WO2010109387A1 - Método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes - Google Patents

Método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes Download PDF

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cyanobacteria
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Marcelo Santiago LAGOS GONZÁLEZ
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • This invention relates to a method of producing cyanobacteria (green-blue photosynthetic algae), specifically to the development of an artificial process, massive, under controlled conditions, useful for generating metabolites of interest, such as paralyzing toxins, at the level industrial.
  • the method is characterized by its efficiency, high performance, simplicity and high profitability.
  • Neosaxitoxin and Saxitoxin are components of the so-called paralytic poison, these toxins are produced by dinoflagellates of the genera Alexandrium sp., Pyridinium sp., And Gimnodinium sp. and therefore, they are also sometimes found in filtering bivalve shellfish and carnivorous gastropods contaminated by harmful algal blooms, commonly known as red tides, (Lagos, N. (1998)) Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386). These ficotoxins, in addition to being produced by dinoflagellates in the sea, are also produced by cyanobacteria in fresh water (green-blue algae photo-synthetic).
  • the method proposed in the present application is the continuous culture and under controlled conditions of a cyanobacterium that produces a simple profile of paralyzing phycotoxins. This profile depends on the cultivated species, and includes neosaxitoxin and saxitoxin or Gonyaulatoxins 2 and 3. In addition, this cultivation method includes micro nutrient attachments, allowing the highest production of these pharmacologically active compounds per wet weight of microalgae so far. described.
  • Neosaxitoxin, saxitoxin and gonyaulatoxins are compounds that have a basic structure that corresponds to tetrahydropurines and are produced by the cyano-bacteria mentioned as secondary metabolites. These compounds, like all secondary metabolites, are found within the cells but are also released into the culture medium. Thus, two sources of these products are generated: in the fraction of the cell pellet and in the medium where the cyanobacteria are grown.
  • Another advantageous feature is the very high production of ficotoxins under the selected culture conditions and procedures, and which are described herein. invention, which makes it possible to define cyanobacteria as the best source of these ⁇ -cotoxins, especially neosaxitoxin in the case of Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, the major component and the one of greatest interest for mass production.
  • cyanobacteria as the best source of these ⁇ -cotoxins, especially neosaxitoxin in the case of Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, the major component and the one of greatest interest for mass production.
  • This species of cyanobacteria Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm is a producer of saxitoxin and mostly neosaxitoxin, and was collected in Lake Crato, a water reservoir in Portugal, isolated and coded as LMECYA 41 and was identified as Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, first based on its morphology and then according to its 16S rRNA gene sequence (Paulo Pereira, et al., 2001. 5th International conference on toxic cyanobacteria, July 15-20, 2001, Queensland, Australia).
  • This method of isolating a cyanobacterium and obtaining a pure culture can be applied to any of the other cyanobacteria producing paralytic ficotoxins mentioned above.
  • the general objective of the present invention is the massive, continuous and industrial production, under controlled and low-cost conditions of a cyanobacterium mainly producing paralytic phycotoxins such as saxitoxin, neosaxitoxin and / or gonyaulatoxins.
  • a specific objective of the invention is the development of an optimized production process, in a kind of monoculture cyanobacteria at a low and commercially competitive cost.
  • Another specific objective of the invention is the achievement of an industrial and continuous process, in perpetual form of this strain, as a source of compounds of high added value, not commercially available and with applications in clinical therapy of various pathologies.
  • Another specific objective of the invention is the achievement of a continuous culture of this cyanobacterial strain, aimed at favoring the production of fundamentally neosaxitoxin, with a small amount of saxitoxin (one fifth of neosaxitoxin) or fundamental production of gonyaulatoxins 2/3 as a majority and primary component
  • Another specific objective of the invention is to achieve high production of neosaxitoxin and / or gonyaulatoxins per cyanobacteria cell.
  • the present application presents a method of obtaining and producing massive cyanobacteria through continuous culture.
  • the cyanobacteria susceptible to continuous culture are among others:
  • Another preferred requirement is a permanent light cycle without darkness, this is also an innovation of this massive culture procedure, since cyanobacteria are photosynthetic organisms and require light, and are kept at their maximum development always in the exponential phase of increase. In relation to this, it is important to note that light and dark cycles of different time ranges can also be used, during the development of this continuous culture, even using the cycles given by natural light.
  • Another innovation of the process described in this application is the permanent maintenance of the growing crop in exponential phase and in permanent production of ficotoxins, the latter, making selective and quantified crops, depending on the quantitative development of the crop in each reactor.
  • the optimum temperature range, for the growth of these cyanobacteria is within the normal range of environmental temperature variations of a Chaparral-Mediterranean climate such as that of the Central area of Chile (between Arica to Temuco).
  • a suitable volume is removed for use, for example, in the purification of a metabolite produced by the cyanobacterium, and the volume removed from the cell culture is replenished, adding an equivalent volume of sterilized medium .
  • the filament count over time once a certain development has been reached, another suitable volume of cyanobacteria can be collected again, always maintaining the same final volume of the culture medium, renewing with an equivalent volume of replacement every time collect a certain volume of cells.
  • a system of cyanobacteria in culture is thus obtained, as a continuous source of cyanobacterial production.
  • the cultivation of cyanobacteria is carried out in appropriate aerated reactors, with permanent agitation and light.
  • the light can be artificial, for example, emitted by fluorescent tubes.
  • the culture medium considered for the reproduction of cyanobacteria consists of distilled water, mineral salts and micronutrients, all of them sterilized.
  • the culture medium is prepared based on the MLA X 40 medium (MLA medium,
  • CSIRO marine research CSIRO microalgae research center, Hobart, Australia, for cyanobacterial culture (microalgae @) marine.csiro.au), which contains, among others, the following components MgSO 4 7H2O, NaNO 3 , K 2 HPO 4 , H 3 BO 3 , H 2 SeO 4 , Biotin, vitamin B 12 and thiamine-HCl, EDTA-Na, ferric chloride hexahydrate, carbamate sodium and hydrated manganese chloride, NaHCO 3 , CaCl 2 2H 2 O, CuSO 4 5H 2 O, ZnSO 4 7H 2 O, CoCl 2 6H 2 O, NaMoO 4 2H 2 O.
  • the culture medium of the present invention incorporates arginine, methionine and allantoic acid.
  • FIGURE 1 Filament production on a culture day considering the culture medium of the present invention (MLA medium modified with methionine, arginine and allantoic acid) under continuous light conditions and unmodified culture medium (Simple MLA medium ) with light cycle: darkness. Best way to realize the invention
  • the culture medium comprises between 2 and 3.5 mM final of arginine, between 1 and 2.2 mM of methionine and between 0.7 and 1.3 mM of allantoic acid.
  • the preparation of the culture medium is carried out using 'stock' solutions that are prepared separately and sterilized, either by filtration or by autoclave.
  • the CSIRO MLA culture medium for cyanobacterial growth is known, however, the complete culture medium described in the present invention considers mineral salts, micronutrients and vitamins that are not found in said medium or in any other publication. regarding the culture of cyanobacteria.
  • the cyanobacteria are inoculated in a range of 20 to 40 million filaments per 3 liters of the culture medium of the invention.
  • the culture conditions consider constant illumination, provided by fluorescent tubes at a controlled temperature of between 15 to 35 0 C, preferably in a range of between 20 to 25 0 C with an optimum of 22 ⁇ 2 0 C.
  • the method of the invention comprises generating an inoculum in a range of 20 to 40 million filaments, this inoculum is developed in small 250 milliliter flasks in a light-dark culture chamber (16: 8 hours) and temperature controlled at 22 ⁇ 2 0 C.
  • Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm it should be considered that this strain is grown well in the range of 15 - 30 0 C, its optimal conditions being between 22 + 2 0 C .
  • Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm cells have an already known division cycle of 0.33 per day. This means that in three days the culture doubles its cell mass. This allows, to collect a liter of culture of each reactor of 3 liters, every 1 to 2 days maximum.
  • the volume removed from the cell culture is replenished by adding a liter of sterilized medium. The next day or both, according to filament count, another liter of cyanobacteria can be collected again, always maintaining a volume of 3 liters of the culture medium.
  • a system of cyanobacteria in culture is obtained as a continuous source of cyanobacterial production in perpetual form.
  • the collection of culture medium with cyanobacteria can be conveniently carried out every two days, thus achieving a greater number of filaments.
  • Under the conditions of maximum production it is not convenient to space the crop for periods of more than 4 days, since when increasing the concentration of filaments in the crop it deteriorates and there is a decrease in production of ficotoxin.
  • the cell pellet corresponds to cyanobacteria forming filaments. These filaments have from 20 to 100 cells and even more cells attached in a filament. That is why they are called filamentous cyanobacteria. When they are 'healthy' and growing very well they form the filaments, because that is where they divide themselves cellularly. This filamentous characteristic is used as a growth control, since it is a positive control of cyanobacterial development. The ability to form filaments allows better control of the contamination of the environment, since when the medium is contaminated and an infection occurs, cyanobacteria do not form filaments.
  • the cell pellet is made up of filaments and it is these that are quantified in the inverted phase microscope, since the individual cells are very small, difficult to count and do not exist in a healthy culture.
  • the cell-free medium, the centrifugal supernatant is collected to obtain the pellet, the centrifugation is conveniently performed at 10,000 x g x 20 minutes. In this supernatant in soluble form, the ⁇ -cotoxins are also found.
  • This supernatant corresponds to the second source of phycotoxins, in good culture conditions, with healthy filaments and without contamination and in the phase of permanent exponential growth, tends to be less than 5% of the total content obtained in the fraction of the pellet .
  • the productivity described in the present invention is between 60-125 times higher than the productivity described by Paulo Pereira, et al., 2001, (5th International conference on toxic cyanobacteria, July 15-20, 2001, Queensland, Australia) .
  • EXAMPLE 1 Preparation of culture medium [71] For more elaboration of the culture medium, more concentrated 'stock' solutions of micronutrients, mineral salts and vitamins are prepared. All solutions were prepared in distilled water.
  • Vitamin Stock (solution A) is prepared according to the indications in the following table: [73]
  • micronutrient stock (solution B) was prepared from primary solutions of CuSO 4 5H 2 O (1 gf ⁇ ), ZnSO 4 7H 2 O (2.2 g / 1), CoCl 2 6H 2 O (1 g / 1), NaMoO 4 2H 2 O (0.6 g / i).
  • Each reactor of 3 liters capacity was inoculated with the culture medium described in example 1, with 35 million filaments, of Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm.
  • the reactors were maintained at a controlled temperature of 22 0 C ⁇ 2 0 C, with permanent light provided by fluorescent tubes.
  • a third of the total reactor volume (1 liter) was collected and replaced with 1 liter of fresh medium.
  • the previous culture had a doubling rate of 0.33 times a day.
  • the yields of the present invention are always expressed as a function of the number of filaments obtained, since the presence of filaments (association of many individual cells), is an indicator of the quality of the culture, and in permanent reproduction and development.
  • a culture rich in filaments corresponds to a 'healthy' crop and in permanent development.
  • the cell pellet corresponds to filament pellet, and from them the purification of phycotoxins begins.
  • the cell pellet of each batch corresponds to the volume of one liter of culture collected from each reactor each day. This can also be done every two days, achieving greater number of filaments. Under these conditions of maximum production it is preferable to never harvest for periods of more than 4 days, due to crop deterioration and decreased production of ficotoxin.
  • EXAMPLE 3 Comparison of culture with simple MLA medium (unmodified) and modified MLA medium of the present invention.
  • Figure 1 shows the difference between a culture of Aphanizomenon gracile in the simple MLA medium (unmodified) and a culture of Aphanizomenon gracile with the culture medium of the present invention, modified MLA. It is easy to appreciate that the modified medium of the present invention, with a final concentration of 2.8 mM arginine, 1.7 mM methionine and 1 mM allantoic acid, is surprisingly superior to culture using the simple MLA medium (unmodified) ).
  • Table 2 shows the concentration in the supernatant of the different ficotoxins and the yield per cyanobacterial filament thereof. It also indicates the concentration of filaments per me. of culture medium, according to the method of the present invention.
  • Cyano fil cyanobacterial filaments [106] * Cyanobacteria filaments correspond to associations of 20 to 100 cyanobacterial cells. These cyanobacteria form filaments in solution and these are the ones that are counted using inverted phase microscope.
  • Table 3 shows different production lots of phycotoxins. It is clearly seen on the average that the yield of ficotoxin per filament is much higher when the modified MLA culture medium is used together with the growth conditions of the present invention, compared to the simple (unmodified) MLA culture medium, which It represents the prior art.
  • cyanobacteria are always in logarithmic growth, with 24-hour permanent light and permanently harvesting cyanobacteria, inducing permanent growth, by providing new nutrients in volumes equivalent to the volume harvested in each replacement.

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Abstract

La presente invención se relaciona con un método de obtención y producción masiva de una especie de cianobacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes, que comprende los pasos de inocular filamentos de cianobacteria en medio de cultivo MLA complementado con arginina, metionina y ácido alantoico; cultivar la cianobacteria; recolectar un volumen de medio de cultivo y reponer el volumen retirado con medio de cultivo fresco; mantener el cultivo en modo continuo; centrifugar el medio con las cianobacterias.

Description

Descripción
Título de la invención: MÉTODO DE OBTENCIÓN Y PRODUCCIÓN MASIVA DE UNA ESPECIE DE CIANO- BACTERIA AISLADA PRODUCTORA DE FICOTOXINAS PARALIZANTES
Sector técnico
[1] Esta invención se relaciona con un método de producción de cianobacterias (algas verdes-azules fotosintéticas), específicamente al desarrollo de un proceso artificial, masivo, en condiciones controladas, útil para generar metabolitos de interés, tales como toxinas paralizantes, a nivel industrial. El método está caracterizado por su eficiencia, alto rendimiento, simpleza y alta rentabilidad. Técnica anterior
[2] Neosaxitoxina y Saxitoxina son componentes del denominado veneno paralizante, estas toxinas son producidas por dinoflagelados de los géneros Alexandrium sp., Pi- ridinium sp., y Gimnodinium sp. y por ende, también a veces se encuentran en los mariscos bivalvos filtradores y gastrópodos carnívoros contaminados por florecimientos algales nocivos, conocidos comúnmente como mareas rojas, (Lagos, N. (1998)) Microalgal blooms: a global issue with negative impact in Chile. Biol. Res. 31: 375-386). Estas ficotoxinas, además de ser producidas por dinoflagelados en el mar, también son producidas por cianobacterias en agua dulce (algas verdes-azules foto- sintéticas).
[3] Existen publicadas en la literatura, sólo 5 especies de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes de mariscos, cada una de ellas con composición característica tanto en cantidad como tipo de ficotoxinas producidas (perfil de ficotoxinas paralizantes):
[4] - Cylindrospermopsis raciborskii aislada de Brasil (Lagos, N., Onodera, H.,
Zagatto, P.A., Andrinolo, D., Azevedo, S.M.F.Q., and Oshima, Y., 1999, The first evidence of paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Brazil.; TOXICON, 37: 1359 - 1373; Molica, R., Onodera, H., García, C, Rivas, M., Andrinolo, D., Nascimento, S., Meguro, H., Oshima, Y., Azevedo, S., and Lagos, N. ,2002, Toxins in the freshwater cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii, isolated from Tabocas reservoir in Caruaru, Pernambuco, Brazil, Phycologia, 41 (6): 606 - 611).
[5] - Aphanizomenon fíos-aquae aislada en Portugal (Pereira, P., Onodera, H.,
Andrinolo, D., Franca, S., Araujo, F., Lagos, N., and Oshima, Y; 2000, paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteria Aphanizomenon flos-aquae , isolated from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon, 38: 1689 - 1702.
[6] - Anabaena circinalis aislada de Australia (Lagos, 1999)
[7] - Lyngbya wollei aislada en Norte América (Lagos, 1999)
[8] - Aphanizomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm, (Pereira P LMECY A40). Esta alga verde-azul unicelular fotosintética, es la única cianobacteria de este tipo, productora solamente de las tetrahidropurinas: neosaxitoxina y saxitoxina, en una relación de 78 a 82% de neosaxitoxina y 22 a 18% de saxitoxina.
[9] El método propuesto en la presente solicitud, es el cultivo continuo y bajo condiciones controladas de una cianobacteria que produce un perfil simple de ficotoxinas paralizantes. Este perfil depende de la especie cultivada, e incluye a neosaxitoxina y saxitoxina o Gonyaulatoxinas 2 y 3. Además, este método de cultivo, incluye aditamentos de micro nutrientes, permitiendo la producción más alta de estos compuestos farmacológicamente activos por peso húmedo de microalga hasta ahora descrita.
[10] Neosaxitoxina, saxitoxina y gonyaulatoxinas, son compuestos que presentan una estructura básica que corresponde a las tetrahidropurinas y son producidos por las ciano- bacterias mencionadas como metabolitos secundarios. Estos compuestos, como todo metabolitos secundario, se encuentran dentro de las células pero también son liberadas al medio de cultivo. Así, se generan dos fuentes de estos productos: en la fracción de la pella celular y en el medio donde se cultivan las cianobacterias.
[11] El cultivo masivo y continuo de estas cianobacterias, tanto en reactores de iluminación abierta o natural, como en reactores de iluminación cerrada, donde la luz se provee por medios artificiales, como por ejemplo tubos fluorescentes u otro, incluidos led de luz blanca, permite la producción permanente y continua de la cianobacteria, la cual es estrictamente necesaria para la posterior producción a nivel industrial de neosaxitoxina, principal componente a purificar a partir de esta cianobacteria. Sin embargo, dependiendo de la cianobacteria cultivada y de las condiciones del cultivo, se pueden purificar posteriormente no sólo neosaxitoxina, sino también saxitoxina y otros análogos de saxitoxina, como gonyaulatoxinas y otros. Todos estos compuestos pertenecen al grupo de las denominadas ficotoxinas paralizantes.
[12] El proceso de producción industrial y continua con alto rendimiento de cianobacterias, no se ha realizado anteriormente. Hasta ahora no se ha descrito el desarrollo de un procedimiento artificial, para una especie de cianobacteria que tiene un perfil de ficotoxina característico y único; por ejemplo, una composición única con sólo neosaxitoxina y saxitoxina en una proporción definida de 5 a 1 respectivamente o solamente de gonyaulatoxinas en ausencia de otras ficotoxinas paralizantes.
[13] Otra característica ventajosa, es la altísima producción de ficotoxinas en las condiciones y procedimientos de cultivo seleccionadas, y que se describen en la presente invención, lo que permite definir a las cianobacterias como la mejor fuente de estas ñ- cotoxinas, especialmente neosaxitoxina para el caso de Aphanizomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm, el componente mayoritario y el de mayor interés para producir masivamente.
[14] Esta especie de cianobacteria Aphanizomenon(Aph) gracile (Lemm) Lemm, es productora de saxitoxina y mayoritariamente neosaxitoxina, y fue colectada en el Lago Crato, un reservorio de aguas en Portugal, aislada y codificada como LMECYA 41 y fue identificada como Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, primero en función de su morfología y posteriormente de acuerdo a su secuencia génica del 16S rRNA (Paulo Pereira, et al., 2001. 5th Internacional conference on toxic cianobacteria, 15-20 Julio 2001, Queensland, Australia).
[15] Inicialmente esta cepa fue recolectada en una muestra de agua cruda del reservorio, que presentaba una dominancia alta de filamentos de Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, siendo esta la segunda especie dominante, encontrándose en un rango de 32 a 40 % de la masa de la especies encontradas en la muestra original. Posteriormente, en el laboratorio, usando técnicas convencionales y de rutina y por repetitivos y sucesivos lavados y aislados de los tricomas, aislados individualmente y sucesivamente en pequeñas gotas de clonación, tomadas con pinzas (pequeños anillos estériles de aislamiento), todos en medio de cultivo estériles y observados en microscopio invertido, se logra obtener un solo tricoma el cual se transfiere a un frasco estéril de un volumen total de 10 mililitros conteniendo 5 mililitros de medio. El cultivo de esta cianobacteria única (unialgal), creció a 25° C entre dos a cuatro semanas, hasta lograr el desarrollo adecuado para la producción posterior. De este desarrollo original se comienza la expansión y producción masiva de esta cianobacteria unialgal, haciendo replicaciones continuas del cultivo según necesidad, guiándose siempre y de acuerdo al recuento de filamentos mantenidos, siempre, en fase exponencial de crecimiento. Durante esta etapa de crecimiento y de desarrollo del cultivo unialgal, se mantiene la cepa en ciclos de luz-oscuridad de 16:8 horas. Los filamentos son contados usando tinción de lugol en cámaras de conteo tipo sedge-wich-rafter y Palmer-Maloney, controlando así el desarrollo del cultivo.
[16] Este método de aislar una cianobacteria y obtener un cultivo puro, se puede aplicar a cualquiera de las otras cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes anteriormente mencionadas.
[17] Una vez obtenido el cultivo puro, se utiliza como inoculo para la producción masiva de cianobacterias de acuerdo al presente invento.
[18] Las ventajas de la presente invención, a través de producción masiva y en condiciones controladas de cianobacteria productora de ficotoxinas paralizantes, son:
[19] • Una producción continua, permanente y en condiciones controladas de ciano- bacteria productora de ficotoxinas paralizantes
• Bajo costo productivo porque el medio de cultivo es muy elemental, sin nutrientes de alto valor y sólo requiere control de luz, lo cual significa un fácil manejo de la cianobacteria,
• Proveer una fuente continua, independiente de las condiciones y cambios de medios ambientes, de ficotoxinas paralizantes (saxitoxina , neosaxitoxina y gonyaulatoxinas)
• Relación costo-producción-rendimiento muy favorable, no logrado hasta ahora y tampoco descritos en proceso industrial alguno.
Problema técnico
[20] El objetivo general de la presente invención es la producción masiva, continua e industrial, en condiciones controladas y de bajo costo de una cianobacteria productora fundamentalmente de las ficotoxinas paralizantes como saxitoxina, neosaxitoxina y/o gonyaulatoxinas .
[21] Un objetivo específico de la invención, es el desarrollo de un procedimiento de producción optimizada, en una especie de cianobacteria monocultivo a un costo bajo y comercialmente competitivo.
[22] Otro objetivo específico de la invención, es el logro de un procedimiento industrial y continuo, en forma perpetua de esta cepa, como fuente de compuestos de alto valor agregado, no disponible comercialmente y con aplicaciones en terapia clínica de varias patologías.
[23] Otro objetivo específico de la invención, es el logro de un cultivo continuo de esta cepa de cianobacteria, dirigida a favorecer la producción de fundamentalmente neosaxitoxina, con una pequeña cantidad de saxitoxina (un quinto de neosaxitoxina) o de producción fundamental de gonyaulatoxinas 2/3 como componente mayoritario y primordial
[24] Otro objetivo específico de la invención, es lograr una alta producción de neosaxitoxina y/o gonyaulatoxinas por célula de cianobacteria. Solución a problema
[25] En la presente solicitud se presenta un método de obtención y producción masiva de una cianobacteria a través de un cultivo continuo. Las cianobacterias susceptibles de cultivo continuo, son entre otras:
[26] 1. - Cylindrospermopsis raciborskii , Aphanizomenonflos-aquae;
[27] 1. - Aphanizomenon(Aph) issatschenkoi (Usacev) Proskina-Lavrenco;
[28] 1. - Anabaena circinalis , Lyngbya wollei y Aphanizomenon gracile (Lemm)
Lemm.
[29] El conocimiento de las cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes se encuentra asociado al problema de salud pública, en donde la contaminación de moluscos por estas ficotoxinas, relacionadas a floraciones de dinoflagelados productoras de ficotoxinas, tiene un grave impacto en salud pública y en la industria conservera de mariscos en las regiones donde se presentan las mareas rojas, es decir donde hay floración de dinoflagelados productores de ficotoxinas (Lagos 1998).
[30] Estas especies de cianobacterias, cuando fueron descritas, se caracterizaron sólo de acuerdo a sus características anatómicas y clásicas de la taxonomía. Estas especies no fueron estudiadas y ni caracterizadas inicialmente en función de los compuestos que producen y cuando se hizo el estudio de las ficotoxinas que producen, se hizo con el objetivo de comprender y solucionar los problemas a nivel de toxicidad y salud pública, pero hasta la presentación de esta solicitud, nunca se ha propuesto una producción masiva de ficotoxinas paralizantes (todos análogos de saxitoxinas) y derivados a partir de las cianobacterias y tampoco se ha propuesto el cultivo de cianobacterias como una fuente continua y perpetua de ficotoxinas paralizantes.
[31] En la presente solicitud, se presenta un método de obtención y producción masiva de una cianobacteria a través de un cultivo continuo, tomando como ejemplo el cultivo de (Aph) gracile (Lemm) Lemm. Sin embargo, el método de cultivo continuo es aplicable a los géneros de cianobacterias señalados: Cylindrospermopsis raciborskii, Apha- nizomenonflos-aquae, Aphanizomenon(Aph) issatschenkoi (Usacev) Proskina- Lavrenco, Anabaena circinalis, Lyngbya wollei, y Aphanizomenongracile (Lemm) Lemm.
[32] La disponibilidad de estas cianobacterias aisladas, ha permitido desarrollar estudios continuos e inventar este proceso de producción masiva.
[33] Para el cultivo y desarrollo de una cianobacteria, se requieren reactores en serie, abiertos o cerrados y con iluminación directa que cubra a todos los reactores.
[34] El cultivo sólo requiere agua dulce, sales minerales y micronutrientes en bajas cantidades, todos de bajo costo y simples de preparar.
[35] Otro requerimiento preferido es un ciclo de luz permanente sin oscuridad, esta también es una innovación de este procedimiento masivo de cultivo, ya que las cianobacterias son organismos fotosintéticos y requieren luz, y se mantienen a su máximo desarrollo siempre en fase exponencial de crecimiento. En relación a esto, es importante destacar que también se pueden usar ciclos de luz y oscuridad de diferentes rangos horarios, durante el desarrollo de este cultivo continuo, incluso utilizando los ciclos dados por luz natural. Otra innovación del proceso descrito en esta solicitud, es el mantenimiento permanente del cultivo en crecimiento en fase exponencial y en producción permanente de ficotoxinas, esto último, realizando cosechas selectivas y cuantificadas, dependiendo del desarrollo cuantitativo del cultivo en cada reactor.
[36] El cultivo de cianobacterias requiere medios estériles, para mantener los cultivos en las mejores condiciones, sin embargo, estos cultivos no requieren condiciones extremas de esterilidad como en el caso de cultivo de células eucariontes, como por ejemplo células de mamíferos .
[37] Estas cianobacterias son muy resistentes a las contaminaciones y debido a que los requerimientos de su desarrollo son mínimos, los medios de cultivo utilizados en la presente invención, son demasiados 'pobres' para el desarrollo de otros microorganismos, es un medio natural de selección donde sólo se reproducen estos organismos fotosintéticos.
[38] El rango de temperatura óptimo, para el crecimiento de estas cianobacterias, se encuentran dentro del rango normal de las variaciones de temperatura ambientales de un clima Chaparral-Mediterráneo como el del área Central de Chile (entre Arica hasta Temuco).
[39] Cuando la cianobacteria se ha desarrollado, se retira un volumen adecuado para ser utilizada, por ejemplo, en la purificación de un metabolito producido por la cianobacteria, y se repone el volumen retirado del cultivo celular, agregando un volumen equivalente de medio esterilizado. De acuerdo al recuento de filamentos en el tiempo, una vez alcanzado un desarrollo determinado, se puede volver a colectar otro volumen adecuado de cianobacterias, siempre manteniendo el mismo volumen final del medio de cultivo, renovando con un volumen equivalente de recambio cada vez que se colecta un volumen determinado de células.
[40] Se obtiene así un sistema de cianobacterias en cultivo, como fuente continua de producción de cianobacterias.
Efectos ventajosos de la invención
[41] Para iniciar el cultivo a nivel industrial de la cianobacteria productora de ficotoxinas paralizantes, se requiere partir de una cianobacteria aislada y caracterizada, que puede ser, entre otros, de los géneros Cylindrospermopsis sp., Aphanizomenon sp., Anabaena sp., y Lyngbya sp,
[42] El cultivo de cianobacterias, considerando una especie particular elegida, se realiza en reactores aireados apropiados, con agitación y luz permanente. La luz puede ser artificial, por ejemplo, emitida por tubos fluorescentes.
[43] El medio de cultivo considerado para la reproducción de las cianobacterias, consiste en agua destilada, sales minerales y micronutrientes, todos ellos esterilizados.
[44] El medio de cultivo se prepara en base a el medio MLA X 40 (MLA médium,
CSIRO marine research, CSIRO microalgae research center, Hobart, Australia, for cyanobacterial culture(microalgae@)marine.csiro.au), que contiene, entre otros, los siguientes componentes MgSO4 7H2O, NaNO3, K2HPO4, H3BO3, H2SeO4, Biotina, vitamina B 12 y tiamina-HCl, EDTA-Na, cloruro férrico hexahidratado, carbamato de sodio y cloruro de manganeso hidratado, NaHCO3, CaCl2 2H2O, CuSO4 5H2O, ZnSO4 7H2O, CoCl2 6H2O, NaMoO4 2H2O. Además, el medio de cultivo de la presente invención, incorpora arginina, metionina y ácido alantoico.
Descripción breve de las figuras
[45] FIGURA 1 : Producción de filamentos en un día de cultivo considerando el medio de cultivo de la presente invención (Medio MLA modificado con metionina, arginina y ácido alantoico) en condiciones de luz continua y medio de cultivo no modificado (Medio MLA simple) con ciclo de luz:oscuridad. Mejor manera de realizar la invención
[46] En la tabla a continuación, se presentan rangos de concentración de los componentes antes mencionados, útiles para el método de la presente invención. [47]
Figure imgf000008_0001
[48] Adicionalmente, el medio de cultivo comprende entre 2 y 3,5 mM final de arginina, entre 1 y 2,2 mM de metionina y entre 0,7 y 1,3 mM de ácido alantoico. [49] La preparación del medio de cultivo, se realiza usando soluciones 'stock' que se preparan separadamente y se esterilizan, ya sea por filtración o por autoclave. [50] Se conoce el medio de cultivo MLA de CSIRO para el crecimiento de cianobacterias, sin embargo, el medio de cultivo completo descrito en la presente invención considera sales minerales, micronutrientes y vitaminas que no se encuentran en dicho medio ni en ninguna otra publicación respecto al cultivo de cianobacterias.
[51] Una vez preparado el medio, se inoculan las cianobacterias en un rango de 20 a 40 millones de filamentos por cada 3 litros del medio de cultivo de la invención.
[52] Las condiciones de cultivo consideran iluminación constante, proveída por tubos fluorescentes a una temperatura controlada de entre 15 a 350C, preferentemente en un rango de entre 20 a 250C con un óptimo de 22 ± 20C.
[53] En particular, dependiendo del ciclo de división de la cepa utilizada en el cultivo, es posible retirar un volumen de entre 20 a 40% del total del volumen en el reactor para procesar las cianobacterias, y reemplazarlo por un volumen equivalente de medio de cultivo fresco. Por ejemplo, si el ciclo de división es de 0,33 por día, es posible retirar un tercio del volumen del cultivo y reemplazarlo por un volumen equivalente de medio de cultivo fresco, cada 1 ó 2 días.
[54] Para determinar el momento de recolección de cianobacterias, se monitorea el crecimiento a través del conteo de los filamentos y cuidando de restituir un volumen equivalente de medio de cultivo fresco cada vez que se realiza una recolección de cianobacterias.
[55] Existe una publicación donde se describe el cultivo de la cepa de Aphanizomenon
(Aph) gracile (Lemm) Lemm LMECYA40, el medio descrito en la publicación, es totalmente distinto al medio MLA modificado descrito en esta invención. Esta es la primera vez, donde se describe el uso del medio MLA como base para el cultivo de cianobacterias. Para adaptarse al cultivo de las cianobacterias de la presente invención, el medio MLA ha sido modificado, se le ha agregado los componentes arginina, metionina y ácido alantoico, compuestos que sorprendentemente han demostrado ser potentes estimuladores de la producción de las ficotoxinas saxitoxina, neosaxitoxina y gony aulatoxinas .
[56] En primer lugar, el método de la invención comprende generar un inoculo en un rango de 20 a 40 millones de filamentos, este inoculo se desarrolla en matraces pequeños de 250 mililitros en una cámara de cultivo con luz-oscuridad (16:8 horas) y temperatura controlada a 22 ± 2 0C.
[57] El inoculo obtenido se traspasa a reactores, los que deben estar en condiciones estériles y mantenidos en condiciones aisladas.
[58] La temperatura de cultivo del método de la presente invención, es controlada entre 20
- 25 ° C. Por ejemplo, si se quiere producir Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm se debe considerar que esta cepa se cultiva bien en el rango de 15 - 30 0C, siendo sus condiciones óptimas entre 22 + 2 0C. [59] Las células de Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm, tienen un ciclo de división ya conocido de 0,33 por día. Esto significa que en tres días el cultivo duplica su masa celular. Esto permite, colectar un litro de cultivo de cada reactor de 3 litros, cada 1 a 2 días máximo.
[60] Se repone el volumen retirado del cultivo celular agregando un litro de medio esterilizado. Al día siguiente o a los dos, según recuento de filamento, se puede volver a colectar otro litro de cianobacterias, siempre manteniendo un volumen de 3 litros del medio de cultivo.
[61] Se obtiene un sistema de cianobacterias en cultivo como fuente continua de producción de cianobacterias en forma perpetua. La colección de medio de cultivo con cianobacterias se puede realizar convenientemente cada dos días, lográndose así un mayor número de filamentos. Bajo las condiciones de producción máxima no es conveniente espaciar la cosecha por periodos de más de 4 días, ya que al aumentar la concentración de filamentos en el cultivo este se deteriora y se produce una disminución de producción de ficotoxina.
[62] El pellet celular corresponde a las cianobacterias formando filamentos. Estos filamentos tienen desde 20 a 100 células e incluso más células unidas en un filamento. Por eso se denominan cianobacterias filamentosas. Cuando están 'sanas' y creciendo muy bien forman los filamentos, pues ahí es donde se dividen celularmente. Esta característica filamentosa se utiliza como control de crecimiento, ya que es un control positivo de desarrollo de la cianobacteria. La capacidad de formar filamentos permite un mejor control de la contaminación del medio, ya que cuando el medio se contamina y se produce una infección, las cianobacterias no forman filamentos.
[63] El pellet celular está constituido de filamentos y son estos los que se cuantifican en el microscopio de fase invertida, ya que las células individuales son muy pequeñas, difíciles de contar y no existen en un cultivo sano.
[64] Adicionalmente se recolecta el medio libre de células, el sobrenadante de la centrifugación para obtener el pellet, la centrifugación se realiza convenientemente a 10.000 x g x 20 minutos. En este sobrenadante de forma soluble, se encuentran también las ñ- cotoxinas.
[65] Este sobrenadante, corresponde a la segunda fuente de ficotoxinas, en buenas condiciones de cultivo, con filamentos sanos y sin contaminación y en fase de crecimiento exponencial permanente, tiende a ser menos del 5 % del contenido total obtenido en la fracción del pellet.
[66] La productividad descrita en la presente invención, es entre 60 - 125 veces mayor que las productividades descritas por Paulo Pereira, et al., 2001, (5th Internacional conference on toxic cianobacteria, 15-20 Julio 2001, Queensland, Australia) .
[67] L a cepa fue cultivada en condiciones convencionales (sin estos reactores desa- rrollados y usados aquí), con otros nutrientes y micronutrientes y manteniendo ciclos de luz:oscuridad de 16:8 horas y a otras temperaturas. Sin duda en la presente invención, donde se describe una producción masiva e industrial, que incluye no sólo una manera nueva de cultivar en forma continua, sino que además hay un procedimiento con infraestructura novedosa, la cual lleva una propuesta innovadora y cuyo efecto resultante es sorprendente por su alto rendimiento, nunca descrito y demostrado.
[68] Aunque la descripción anterior, contiene muchas especificaciones, esas especificaciones no se deben tomar como limitantes del alcance de la invención, sino sólo como ilustraciones de algunas de las modalidades actualmente preferidas de la invención.
[69] El proceso industrial piloto desarrollado, presenta un cultivo continuo de 200 reactores, permitiendo la recolección diaria de 200 litros de cianobacterias productoras de ficotoxinas paralizantes (neosaxitoxina, saxitoxina o gonyaulatoxinas) Modo de realizar la invención
[70] EJEMPLO 1 : Preparación de medio de cultivo [71] Para la elaboración del medio de cultivo se preparan soluciones 'stock' más concentradas de micronutrientes, sales minerales y vitaminas. Todas las soluciones se prepararon en agua destilada.
[72] El Stock Vitamina (solución A) se prepara de acuerdo a las indicaciones en la siguiente tabla: [73]
Figure imgf000011_0001
[74] Es decir, se tomó 1 mg de biotina y se disuelve en 10 mi de agua destilada. De igual manera, se disolvió 1 mg de vitamina B 12 y se disolvió en 10 mi de agua destilada. De estas dos soluciones anteriores, se tomaron 0,05 mi de cada una y se mezclaron con 10 mg de tiamina HCl en un volumen final de 10OmI completado con agua destilada.
[75] El stock de micronutrientes (solución B) se preparó a partir de soluciones primarias de CuSO4 5H2O (1 gfϊ), ZnSO4 7H2O (2,2 g/1), CoCl2 6H2O (1 g/1), NaMoO4 2H2O (0,6 g/i).
[76] A 800 mi de una solución como la que se indica en la tabla de abajo se agregaron 10 mi de cada una de las soluciones primarias. [77]
Figure imgf000012_0001
[78] Finalmente, se completó el volumen a 1 litro con agua destilada, para obtener 1 litro de solución stock de micronutrientes (solución B). [79] Para la preparación de un stock concentrado del medio MLA x40 de 250 mi, a 130 mi de agua destilada se agregaron los volúmenes indicados para cada componente en la siguiente tabla:
[80]
[81]
[82]
Figure imgf000012_0002
[83] En caso de utilizar autoclave, a 1210C por 15 minutos, se usan las cantidades indicadas abajo, ajustando el pH a 7,5 a 8,0 con HCl u otro ácido apropiado. [84]
Figure imgf000013_0001
[85] Las concentraciones de los componentes finales son las que se indican en la tabla a continuación: [86]
Figure imgf000013_0002
[87] Además de NaHCO3 y CaCl2.2H2O cuya concentración depende de si el medio se esteriliza por filtración o autoclave.
[88] Todas las soluciones se pueden guardar por no más de 1 mes refrigeradas. [89] Finalmente, para obtener el medio de cultivo de la presente invención, se agregó arginina, metionina y ácido alantoico hasta una concentración final de 2,8 mM de arginina, 1,7 mM de metionina y 1 mM de ácido alantoico. [90] Esta mezcla final es determinante para la obtención de estos resultados y estos componentes no son parte del MLA Médium (CSIRO Marine Research) anteriormente descrito.
[91] EJEMPLO 2: Cultivo de Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm
[92] Se inoculó cada reactor de 3 litros de capacidad con el medio de cultivo descrito en el ejemplo 1, con 35 millones de filamentos, de Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) Lemm. Los reactores se mantuvieron a temperatura controlada de 220C ± 20C, con luz permanente proporcionada por tubos fluorescentes. Una vez que el cultivo alcanzó la fase exponencial, se colectó un tercio del volumen total del reactor (1 litro) y se reemplazó con 1 litro de medio fresco. El cultivo anterior presentó una velocidad de duplicación de 0,33 veces diarias.
[93] Posteriormente, el medio de cultivo con las cianobacterias se centrifugó a 10.00Og por 20 minutos.
[94] Los rendimientos del presente invento siempre están expresados en función del número de filamentos obtenidos, debido que la presencia de filamentos (asociación de muchas células individuales), es indicador de la calidad del cultivo, y en permanente reproducción y desarrollo. Un cultivo rico en filamentos, corresponde a un cultivo 'sano' y en desarrollo permanente. El pellet de células corresponde a pellet de filamentos, y a partir de ellos se comienza la purificación de ficotoxinas.
[95] TABLA 1: Número de filamentos de Aphanizomenon (Aph) gracile (Lemm) por mililitro de cultivo en función del tiempo
[96]
Figure imgf000015_0001
[97] El pellet celular de cada lote, corresponde al volumen de un litro de cultivo recolectado de cada reactor cada día. Esto también se puede realizar cada dos días, lográndose mayor número de filamentos. Bajo estas condiciones de producción máxima es preferible nunca cosechar por periodos de más de 4 días, por deterioro del cultivo y disminución de producción de ficotoxina.
[98] EJEMPLO 3: Comparación de cultivo con medio MLA simple (no modificado) y medio MLA modificado de la presente invención.
[99] La figura 1, muestra la diferencia entre un cultivo de Aphanizomenon gracile en el medio MLA simple (no modificado) y un cultivo de Aphanizomenon gracile con el medio de cultivo de la presente invención, MLA modificado. Es fácil apreciar que el medio modificado de la presente invención, con una concentración final de 2,8 mM de arginina, 1,7 mM de metionina y 1 mM de ácido alantoico, es sorprendentemente superior al cultivo usando el medio MLA simple (no modificado).
[100] La tabla 2 a continuación, muestra la concentración en el sobrenadante de las distintas ficotoxinas y el rendimiento por filamento de cianobacteria de las mismas. También indica la concentración de filamentos por mi. de medio de cultivo, de acuerdo al método de la presente invención.
[101] TABLA 2: Producción de neosaxitoxina y saxitoxina en función del número de filamentos y pellet peso húmedo de Aphanizomenon gracile en medio MLA modificado (con arginina, metionina y acido alantoico). Modo de realizar la invención
[102]
Figure imgf000016_0001
[103] STX: saxitoxina [104] neoSTX: neosaxitoxina [105] Ciano fil: filamentos de cianobacteria [106] * Los filamentos de cianobacterias corresponden a asociaciones de 20 a 100 células de cianobacterias. Estas cianobacterias forman filamentos en solución y estos son los que se cuentan usando microscopio de fase invertida.
[107] La tabla 3, muestra distintos lotes de producción de ficotoxinas. Se observa claramente en el promedio que el rendimiento de ficotoxina por filamento es mucho mayor cuando se usa el medio de cultivo MLA modificado junto a las condiciones de crecimiento de la presente invención, comparado con el medio de cultivo MLA simple (no modificado), que representa el estado de la técnica anterior.
[108] TABLA 3: Producción de neosaxitoxina y saxitoxina en función del número de ñ- lamentos en medio MLA modificado (invención) y medio MLA simple.
[109]
Figure imgf000017_0001
[HO] Los rendimientos obtenidos corresponden a una producción sorprendente, no esperada de ficotoxinas puras (neosaxitoxina y saxitoxina), por filamento de ciano- bacteria cultivada en medio MLA modificado (Tabla 2), cuando se compara a la producción de filamentos de cianobacterias puestas en cultivo en condiciones habituales (Medio MLA simple) y descritas hasta ahora en frascos pequeños de cultivo, sin micro-aeración continua y con ciclos de luz: día y sin luz : noche (Tabla 3).
[111] En el ejemplo descrito aquí, las cianobacterias están siempre en crecimiento logarítmico, con luz permanente las 24 horas y cosechando permanentemente las cianobacterias, induciendo un permanente crecimiento, mediante el aporte de nutrientes nuevos en volúmenes equivalentes al volumen cosechado en cada recambio.
[112] Como se demuestra en la tabla 3, el método de la invención logra un rendimiento cerca de 25 veces mayor que los métodos conocidos.
Aplicabilidad industrial
[113] El proceso de producción industrial y continua con alto rendimiento de ciano- bacterias, no se ha realizado anteriormente. Hasta ahora no se ha descrito el desarrollo de un procedimiento artificial, para una especie de cianobacteria que tiene un perfil de ficotoxina característico y único; por ejemplo, una composición única con sólo neosa- xitoxina y saxitoxina en una proporción definida de 5 a 1 respectivamente o solamente de gonyaulatoxinas en ausencia de otras ficotoxinas paralizantes.

Claims

Reivindicaciones
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano- 1] bacteria aislada productora de ficotoxinas paralizantes, CARACTERIZADO porque comprende los pasos de: a. inocular entre 20 y 40 millones de filamentos de cianobacteria por cada 3 litros de medio de cultivo MLA complementado con arginina, metionina y ácido alantoico; b. cultivar la cianobacteria en el medio de cultivo a una temperatura de entre 15 y 350C, con luz natural o artificial; c. recolectar un volumen de medio de cultivo de entre un 20 a un 40% del volumen total cada 1 a 3 días y reponer el volumen retirado con medio de cultivo fresco; d. mantener el cultivo en modo continuo; e. centrifugar el medio con las cianobacterias recolectado en c) entre un rango de 5.000 a 15.000 x g por un período de tiempo de entre 5 y 30 minutos, preferentemente 10.000 x g por 10 minutos.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano2] bacteria monocultivo de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la cianobacteria se selecciona, entre otros, de los géneros Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon(Aph) issatschenkoi (Usacev) Proskina-Lavrenco, Anabaena circinalis, Lyngbya wollei y Aphanizomenon gracile (Lemm) Lemm.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano3] bacteria monocultivo de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque la temperatura de cultivo se encuentra en un rango de 15 y 250C, preferentemente en 22,20C.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano4] bacteria monocultivo de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la luz empleada es artificial y el ciclo de luz es continuo.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano5] bacteria monocultivo de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo MLA comprende MgSO4 7H2 O, NaNO3, K2HPO4, H3BO3, H2SeO4, biotina, vitamina B 12, tiamina HCl, CuSO4-5H2O, ZnSO4-7H2O , CoC12-6H20, NaMoO4-2H20 , Na2 EDTA, FeCl3-OH2O, NaHCO3, MnCl2-H2O complementado con arginina, metionina y ácido alantoico.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano- 6] bacteria monocultivo de acuerdo a la reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo comprende entre 2 y 3,5 mM de arginina, entre 1 y 2,2 mM de metionina y entre 0,7 y 1,3 mM de ácido alantoico.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano- 7] bacteria monocultivo de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo tiene una concentración de arginina final de 2,8 mM.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano- 8] bacteria monocultivo de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo tiene una concentración de metionina final de 1,7 mM.
[ Reivindicación Método de obtención y producción masiva de una especie de ciano- 9] bacteria monocultivo de acuerdo a la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo tiene una concentración de ácido alantoico final de 1,0 mM.
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