CN109142595A - 一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，属于生物技术领域。所述方法以有毒贻贝为原料，采用1％的乙酸水进行提取，依次用Sephardex LH20进行净化收集目标馏分后再经高效液相色谱用TSK‑GEL Hillic Amide‑80色谱柱(4.6×250mm，5μm)进行制备，以95％的乙腈水溶液(0.1％甲酸)和纯水(0.1％甲酸)作为流动相，在保留时间为8‑11分钟内收集GTX1&4、GTX2&3色谱峰。均匀性实验中，测得毒素样品溶液的均匀性较好，能满足麻痹性毒素化学检测方法(液质法)中毒素质量分析的要求。

Description

一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及含毒贻贝中麻痹性贝类毒素即膝沟藻毒素GTX1～4标准溶液的制备方法。
背景技术
麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins，PSTs)被认为是危害最严重、分布最广的海洋生物毒素之一，已确定近60种左右的结构类似物。PSTs是高致毒性的神经性毒素，不可预见性强且在全球广泛分布，多次造成消费者中毒甚至死亡事件。因此，欧盟、美国、加拿大等多个国家对13种PSTs制定了严格的限量标准(800μg STX﹒2HCl/kg)并加以监控，成为海产贝类国际贸易壁垒主要的限制对象。鉴于PSTs毒素可由双鞭甲藻，如亚历山大藻属(Alexandrium)、膝沟藻属(Gonyaulax)和裸甲藻属(Gymnodinium)等多种单细胞藻类产生，其风险因产毒藻种类、藻株、地理位置、贝类种类，甚至代谢产物的不同而有很大差异，给监控监管工作带来一定的困难。目前全球已商品化的贝类毒素标准样品极少，主要由加拿大国家科学院海洋生物学研究所、日本Wako公司、LKT、Sigma等少数机构研发生产。从2015年起，欧盟全面废止小鼠生物法在脂溶性贝类毒素的监控中的使用，取而代之的是对目标物定性/定量更为精确的液相色谱串联质谱检测方法(LC-MS/MS)。采用化学分析方法，在定性/定量以及检出限等指标上能更精确满足目标化合物测试需求，但必须使用商品化标准样品用于样品的定量分析与结构确证。此外CAC下属机构CCFFP所强调的风险评估也需要借助贝类毒素标准样本才能完成。因此化学分析法应该是今后贝毒检测的趋势与要求，与其配套使用的贝类毒素标准样品的重要性与需求骤然凸显。
贝类毒素标准品的制备是水产品质量安全保障的基础。早在1995年，美国就在其制订的“海洋生物毒素与有害藻”国家研究计划中指出了毒素制备的重要性。亚太经济合作组织也曾专门组织力量进行毒素分析方法和标准样品研究(APEC's Task Team onAnalytical Methods and Standards for Marine Algal Toxins)。90年代中期之后，研究人员开始尝试纯化石房蛤毒素及其衍生物用作贝毒的标准样品，以加拿大国家研究院海洋生物科学研究所为代表，经过10余年的持续研究和发展，目前已经建立了较为完善的毒素分离纯化方法和毒素质量分析方法，可以提供的毒素标准样品种类也已经达到10余种，但是出于商业机密目的，有关各种毒素分离纯化方法的文章和专利非常有限，难以获得。为了完成日常科研与监测任务，目前的标准品均购自加拿大海洋研究所，不仅存在到货周期长且出入境有严格的管理规定的问题，尤其无法保证运输过程中的样品稳定性。标准品最高浓度约10μg/mL溶液状态，每份体积为0.5mL，即不利于样品的保存且取用时浪费，给检测带来巨大成本。
近几年，已经建立完善了多种麻痹性毒素的检测方法，如生物检测法、免疫分析法、细胞毒性检测法及理化分析方法等。每一种方法都需要标准样品来定量和定性，以及质控样品对于检测方法的控制。我国对于具有溯源、有证、实物标样的麻痹性贝类毒素标准样品或质量控制样品制备技术是个空白，尚未见有关其标准样品的研制报道。
研制麻痹性贝类毒素标准溶液可以满足对贝类毒素监控的需求，解决国内外贝类产品检测实验室的严重缺乏贝类毒素样品的需求，对提高食品安全检测技术、解决技术壁垒、保障食品安全起到重大的作用，同时也提高我国在国际上的影响力。
发明内容
本发明是针对目前麻痹性毒素市售标准品价格高昂，提供一种低成本的麻痹性毒素膝沟藻毒素标准溶液的制备方法。
本发明可提供应用本方法制备的麻痹性贝毒膝沟藻毒素标准溶液样品。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，包括步骤如下:
(1)从有毒贝类阳性样品中提取麻痹性毒素，获得粗提毒素提取液；
(2)将步骤(1)所述粗提毒素提取液用Sephardex LH20进行净化，Sephardex LH20柱用的洗脱液为体积比20％甲醇水溶液，其中含有体积比0.1％甲酸；
进一步，所述粗提毒素提取液在净化前先进行离心，离心条件为4000rmp/min离心5min。
进一步，净化后的溶液过0.22μm滤膜。
(3)将步骤(2)处理后的样品过高效液相色谱柱，用含体积比0.1％甲酸的乙腈/水混合液进行梯度洗脱，收集目标色谱峰，旋转蒸发仪或冷冻干燥机浓缩，制得标准样品浓缩溶液；
进一步，步骤(1)中从有毒贻贝中提取毒素的方法：将有毒贻贝清洗破碎均质、混匀后加入体积比1％乙酸水溶液提取，涡旋并水浴加热，再超声处理后离心，然后上述提取操作重复一次后合并上清液，用等体积正己烷萃取一次，弃掉正己烷层，然后再用等体积乙酸乙酯萃取一次，将收集下层水相溶液浓缩，备用。
进一步，所述的超声提取时间为10min；离心条件为3500rmp/min离心5min。
进一步，所述的收集下层溶液浓缩：取下层溶液用旋转蒸发仪进行减压蒸馏，蒸馏过程中恒温水浴锅的温度为60℃，压力从130Pa逐级降到45Pa；将溶液液旋蒸至干后用体积比20％甲醇溶液溶解，获得粗提毒素溶液；所述体积比20％甲醇溶液含有体积比0.1％的乙酸。
进一步，高效液相色谱仪配有光电二极管阵列检测器及Empower3数据处理系统；色谱柱:TSK-GEL Hillic Amide-80色谱柱，4.6×250mm，5μm；流动相：A相为体积比95％的乙腈水溶液，其含有体积比0.1％甲酸，B相为水，其含有体积比0.％1甲酸；柱温30℃；进样量20μL；流速1mL/min；梯度洗脱:0-1min，80％A，20％B；1-8min，80％-40％A，20％-60％B；8-11min，40％A，60％B；11-12min，40％-80％A，60％-20％B；12-20min，80％A，20％B，上述梯度洗脱中的百分数均为体积比；每针制备时间为20min，根据目标物保留时间tR8-11min收集色谱峰，连续制备合并馏分，40℃减压蒸馏进行浓缩至干，用体积比75％乙腈水溶液稀释，所述体积比75％乙腈水溶液含有体积比0.25％甲酸。
本发明与现有技术相比的有益效果：
麻痹性毒素由于其属于水溶性毒素，且结构中没有发色团给分离纯化和制备带来诸多困难。现在国外的麻痹性毒素的制备原料及方法处于未公开状态，无法查阅资料。国内关于麻痹性毒素特别是膝沟藻毒素(见图1)没有相关标准溶液样品制备的报道，只检索到部分含毒素的贝肉标准样品的文献和专利信息，贝肉标准样品只能用于方法验证和质量控制，并不能满足贝类毒素日常监管需要对定性定量的需求。本专利中提供的标准溶液则能满足麻痹性毒素化学检测方法(液质法)中毒素质量分析的要求。
附图说明
图1是膝沟藻毒素的化学结构式；
图2是本发明的膝沟藻毒素标准溶液制备工艺流程示意图；
图3是本发明的膝沟藻毒素标准溶液的二级碎片信息；
图4是本发明的溶液毒素标准样品的高分辨质谱精确质量数谱图及精确质量数。
具体实施方式
下面通过实施例1结合附图来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1
有毒贻贝样品于2017年4～7月份采自秦皇岛山海关海域(119.40°E～119.46°E，39.54°N～39.57°N)。利用贻贝肉制备麻痹性毒素的标准溶液的方法，具体工艺流程见图2。
(1)麻痹性毒素的提取：采集含毒贻贝样品，取整贝组织进行麻痹性贝类毒素的分析。用清水将贝壳外表洗净。切断闭壳肌，用蒸馏水淋洗，仔细取出贝肉，切勿割破贝体，在筛子上平铺沥水5min，然后将贝肉均质、混匀。每100g贝肉中加入1％乙酸水溶液100mL，然后涡旋60s，再置于100℃水浴加热5min，超声提取10min后于3500rmp/min离心5min，取上清液至另一试剂瓶中，残渣继续加入100mL提取剂重复上述实验，合并上清液，每200mL提取液分别用等体积正己烷和乙酸乙酯各萃取一次，取下层溶液用旋转蒸发仪进行减压蒸馏，蒸馏过程中恒温水浴锅的温度为60℃，压力从130Pa逐级降到45Pa。将溶液液旋蒸至干后用20％甲醇溶液(含0.1％的乙酸)5mL溶解，获得粗提毒素溶液；
(2)粗提毒素的净化：粗提毒素溶液进一步用羟丙基葡聚糖凝胶柱Sephadex LH20进行净化，先取150g Sephadex LH20用800mL20％甲醇溶液(含0.1％的乙酸)活化过夜，然后取玻璃层析柱(5cm×120cm)用湿法装柱。将粗提毒素溶液于4000rmp/min离心5min，取其上清液过凝胶柱进行分离净化。采用20％甲醇溶液(含0.1％的甲酸)作为洗脱剂进行洗脱，自动馏分收集器收集馏分，设置每管收集时间为7min，共收集100管。将每管收集液取500uL过0.22μm滤膜于进样小瓶中，进行HPLC-MS/MS分析。测定第55-65管馏分含GTX1&4和GTX2&3的组分，然后将其合并、浓缩，备用。
(3)高效液相色谱制备色谱：将步骤(2)收集的样品溶解于1mL20％乙腈水(0.％1甲酸)并采用配有光电二极管阵列检测器及Empower3数据处理系统的Waters e2695高效液相色谱进行制备。色谱柱:TSK-GEL Hillic Amide-80色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：A相为体积比95％的乙腈水溶液(含提体积比0.1％甲酸)，B相为水(含体积比0.％1甲酸)；柱温30℃；进样量20μL；流速1mL/min；梯度洗脱:0-1min，80％A，20％B；1-8min，80％-40％A，20％-60％B；8-11min，40％A，60％B；11-12min，40％-80％A，60％-20％B；12-20min，80％A，20％B，上述梯度洗脱为体积比。每针制备时间为20min，根据目标物保留时间(tR8-11min)收集色谱峰，连续制备合并馏分，40℃减压蒸馏进行浓缩至干，用75％乙腈水(含0.25％甲酸)稀释为3ml。
(4)封装所属标准溶液样品：准确移取50μL样品溶液，加入950μL 75％乙腈水(含0.25％甲酸)于1ml安瓿瓶中，用酒精喷灯封口，加贴唯一性标示，冻存；
(5)分别用液相色谱串联质谱分析法的二级碎片谱图与标准品谱库匹配(图3、表1)和高分辨液相色谱仪测定精确质量数(图4、表2)两种方式进行结构鉴定，二级谱图匹配度Fit值大于85％，且高分辨质谱实测精确质量数与理论值高度吻合，两种检测方法均证明所分离标准溶液为高纯度GTX1&4和GTX2&3。
表1.PSPs的质谱分析参数
表2.GTX1～4高分辨质谱信息
(6)定量并检验所述标准样品的均匀性
对同一批制备的麻痹性贝类毒素样品进行分装，每瓶标准样品溶液规格为0.5mL，共50瓶。随机抽取15个小瓶，然后HPLC-MS/MS分析GTX1&4和GTX2&3浓度，每瓶样品重复测试三次，分析标准溶液样品的毒素含量。所有试样以随机次序在重复性条件下测试，对麻痹性贝类毒素进行纯度均匀性检验，结果见表3和表4。
从表3的结果分析可知，P＝0.9449>0.05，充分说明了试验结果间没有显著性差异，证明样品均一，麻痹性贝类毒素标准溶液中GTX1、GTX2、GTX3、GTX4均匀性良好。最终毒素样品溶液的特性量值分别为GTX1为3663μg/L，GTX4为1147μg/L，GTX2为1884μg/L，GTX3为797μg/L。
表3麻痹性毒素标准溶液样品均匀性试验(μg/L)
表4麻痹性毒素标准溶液样品均匀检验结果
(7)稳定性试验
为了考察样品的稳定性，确定其有效期，取本标准样品模拟上市包装，在温度为4℃和-18℃的条件下进行稳定性试验。分别在第0，1，2，3，4，5，6个月每次随机选取3个样品进行毒素测定。根据CNAS-GL 29采用直线经验模型分析样品的稳定性。根据稳定性结果，确定标准样品的有效期。监测结果见表5和表6。
表5.+4℃条件下储藏6个月
表6.-18℃条件下储藏6个月
以上结果表明标准样品在两种常规保存环境条件下稳定性较好。
本发明方法制备的膝沟藻毒素标准样品，其毒素组分包括GTX1、GTX2、GTX3、GTX4均匀性良好。

Claims (7)

1.一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于所述方法包括步骤如下:
(1)从有毒贝类阳性样品中提取麻痹性毒素，获得粗提毒素提取液；
(2)将步骤(1)所述粗提毒素提取液用Sephardex LH20进行净化，Sephardex LH20柱用的洗脱液为体积比20％甲醇水溶液，其含有体积比0.1％甲酸；
(3)将步骤(2)处理后的样品过高效液相色谱柱，用含体积比0.1％甲酸的乙腈/水混合液进行梯度洗脱，收集目标色谱峰，旋转蒸发仪或冷冻干燥机浓缩，制得标准样品浓缩溶液。
2.根据权利要求1所述的一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于步骤(1)中从有毒贻贝中提取毒素的方法：将有毒贻贝清洗破碎均质、混匀后加入体积比1％乙酸水溶液提取，涡旋并水浴加热，再超声提取后离心，然后上述提取操作重复一次后合并上清液，用等体积正己烷萃取一次，弃掉正己烷层，然后再用等体积乙酸乙酯萃取一次，将收集下层水相溶液浓缩，备用。
3.根据权利要求2所述的一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于所述的超声提取时间为10min；离心条件为3500rmp/min离心5min。
4.根据权利要求2所述的一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于所述的收集下层水相溶液浓缩：取下层水相溶液用旋转蒸发仪进行减压蒸馏，蒸馏过程中恒温水浴锅的温度为60℃，压力从130Pa逐级降到45Pa；将溶液液旋蒸至干后用体积比20％甲醇溶液溶解，获得粗提毒素溶液；所述体积比20％甲醇溶液含有体积比0.1％的乙酸。
5.根据权利要求1所述的一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于所述粗提毒素提取液在净化前先进行离心，离心条件为4000rmp/min离心5min。
6.根据权利要求1所述的一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于净化后的溶液过0.22μm滤膜。
7.根据权利要求1所述的一种麻痹性贝类毒素标准溶液的制备方法，其特征在于高效液相色谱仪配有光电二极管阵列检测器及Empower3数据处理系统；色谱柱:TSK-GELHillic Amide-80色谱柱，色谱柱为4.6×250mm，5μm；流动相：A相为体积比95％的乙腈水溶液，其含有体积比0.1％甲酸，B相为水，其含有体积比0.％1甲酸；柱温30℃；进样量20μL；流速1mL/min；梯度洗脱:0-1min，80％A，20％B；1-8min，80％-40％A，20％-60％B；8-11min，40％A，60％B；11-12min，40％-80％A，60％-20％B；12-20min，80％A，20％B，上述梯度洗脱中的百分数均为体积比；每针制备时间为20min，根据目标物保留时间tR8-11min收集色谱峰，连续制备合并馏分，40℃减压蒸馏进行浓缩至干，用体积比75％乙腈水溶液稀释，所述体积比75％乙腈水溶液含有体积比0.25％甲酸。
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