CN112110930A - 一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，包括A、肝胰粉制备；B、毒素粗提：将肝胰粉先与水混合涡旋，静置后加入体积为肝胰粉质量2.5倍的酸提取液，涡旋后，依次进行水浴加热、超声提取、离心取上清、50～60℃水浴旋转蒸发获得毒素粗提溶液；C、净化：采用葡聚糖凝胶层析柱对毒素粗提溶液进行净化，毒素粗提溶液离心取上清过凝胶柱，先以200倍体积的去离子水洗脱，流速0.9mL/min，随后改用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，收集含麻痹性贝类毒素组分的馏分，然后合并、浓缩近干；D、分离纯化：将步骤C收集的样品溶解，采用液相色谱进行分离、纯化，根据目标物保留时间收集色谱峰，连续制备合并馏分，浓缩，用含0.1％甲酸的75％乙腈水溶解，保存于‑40℃冰箱中。

Description

一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法
技术领域
本发明属于海洋生物毒素制备技术领域，具体涉及一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法。
背景技术
麻痹性贝类毒素由石房蛤毒素(Saxiotixn,STX)及其衍生物组成，STX是目前发现的非蛋白有机小分子中毒性最强的毒素之一，其毒性是氰化钾的1500倍。由于麻痹性贝类毒素毒性高、具不可预见性且在全球广泛分布，多次引发消费者中毒甚至死亡事件。因此，欧盟、美国、加拿大等多个国家或地区对其制定了严格的限量标准并加以监控。然而，毒素检测技术作为监控的必要手段，受麻痹性贝类毒素标准品的匮乏的影响，而受到了诸多限制。此外，麻痹性贝类毒素在赤潮研究、工具药、医学、军事等方面都有潜在的用途。
目前，以加拿大国家海洋研究所为首的科研机构致力于贝类毒素有证标准物质的研发，目前已经建立了较为完善的贝类毒素分离纯化方法，并研制出20余种贝类毒素纯度标准物质，但由于对商业机密的保护，有关麻痹性贝类毒素分离纯化的详细方法少有公开。目前中国市场中尚无自主研发的麻痹性贝类毒素标准样品，在相关检测与科研工作中使用的麻痹性贝类毒素标准样品均购自加拿大国家海洋研究所，不仅存在到货周期长、价格昂贵、受出入境严格限制等问题，且无法保证运输过程中样品的稳定性。因此，获得自主开发的麻痹性贝类毒素成为目前国内市场的迫切需求。
新石房蛤毒素(neoSTX)是麻痹性贝类毒素众多衍生化合物之一，其毒性因子可达0.92，属于麻痹性贝类毒素中高毒性化合物。此外，在麻痹性贝类毒素的日常监测中，neoSTX阳性率高，较易引发中毒事件。目前，尚未见有关从有毒扇贝中提取neoSTX的相关报道。
因此，开发一种从有毒扇贝中提取新石房蛤毒素(neoSTX)的制备技术，获得neoSTX纯品，满足麻痹性贝类毒素化学检测方法中毒素质量分析的要求实属必要。
发明内容
本发明是为解决上述不足进行的，以有毒扇贝作为毒素来源，提供了一种从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，包括如下四道工序：
A、肝胰粉制备
从有毒贝壳中取出肝胰，沥水、冻干、均质混匀后得到肝胰粉，将体积与肝胰粉质量比为2～3的除杂溶剂与肝胰粉混匀，超声处理并过滤后，去除脂溶性杂质，而后将肝胰粉烘干、均质。
B、毒素粗提
将肝胰粉与水以质量体积比为1:2的比例混合涡旋，静置后加入体积为肝胰粉质量2.5倍的酸提取液，涡旋后，置于100℃水浴加热15～30min，超声提取10～20min后于3000～4000r/min离心6～10min，取上清后，于50～60℃水浴旋转蒸发至近干，去离子水溶液残留物，获得毒素粗提溶液。本步骤中，先将肝胰粉与水进行预混合，有助于提高neoSTX的提取效率。
C、净化
采用葡聚糖凝胶层析柱对毒素粗提溶液进行净化，将毒素粗提溶液于9000r/min离心4～7min，取其上清液过凝胶柱进行层析净化；先以200倍体积的去离子水洗脱，流速0.9mL/min，随后改用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，自动馏分收集器收集馏分，设置每管收集时间为15min，同时将每管收集液取一部分过0.22μm滤膜于进样小瓶中，进LC-MS/MS分析；收集含麻痹性贝类毒素组分的馏分，然后将其合并、40℃减压蒸馏浓缩近干；
D、分离纯化：
将步骤C收集的样品溶解于含0.1％甲酸的20％乙腈溶液中，采用配有光电二极管阵列检测器的液相色谱进行分离、纯化，根据目标物保留时间收集色谱峰，连续制备合并馏分，40℃减压蒸馏浓缩近干，用含0.1％甲酸的75％乙腈水溶解，保存于-40℃冰箱中。
优选的，有毒贝壳包括有毒扇贝或贻贝。
优选的，步骤A中，从有毒贝壳中取出肝胰后，先在筛子上平铺沥水5min，冻干后采用组织均质器以12000r/min进行均质、混匀得到肝胰粉；除杂溶剂为石油醚或正己烷，其体积与肝胰粉的质量比为2.5，混匀并超声处理10min后过滤，完成除杂。
优选的，步骤B中，所采用的酸提取液为1％乙酸或0.5％甲酸。涡旋后，置于100℃水浴加热15～30min，超声提取10～20min后于3000～4000r/min离心6～10min，取上清后，于50～60℃水浴旋转蒸发至近干，去离子水溶液残留物，获得毒素粗提溶液
优选的，步骤C中，葡聚糖凝胶层析柱选用5cmI.D.×30cm，取干重80克胶体粉末浸泡于去离子水中，使其充分浸润膨胀，脱气后充填，然后以去离子水预洗10h，流速1mL/min。
优选的，步骤D中，采用TSK-GELHillicAmide-80色谱柱进行制备，尺寸规格为4.6mm×250mm，5.0μm，进样50μL，每针制备时间为20min。
本发明的有益效果如下：
将根据上述提取方法从有毒扇贝中提取制备的neoSTX，与加拿大国家海洋研究所neoSTX标准物质分别进行定性和定量比对，结果显示提取离子谱图、二级碎片谱图以及质量数均与加拿大国家海洋研究所neoSTX标准物质一致，因此可以确定本发明方法制备的提取物为neoSTX；采用相色谱－串联质谱进行定量测试，结果显示，在线性范围6.5～180ng/mL，线性因子0.99983，加标回收率108％条件下，本发明方法制备的neoSTX含量为64.671ng/mL，符合作为标准品使用的标准。
因此，根据本发明的提取方法从扇贝中提取的新石房蛤毒素(neoSTX)纯品可为国内毒素的测定提供标准品，缓解国内对麻痹性贝类毒素的需求，能满足麻痹性贝类毒素化学检测方法中毒素质量分析的要求，可用于麻痹性贝类毒素的定性或定量检测等。
说明书附图
图1为加拿大国家海洋研究所标准物质neoSTX的提取离子谱图(RT:6.48min)；
图2为本发明提取制备neoSTX纯品的提取离子谱图(RT:6.36min)；
图3为加拿大国家海洋研究所标准物质neoSTX的二级碎片谱图；
图4为本发明提取制备的neoSTX纯品的二级碎片谱图；
图5为液相色谱-高分辨质谱仪测定的标准物质neoSTX质量数([M+H]+,m/z316.1369,Found:316.13589)；
图6为液相色谱-高分辨质谱仪测定的本发明制备的neoSTX质量数([M+H]+,m/z316.1369,Found:316.13617)；
图7为neoSTX的标准曲线图；
图8为本发明提取的neoSTX的定量谱图。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1新石房蛤毒素(neoSTX)提取及分离纯化
A、肝胰粉制备
用清水将毒扇贝壳外表洗净，切断闭壳肌，用蒸馏水淋洗，小心取出肝胰，在筛子上平铺沥水5min，冻干，然后采用组织均质器以12000r/min进行均质、混匀。每200g肝胰粉末中加入500mL石油醚，混匀，超声10min，过滤后，将肝胰粉烘干、均质。
B、毒素粗提
每100g肝胰粉中加入200mL水，涡旋60s后，静置60min，去除上清液；向沉淀物中加入1％乙酸或0.5％甲酸溶液250mL，旋涡60s，再置于100℃水浴加热20min，超声提取10min后于3500r/min离心6min，取出上清液，于60℃水浴旋转蒸发至近干；用10mL去离子水溶解残留物，获得毒素粗提溶液。
C、净化
采用葡聚糖凝胶层析柱对毒素粗提溶液进行净化，葡聚糖凝胶层析柱选用5cmI.D.×30cm，制备时，取干重80克胶体粉末(Bio-GelP2，400目)浸泡于去离子水中，使其充分浸润膨胀，脱气后充填，然后以去离子水预洗10h，流速1mL/min。
将毒素粗提溶液于9000r/min离心5min，取其上清液2mL过凝胶柱进行层析净化；先以400mL的去离子水洗脱，流速0.9mL/min，随后改用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，自动馏分收集器收集馏分，设置每管收集时间为15min，同时将每管收集液取一部分(如500500μL)过0.22μm滤膜于进样小瓶中，进LC-MS/MS分析；收集含麻痹性贝类毒素组分的馏分，然后将其合并、40℃减压蒸馏浓缩近干。
在实际实验过程中，每次进样进行层析净化过程中，neoSTX是在第75至第82馏分管中被收集。
D、分离纯化：
步骤C收集的样品溶解于20mL20％乙腈溶液(含0.1％甲酸)，采用配有光电二极管阵列检测器的液相色谱进行分离、纯化。采用TSK-GELHillicAmide-80-色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)进行制备，进样50μL，每针制备时间为20min，根据目标物保留时间收集色谱峰，连续制备合并馏分，40℃减压蒸馏浓缩近干，用75％乙腈水(含0.1％甲酸)溶解并稀释至60mL，保存于-40℃冰箱中。
之所以要稀释进行保存，一方面由于浓缩后纯品很少，肉眼几乎不可见，为便于容器中保存，故进行稀释；另一方面，由于制备的目标样品均为液体状态，在此处进行稀释定容，便于后续定性定量实验。
实施例2：定性检测
采用液相色谱-四极杆/离子阱复合质谱的提取离子谱图、二级碎片谱图将实施例1制备的neoSTX纯品与加拿大国家海洋研究所标准物质的多级质谱信息进行匹配；采用液相色谱-高分辨质谱仪测定精确质量数，通过这三种方式进行定性确定。其中，加拿大国家海洋研究所标准品购自2019年，产品批号LOT#20170411。
液相色谱-四极杆/离子阱复合质谱测试方法如下：
1)色谱柱：TSK-GelAmide-80,2.1mmI.D.×10cm，5μm。
2)流速：0.5mL/min。
3)柱温：35℃。
4)进样体积：5μL。
5)标准品进样浓度：120ng/mL。
6)流动相：A为含0.1％甲酸的水溶液，B为乙腈溶液，梯度洗脱条件见表1；
7)离子源：电喷雾离子源。
8)扫描方式：正离子扫描。
9)喷雾电压：4500V。
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0002684300090000051
液相色谱-高分辨质谱测试方法如下：
1)色谱柱：TSK-GelAmide-80,3.0mmI.D.×15cm，3μm。
2)流速：1.2mL/min。
3)柱温：40℃。
4)进样体积：10μL。
5)流动相：A为含2mmol/L甲酸铵，50mmol/L甲酸的水溶液，B为含2mmol/L甲酸铵，50mmol/L甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件见表2；
表2梯度洗脱条件
Figure BDA0002684300090000061
6)离子源：电喷雾离子源。
7)扫描方式：正离子扫描。
8)喷雾电压：5000V。
9)气帘气压力CUR：40psi。
10)雾化气压力GS1：70psi。
11)辅助加热气压力GS2:70psi。
12)碰撞气CAD：Medium。
13)多反映监测MRM母离子、子离子和碰撞能量见表3。
表3 neoSTX母离子、子离子和碰撞能量
Figure BDA0002684300090000062
根据图1～图6所示的谱图结果，从扇贝中提取制备的neoSTX的提取离子谱图、二级碎片谱图以及质量数均与加拿大国家海洋研究所neoSTX标准物质一致，因此可以确定提取物为neoSTX。
实施例3：定量测试
准确取50μL收集的溶液，加入950μL75％乙腈水(含0.25％甲酸)，充分混匀后进液相色谱－串联质谱测定，从而对收集的溶液浓度进行定值。
参照图7中的neoSTX的标准曲线图，以及图8显示的neoSTX的定量谱图。结果显示，在线性范围6.5～180ng/mL，线性因子0.99983，加标回收率108％条件下，neoSTX的含量为64.671ng/mL，符合作为标准品的纯度要求。
在上述实施例中，以有毒扇贝作为原料进行毒素提取，但实际上其他染毒的双壳贝类，如染毒贻贝，均可以从中提取。此外，若有毒贝类中含有其他含量较高的毒素，也可用此制备技术进行其他种类麻痹性贝类毒素的制备，本发明方法并不仅限于石房蛤毒素的提取。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种从有毒贝壳中提取石新房蛤毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、肝胰粉制备
从有毒贝壳中取出肝胰，沥水、冻干、均质混匀后得到肝胰粉，将体积与肝胰粉质量比为2～3的除杂溶剂与肝胰粉混匀，超声处理并过滤后，将肝胰粉烘干、均质；
B、毒素粗提
将肝胰粉与水以质量体积比为1:2的比例混合涡旋，静置后加入体积为肝胰粉质量2.5倍的酸提取液，涡旋后，置于100℃水浴加热15～30min，超声提取10～20min后于3000～4000r/min离心6～10min，取上清后，于30～60℃水浴旋转蒸发至近干，去离子水溶液残留物，获得毒素粗提溶液；
C、净化
采用葡聚糖凝胶层析柱对毒素粗提溶液进行净化，将毒素粗提溶液于8000～10000r/min离心4～7min，取其上清液过凝胶柱进行层析净化；先以200倍体积的去离子水洗脱，流速0.5～0.9mL/min，随后改用0.1mol/L醋酸溶液洗脱，自动馏分收集器收集馏分，设置每管收集时间为15min，同时将每管收集液取一部分过0.22μm滤膜于进样小瓶中，进LC-MS/MS分析；收集含麻痹性贝类毒素组分的馏分，然后将其合并、30～40℃减压蒸馏浓缩近干；
D、分离纯化：
将步骤C收集的样品溶解于含0.1％甲酸的20％乙腈溶液中，采用配有光电二极管阵列检测器的液相色谱进行分离、纯化，根据目标物保留时间收集色谱峰，连续制备合并馏分，30～40℃减压蒸馏浓缩近干，用含0.1％甲酸的75％乙腈水溶解，保存于-40℃冰箱中。
2.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：
其中，有毒贝壳包括有毒扇贝或贻贝。
3.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：
其中，步骤A中，从有毒贝壳中取出肝胰后，先在筛子上平铺沥水5min，冻干后采用组织均质器以12000r/min进行均质、混匀得到肝胰粉；
所述除杂溶剂为石油醚或正己烷，其体积与肝胰粉的质量比为2.5，混匀并超声处理10min后过滤，完成除杂。
4.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：
其中，步骤B中，所采用的酸提取液为1％乙酸或0.5％甲酸。
5.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：
其中，步骤C中，葡聚糖凝胶层析柱选用5cm I.D.×30cm，取干重80克胶体粉末浸泡于去离子水中，使其充分浸润膨胀，脱气后充填，然后以去离子水预洗10h，流速1mL/min。
6.根据权利要求1所述的从有毒贝壳中提取新石房蛤毒素的方法，其特征在于：
其中，步骤D中，采用TSK-GELHillicAmide-80色谱柱进行制备，尺寸规格为4.6mm×250mm，5.0μm，进样50μL，每针制备时间为20min。
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