신 및/또는 고니아울라톡신 등의 마비성 조류독소를 주로 생산하는 시아노박테리아의 산업적 대량 연속 생산법을 제공하는 것이다.

본 발명의 구체적인 목적은, 저비용으로 상업적 경쟁력이 있는 시아노박테리아 단일배양물의 최적화된 생산 방법을 개발하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적인 목적은, 상업적으로 이용되지 못하였으나 여러 질병에 대한 임상적 치료에 유용성을 갖는 고부가가치 화합물의 공급원으로서 시아노박테리아 균주를 지속적으로 사용하는 산업적 연속 배양법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적인 목적은, 주로 네오색시톡신을 생산하고 적은 비율의 색시톡신(1/5 색시톡신)을 생산하거나, 주로 고니아울라톡신(2/3)을 주요 성분 및 주성분으로서 생산하도록 유도된 시아노박테리아 균주의 연속 배양법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체적인 목적은, 시아노박테리아 세포당 네오색시톡신 및/또는 고니아울라톡신의 생산성을 높이는 것이다.

도 1: 연속 명 조건에서 본 발명의 배양 배지(메티오닌, 아르기닌 및 알란토산에 의해 조정된 MLA 배지)를 이용하는 배양 및 명암 주기를 이용한 비조정 배지(단순 MLA 배지)를 이용한 배양 제1일째의 필라멘트의 생산.

[발명의 간단한 설명]

본 발명에서는, 연속 배양법으로 시아노박테리아를 대량으로 취득하고 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 연속 배양될 수 있는 시아노박테리아의 예로는 이하의 것이 있다:

ㆍ 실린드로스퍼몹시스 라시보르스키, 아파니조메논 플로스-아쿠아;

ㆍ 아파니조메논(Aph) 이사트쉔코이 (우사세브) 프로스키나-라브렌코;

ㆍ 아나바에나 써시날리스, 링비아 월레이 및 아파니조메논 그라실 (렘) 렘.

마비성 조류독소를 생산하는 시아노박테리아에 관한 이해는, 공중 보건 문제와 관련되어 있으며, 이때 조류독소 생산 와편모조류의 대증식과 관련된, 이들 조류독소에 의한 패류 오염은, 공중 보건 및 적조가 발생한 지역, 즉 조류독소 생산 와편모조류 대증식이 출현한 지역에서의 패류 통조림 산업에 심각한 영향을 미친다(Lagos 1998).

이러한 시아노박테리아 종은, 맨처음 알려졌을 때, 해부학적 구조 및 고전적인 분류학적 특성에 의해서만 특징지워졌다. 이들 종은 초기에는 이들이 생산하는 화합물에 따라 연구 또는 특성화되지 않았고, 생산된 조류독소의 연구가 수행되었을 때, 그 목적은 독성 수준 및 공중 보건 문제를 이해하고 해결하는 것이었다. 그러나, 본 출원 이전까지, 마비성 조류독소의 연속적, 지속적 공급원으로서의 시아노박테리아 또는 시아노박테리아 배양물로부터 유도된 마비성 조류독소(모든 색시톡신 유사체)의 대량 생산은 제안된 바 없었다.

본 출원에서는, 연속 배양법으로 시아노박테리아를 대량 취득하고 생산하는 방법을 제공하며, (Aph) 그라실 (렘) 렘의 배양을 예로 든다. 그러나, 연속 배양법은 앞서 언급한 시아노박테리아 속, 즉 실린드로스퍼몹시스 라시보르스키, 아파니조메논 플로스-아쿠아, 아파니조메논(Aph) 이사트쉔코이 (우사세브) 프로스키나-라브렌코, 아나바에나 써시날리스, 링비아 월레이 및 아파니조메논 그라실 (렘) 렘에 적용될 수 있다.

이러한 단리된 시아노박테리아를 이용할 수 있게 됨으로 인해 지속적인 연구의 진전과 본 발명의 대량 생산 공정의 개발이 가능하게 되었다.

시아노박테리아를 배양하고 발육시키기 위해서는, 일련의 개방형 또는 폐쇄형 반응기가 필요하고, 모든 반응기를 커버하는 직접 조명이 필요하다.

이 배양에는 담수, 무기염 및 소량의 미량영양소만 필요하며, 이들 모두 저비용으로 쉽게 제조할 수 있다.

또 다른 바람직한 요건은 암 주기가 없는 연속 명 주기로서, 이것은 또한 대량 배양법의 혁신을 불러오는데, 왜냐하면 시아노박테리아는 빛을 필요로 하는 광합성 유기체이고 항상 대수 증식기에서 최고의 발육에 이르기 때문이다. 이와 관련하여, 이러한 연속 배양을 진행하는 동안 다양한 시간 단위 계획을 이용한 명암 주기도 자연광 주기도 이용될 수 있음도 강조한다. 본 출원에 기재된 방법의 또 다른 혁신은, 배양물을 대수 증식기로 지속적으로 유지하는 것과, 각 반응기 내의 배양물의 정량적 발육에 따라, 선택적인 정량적 수거를 행함으로써 이루어지는, 조류독소의 지속적 생산 상태이다.

시아노박테리아의 배양은 배양물을 최적 상태로 유지하기 위해 멸균 배지를 필요로 하지만, 이 배양물은 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포의 배양에서와 같이 극단의 멸균 조건을 요구하지는 않는다.

이러한 시아노박테리아는 오염에 대한 내성이 매우 크고, 그 발육 요건이 최소이며 그에 따라 본 발명에 사용되는 배양 배지는 다른 미생물의 발육에 대해서는 매우 "불충분"하기 때문에, 이 배지는 이들 광합성 유기체만이 생육할 수 있는 천연 선택 배지이다.

이러한 시아노박테리아의 생육을 위한 최적의 온도 범위는 중앙 칠레(아리카에서 테무코)와 같은 지중해 기후에서의 환경적 온도 변화의 통상적인 변화 범위 내에 포함된다.

시아노박테리아가 증식하면, 예를 들어 시아노박테리아에 의해 생산된 대사산물의 정제에 사용하기에 적절한 용량을 수거하고, 세포 배양물로부터 제거된 용량을 등용량의 멸균 배지를 첨가하여 벌충한다. 경시적 필라멘트 카운팅에 따라, 정해진 미생물 발육량에 도달하면, 또 다른 적정 용량의 시아노박테리아를 수거하고, 수거된 세포 용량을 동일한 재충전 용량으로 대체함으로써 배양 배지의 최종 용량을 동일하게 유지할 수 있다.

이렇게 하면, 시아노박테리아의 배양 시스템이 시아노박테리아 생산을 위한 연속 공급원으로서 얻어진다.

[발명의 상세한 설명]

마비성 조류독소를 산업 수준으로 생산할 수 있는 시아노박테리아 배양을 시작하기 위해서는, 실린드로스퍼몹시스 종, 아파니조메논 종, 아나바에나 종 및 링비아 종 등으로부터 선택될 수 있는 단리되고 특성 규명된 시아노박테리아가 필요하다.

특별히 선택된 종을 고려한 시아노박테리아의 배양을 연속 조명을 이용하는 적절한 폭기식 교반형 반응기에서 수행한다. 빛은 인공빛, 예를 들어 형광등에서 발산되는 빛일 수 있다.

시아노박테리아의 번식에 사용되는 배양 배지는 증류수, 무기염 및 미량영양소를 모두 멸균 상태로 포함한다.

배양 배지는, 시아노박테리아 배양을 위한 MLA ×40 배지(MLA 배지, CSIRO Marine Research, CSIRO Microalgae Research Center, Hobart, Australia)(microalgae@marine.csiro.au)를 베이스로 하여 제조되며, 이것은 특히 하기 성분: MgSO₄×7H₂O, NaNO₃, K₂HPO₄, H₃BO₃, H₂SeO₄, 바이오틴, 비타민 B12 및 티아민-HCl, EDTA-Na, 염화제2철 6수화물, 카밤산나트륨 및 염화망간 수화물, NaHCO₃, CaCl₂×2H₂O, CuSO₄×5H₂O, ZnSO₄×7H₂O, CoCl₂×6H₂O, NaMoO₄×2H₂O를 포함한다. 또한, 본 발명의 배양 배지는 아르기닌, 메티오닌 및 알란토산을 포함한다.

하기 표에, 상기에 언급된 성분들에 대해 본 발명의 방법에 유용한 농도 범위를 기재하였다.

추가로, 상기 배양 배지는 최종 조성물 중에 2∼3.5 mM의 아르기닌, 1∼2.2 mM의 메티오닌 및 0.7∼1.3 mM의 알란토산을 포함한다.

배양 배지는, 저장 용액을 별도로 제조하여 여과 또는 오토클레이빙에 의해 멸균 처리함으로써 제조한다.

CSIRO로부터 입수한 시아노박테리아 배양용 MLA 배양 배지는 공지된 것이나, 본 발명에 기재된 완전 배양 배지는 상기 배지 또는 시아노박테리아 배양과 관련된 임의의 다른 문헌에는 존재하지 않는 무기염, 미량영양소 및 비타민을 포함한다.

배지가 제조되면, 시아노박테리아를 본 발명의 배양 배지 3 ℓ당 20∼40×10⁶개의 필라멘트로 접종한다.

배양 조건은 15∼35℃, 바람직하게는 20∼35℃(최적은 22±2℃)의 제어된 온도에서 형광등에서 발산되는 연속 조명을 이용하는 것을 포함한다.

특히, 배양에 사용되는 균주의 분열 주기에 따라, 반응기 총 용량의 20∼40%의 용량을 제거하여 시아노박테리아를 가공하고 이 용량을 등용량의 새로운 배양 배지로 교환할 수 있다. 예를 들어, 분열 주기가 1일당 0.33일 경우, 1∼2일마다 배양 용량의 1/3을 제거하고 이를 등용량의 새로운 배양 배지로 교환할 수 있다.

시아노박테리아를 수거하기 위한 시기를 결정하기 위해, 필라멘트 카운팅을 통해 생육을 모니터링하고 매회 시아노박테리아 수거시마다 등용량의 배양 배지로 벌충하도록 주의를 기울인다.

균주 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘 LMECYA40의 배양에 관해 기재한 선행 문헌이 있지만, 이 문헌에 기재된 배양 배지는 본 발명에 기재된 조정 MLA 배지와는 전혀 다른 것이다. MLA 배지의 사용이 시아노박테리아의 배양을 위한 베이스로서 기재된 것은 이번이 최초이다. 본 발명의 시아노박테리아 배양에 적용하기 위해, 아르기닌, 메티오닌 및 알란토산 성분을 첨가하여 MLA 배지를 조정하였으며, 놀랍게도 모든 화합물들이 조류독소 색시톡신, 네오색시톡신 및 고니아울라톡신 생산의 매우 강력한 자극제인 것으로 입증되었다.

본 발명의 방법은, 제1 단계에서, 필라멘트의 수를 20∼40×10⁶개로 하여 접종물을 만들고, 명암 주기 16시간:8시간, 22±2℃로 제어된 온도의 배양 챔버에서 250 ㎖의 소형 플라스크를 사용하여 배양하는 것을 포함한다.

얻어진 접종물을 멸균 및 격리 상태로 유지된 반응기로 옮긴다.

본 발명의 방법의 배양 온도는 20∼25℃로 조절된다. 예를 들어, 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘을 생산하고자 한다면, 이 균주를 15∼30℃, 최적으로는 22±2℃에서 충분히 배양하는 것을 고려해야 한다.

기존에 알려진 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘 세포의 분열 주기는 1일당 0.33이다. 이것은 배양 3일 후 세포량이 두배에 달한다는 것을 의미한다. 따라서, 최대로 1∼2일마다 각각의 3 ℓ 반응기로부터 1 ℓ의 배양물을 수거할 수 있다.

세포 배양물로부터 제거된 용량은 멸균 배지 1 ℓ를 첨가하여 벌충한다. 필라멘트 카운팅에 따라 다음 날 또는 다른 날, 시아노박테리아 배양물 1 ℓ를 더 수거할 수 있으며, 이때 항상 배양 배지의 총 용량을 3 ℓ로 유지한다.

이렇게 하면, 시아노박테리아 배양 시스템이 시아노박테리아의 지속적 생산을 위한 연속 공급원으로서 얻어진다. 시아노박테리아를 함유한 배양 배지의 수거를 편의상 2일마다 수행함으로써 다수의 필라멘트를 얻을 수 있다. 최대 생산 조건 하에서는 수거 간격을 4일 넘게 하는 것은 유익하지 않은데, 왜냐하면 배양물 중의 필라멘트 농도가 증가함에 따라 배양 조건이 악화하어 조류독소 생산이 감소하기 때문이다.

세포 펠릿은 필라멘트 형성 시아노박테리아에 해당한다. 이들 필라멘트는 필라멘트로 연결된 20∼100개의 세포 및 더 많은 세포를 갖는다. 이러한 이유로, 이들을 필라멘트형(사상형) 시아노박테리아라 부른다. 시아노박테리아가 "건강하고", 생육이 좋을 경우, 이들은 그 안에서 세포 분열을 겪기 때문에 필라멘트를 형성한다. 이러한 필라멘트형의 특성은 성장 제어(growth control)로서 이용되는데, 왜냐하면 이것이 실제적인 시아노박테리아 발육 제어이기 때문이다. 필라멘트를 형성할 수 있는 능력에 의해 배지 오염을 더 잘 제어할 수 있는데, 그 이유는 배지가 오염되고 감염이 발생할 경우 시아노박테리아가 필라멘트를 형성하지 못하기 때문이다.

개개의 세포는 너무 작아 카운팅이 어렵고 건강한 배양물에는 존재하지 않기 때문에, 세포 펠릿은 역상 현미경으로 정량화되는 필라멘트를 포함한다.

또한, 펠릿을 얻기 위해 이용되는 원심분리 단계의 상청액으로서 세포 무함유 배지가 수집된다. 이 원심분리는 편의상 10,000 g로 20분 동안 수행한다. 조류독소는 또한 이 상청액 중의 가용성 종으로서 존재한다.

상기 상청액은 제2의 조류독소 공급원이다. 건강한 필라멘트를 보유하고 오염이 없으며 지속적인 대수 증식기에 있는 양호한 배양 조건에서는, 이것이 펠릿 분획에서 얻어지는 총 함량의 5% 미만이 되는 경향이 있다.

본 발명에 기재된 생산성은 문헌[Paulo Pereira et al., 2001, (5th International Conference on Toxic Cyanobacteria, July 15-20 2001, Queensland, Australia)]에 기재된 생산성보다 60∼125배 더 높다.

이 균주를 다른 영양소 및 미량영양소를 사용하고 명암 주기를 16시간:8시간으로 유지하여 다른 온도에서 통상적인 조건(본 발명에서 개발하여 사용하는 반응기를 이용하지 않음) 하에 배양하였다. 분명한 점은, 본 발명에서는, 새로운 연속 배양법뿐만 아니라 신규한 인프라스트럭쳐를 이용하는 절차를 포함하는 대량 산업 생산을 개시하며, 이것은 전체적으로 지금까지 기재된 바도 증명된 바도 없는 높은 수율로 인해 놀라운 효과를 갖는 혁신적인 방안을 제시한다는 것이다.

전술한 설명은 다수의 실시형태를 포함하지만, 이들 실시형태는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니라, 단지, 실제적으로 바람직한 본 발명의 양태 중 일부를 예시한 것으로 간주되어야 한다.

개발된 파일럿 산업 공정은 마비성 조류독소(네오색시톡신, 색시톡신 또는 고니아울라톡신)를 생산할 수 있는 시아노박테리아를 매일 200 ℓ 수거할 수 있는 200개의 반응기를 포함하는 연속 배양법이다.

실시예 1: 배양 배지의 제조

배양 배지를 제조하기 위해, 미량영양소, 무기염 및 비타민의 더 농축된 저장 용액을 제조한다. 모든 용액은 증류수를 사용하여 제조한다. 하기 표의 기재에 따라 비타민 저장 용액(용액 A)을 제조한다:

즉, 바이오틴 1 mg을 증류수 10 ㎖에 용해시켰다. 마찬가지로, 비타민 B12 1 mg을 증류수 10 ㎖에 용해시켰다. 이들 두 용액 각각으로부터 0.05 ㎖를 취하여 티아민 HCl 10 mg과 혼합하고 증류수로 최종 용량을 100 ㎖로 맞추었다.

CuSO₄ㆍ5H₂O(1 g/ℓ), ZnSO₄ㆍ7H₂O(2.2 g/ℓ), CoCl₂ㆍ6H₂O(1 g/ℓ), NaMoO₄ㆍ2H₂O(0.6 g/ℓ)의 1차 용액으로부터 미량영양소 저장 용액(용액 B)을 제조하였다. 하기 표에 기재된 것과 같은 용액 800 ㎖에 각각의 1차 용액 10 ㎖를 첨가하였다.

마지막으로, 증류수로 용량을 1 ℓ로 맞추어 미량영양소 저장 용액(용액 B) 1 ℓ를 얻었다.

농축된 40× MLA 배지 저장 용액 250 ㎖를 제조하기 위해, 하기 표의 각각의 성분에 대해 기재된 용량을 증류수 130 ㎖에 첨가하였다.

마지막으로, 하기 용량을 배합하고 0.22 ㎛ 막을 통한 여과로 멸균하여 MLA 배양 배지 1 ℓ를 제조하였다.

121℃에서 15분 동안의 오토클레이브 멸균을 이용한 경우, 이하에 기재된 양을 사용하였으며, pH는 HCl 또는 다른 적절한 산을 사용하여 7.5∼8.0으로 조정하였다.

최종 성분들의 농도는 하기 표에 기재된 것이다.

NaHCO₂ 및 CaCl₂ㆍ2H₂O는, 그 농도가 배지에 이용되는 멸균 유형(여과 또는 오토클레이빙)에 따라 달라지기 때문에, 필요에 따라 첨가해야 한다.

모든 용액은 1개월 이하 동안 냉장 보존할 수 있다.

마지막으로, 아르기닌, 메티오닌 및 알란토산을 2.8 mM 아르기닌, 1.7 mM 메티오닌 및 1 mM 알란토산의 최종 농도로 첨가하여, 본 발명의 배양 배지를 제조하였다.

첨가된 성분들의 최종 혼합물은 본 발명의 결과를 얻기 위해 결정적인 것이며, 상기 성분들은 상기에 기재된 MLA 배지(CSIRO Marine Research)의 일부가 아니다.

실시예 2: 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘의 배양

실시예 1에 기재된 배양 배지 3 ℓ를 함유하는 각 반응기에 35×10⁶개의 아파니조메논(Aph) 그라실 (렘) 렘 필라멘트를 접종하였다. 연속 형광등 조명 하에 반응기를 22℃±2℃의 제어된 온도로 유지하였다. 배양물이 대수기에 도달하면, 총 반응기 용량의 1/3을 수거하여(1 ℓ), 새로운 배지 1 ℓ와 교환하였다. 이전의 배양물의 배가 시간은 1일당 0.33회였다.

그 후, 시아노박테리아 함유 배양 배지를 10,000 g로 20분 동안 원심분리하였다.

본 발명에서 얻은 수율은 항상 필라멘트 수와 관련하여 표현되는데, 그 이유는 필라멘트의 존재(다수의 개별 세포의 회합)가 배양물의 품질 및 세포의 지속적 생식 및 발육의 지표이기 때문이다. 필라멘트가 풍부한 배양물은 "건강한" 배양물이며 지속적 발육 상태에 있다. 세포 펠릿은 필라멘트의 펠릿이며, 그로부터 조류독소의 정제가 시작된다.

각 뱃치의 세포 펠릿은 반응기로부터 매일 수거한 배양물 1 ℓ로부터 얻은 용량이다. 더 많은 수의 필라멘트를 얻기 위해서는 격일로 수거를 수행할 수 있다. 이러한 최대 생산 조건 하에서는, 배양 조건 악화 및 조류독소 생산 감소를 피하기 위해 4일 이하의 간격으로 수거하는 것이 바람직하다.

실시예 3: 단순(비조정) MLA 배지와 본 발명의 조정 MLA 배지의 비교

도 1은 단순(비조정) MLA 배지에서의 아파니조메논 그라실의 배양과 본 발명의 조정 MLA 배양 배지에서의 아파니조메논 그라실의 배양 간의 차이를 보여준다. 2.8 mM 아르기닌, 1.7 mM 메티오닌 및 1 mM 알란토산의 최종 농도를 포함하는 본 발명의 조정 배지가 단순(비조정) MLA 배지를 사용한 배양보다 놀라울 정도로 더 우수하다는 것을 용이하게 파악할 수 있다.

하기 표 2는, 상청액 중의 상이한 조류독소 및 이들의 시아노박테리아 필라멘트 생산성을 보여준다. 또한, 이 표는 본 발명의 방법에 따른 배양 배지 1 ㎖당 필라멘트의 농도를 기재한다.

표 3은 상이한 조류독소 생산 뱃치를 보여준다. 필라멘트당 조류독소의 평균 수율은, 선행 기술에 해당하는 단순(비조정) MLA 배지에서의 배양에 비해, 본 발명의 배양 조건과 함께 조정 MLA 배지를 이용하는 경우에 훨씬 더 크다는 것이 분명히 확인된다.

이들 실험에서 얻은 수율은, 연속 폭기없이 명(낮):암(밤) 주기를 이용하여 소형 플라스크에서 선행 기술에 기재된 통상의 조건(단순 MLA 배지)으로 배양한 시아노박테리아 필라멘트의 생산에 비해, 조정 MLA 배지에서 배양한 시아노박테리아 필라멘트당 순수한 조류독소(네오색시톡신 및 색시톡신)의 생산량(표 2)이 놀라울 정도로 현저히 많았다(표 3).

본원에 기재된 실시예에서, 시아노박테리아는 항상 대수 증식기에 있고, 1일 24시간의 연속 조명과, 시아노박테리아의 연속 수거를 이용하고, 매회 수거시에 수거된 용량과 동일한 용량으로 새로운 영양소를 첨가함으로써 지속적 증식을 유도하였다.

표 3에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 방법은 공지의 방법보다 약 25배 더 높은 우수한 수율을 달성한다.

Claims (9)

1. 마비성 조류독소(phycotoxin)를 생산하는 단리된 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법으로서,
   a) 아르기닌, 메티오닌 및 알란토산이 보충된 MLA 배양 배지 3 ℓ당 20∼40×10⁶개의 시아노박테리아 필라멘트를 접종하는 단계로서, 상기 MLA 배양 배지는 MgSO₄ㆍ7H₂O, NaNO₃, K₂HPO₄, H₃BO₃, H₂SeO₄, 바이오틴, 비타민 B12, 티아민 HCl, CuSO₄ㆍ5H₂O, ZnSO₄ㆍ7H₂O, CoCl₂ㆍ6H₂O, NaMoO₄ㆍ2H₂O, Na₂EDTA, FeCl₃ㆍ6H₂O, NaHCO₃, MnCl₂ㆍH₂O를 포함하는 것인 단계;
   b) 자연 조명 또는 인공 조명 하에 15∼35℃의 온도로 배양 배지에서 시아노박테리아를 배양하는 단계;
   c) 1∼3일마다 총 용량의 20∼40%의 용량의 배양 배지를 수거하고, 제거된 용량을 새로운 배양 배지로 벌충하는 단계;
   d) 배양을 연속 모드로 유지하는 단계; 및
   e) c)에서 수거된 시아노박테리아 함유 배지를 상대 원심력 5,000∼15,000×g로 5∼30분 동안 원심분리하는 단계
   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 시아노박테리아 종이 실린드로스퍼몹시스 라시보르스키(Cylindrospermopsis raciborskii), 아파니조메논 플로스-아쿠아(Aphanizomenon flos-aquae), 아파니조메논(Aph) 이사트쉔코이 (우사세브) 프로스키나-라브렌코(Aphanizomenon(Aph) issatschenkoi (Usacev) Proskina-Lavrenco), 아나바에나 써시날리스(Anabaena circinalis), 링비아 월레이(Lyngbya wollei) 및 아파니조메논 그라실 (렘) 렘(Aphanizomenon gracile (Lemm) Lemm)로 구성된 군에서 선택되는 것인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 배양 온도가 15∼25℃인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 조명이 인공 조명이고, 명 주기가 연속적인 것인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.
5. 삭제
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 2∼3.5 mM의 아르기닌, 1∼2.2 mM의 메티오닌 및 0.7∼1.3 mM의 알란토산을 포함하는 것인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 배양 배지의 최종 아르기닌 농도가 2.8 mM인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 배양 배지의 최종 메티오닌 농도가 1.7 mM인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 배양 배지의 최종 알란토산 농도가 1.0 mM인 시아노박테리아 종을 대량으로 취득 및 생산하는 방법.

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