JP7025336B2 - 適応のための方法 - Google Patents
適応のための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7025336B2 JP7025336B2 JP2018541518A JP2018541518A JP7025336B2 JP 7025336 B2 JP7025336 B2 JP 7025336B2 JP 2018541518 A JP2018541518 A JP 2018541518A JP 2018541518 A JP2018541518 A JP 2018541518A JP 7025336 B2 JP7025336 B2 JP 7025336B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oxygen
- concentration
- antioxidant
- applied voltage
- cysteine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
「適応」は、動的な進化過程であり、例えば、自然な選択の結果、生物がその1つ以上の生息地でより良く生存することができるようになることである。微生物の適応(又は訓練)過程は、有利には、本発明の方法のような非天然/人工/in vitro環境で実施することもできる。
式中、
Eh=酸化還元電位=V
Eo=(還元剤/酸化防止剤)/酸化された対応物の対の標準酸化還元電位
R=一般的な気体定数=8.31451JK-1mol-1
F=ファラデー定数=96.485C/mol
T=絶対温度(K)
n=関与する電子の数
4R-SH+O2→2R-SS-R+H2O (b)
a)細菌細胞を致死濃度の酸素から保護し、腸内の酸化還元環境を模擬的に再現するために、適切な酸化還元メディエーター及び還元剤を含む(当該技術分野で公知の)培地に細菌の1個のコロニーを接種する。
b)培養物が後期対数期に達したら、培養物の一部分を分析に使用することができ、別の部分を可能なSHIRMへの再接種のために使用することができる。
c)細菌株の一次単離及び通常の細菌株の栽培に使用されるのと同じ培地を含むSHIRMリアクター中での培養物の接種。ここで、成長培地は、Shirm Bed Culture Medium(SBCM)と呼ばれる。
I.還元剤/酸化防止剤(例えば、限定されないが、システイン、グルタチオン、アスコルビン酸、ジチオトレイトール及び没食子酸)の濃度は減り、同等の量の対応する「酸化された対応物」(例えば、限定されないが、シスチン、グルタチオン酸化状態、デヒドロアスコルベート、酸化ジチオトレイトール及び酸化没食子酸)を用いて均衡が保たれる。
II.印加電気酸化電位は、外部電圧によって、ポテンシオスタットを介し、例えば、グラファイト、グラファイトフェルト又はカーボンフェルト又は炭素繊維アノードで維持される。例えば、カソードチャンバを、プロトン交換膜によって分離されたアノードチャンバの片側のアームに接続することによって、セル回路が完成する。
III.酸素の流れは、異なる酸素拡散定数を有する可変隔膜を介して分離されたアノードチャンバの他の側のアームに酸素フィーダーを接続することによって制御される。瞬間的な酸素の流れは、例えば、ClarkのDO型プローブによって測定される(図4Aを参照)。
IV.純酸素ガス又は空気で酸素フィーダーをパージすることによって酸素の流れを維持し、ヘンリーのガス溶解性の法則に従って所望の溶存酸素濃度を達成する。次いで、溶存酸素が酸素フィーダーを通ってアノードチャンバに拡散する。
V.さらに、酸素の流れは、酸素フィーダーの床容積を変えることによって制御される。酸素フィーダーは、アノードチャンバに酸素を直接拡散させるために取り外すこともできる。
VI.アノードチャンバと酸素フィーダーとの間の隔膜は、酸素フィーダーからアノードチャンバへの酸素拡散をより良く制御するために、ムチン寒天でさらにコーティングされていてもよい。
VII.SHIRMは、Shirm Bed Culture Media(SBCM)を含み、酸素を含まない窒素をパージし、溶存酸素を除去する。
VIII.SHIRMバイオリアクターは、培養物が静止期に達するまで実行される。
d)最初の継代培養物の一部をSHIRMリアクターに接種するために使用する。
e)SHIRMリアクターにおける再接種は、酸化防止剤の濃度の段階的な減少、酸化された対応物の濃度の増加及び増加した印加電圧(最大で0.6V)を有するように開始される。酸化防止剤が少ないほど、捕捉する酸素が少ないため、より多くの酸素が利用可能であり、細胞は、多くの酸化ストレスを経験する。酸素フィーダーは、酸素拡散の流れをさらに制御する。
この工程は、成長が減少するまで繰り返される。
f)全ての条件を一定に保ち、再接種を繰り返し、新しい継代培養物を、比較代謝特性、成長速度、安定性及び耐性について分析する。分析が満足のいく結果であれば、この継代培養物が選択され、そうでなければ工程(f)が繰り返される。
a)細菌細胞を致死濃度の酸素から保護し、腸内の酸化還元環境を模擬的に再現するために、適切な酸化還元メディエーター及び還元剤を含む当該技術分野で公知の通常の培地に細菌の1個のコロニーを接種する。
b)培養物が後期対数期に達したら、培養物の一部分をSHIRMリアクターへの接種のために使用し、別の部分を分析のために保存する。
c)細菌株の一次単離及び通常の細菌株の栽培に使用されるのと同じ培地を含むSHIRMリアクター中での培養物の接種。ここで、成長培地は、Shirm Bed Culture Medium(SBCM)と呼ばれる。
I.還元剤/酸化防止剤(例えば、限定されないが、システイン、グルタチオン、アスコルビン酸、ジチオトレイトール及び没食子酸)の濃度は減り、同等の量の対応する「酸化された対応物」(例えば、限定されないが、シスチン、グルタチオン酸化状態、デヒドロアスコルベート、酸化ジチオトレイトール及び酸化没食子酸)を用いて均衡が保たれる。
II.印加電気酸化電位は、外部電圧によって、ポテンシオスタットを介し、グラファイト、グラファイトフェルト又はカーボンフェルト又は炭素繊維アノードで維持される。カソードチャンバを、プロトン交換膜によって分離されたアノードチャンバの片側のアームに接続することによって、セル回路が完成する。
III.酸素の流れは、異なる酸素拡散定数を有する可変隔膜を介して分離されたアノードチャンバの他の側のアームに酸素フィーダーを接続することによって制御される。瞬間的な酸素の流れは、例えば、ClarkのDO型プローブによって測定される(図4Aを参照)。
IV.純酸素ガス又は空気で酸素フィーダーをパージすることによって酸素の流れを維持し、ヘンリーのガス溶解性の法則に従って所望の溶存酸素濃度を達成する。次いで、溶存酸素が酸素フィーダーを通ってアノードチャンバに拡散する。
V.さらに、酸素の流れは、酸素フィーダーの床容積を変えることによって制御される。酸素フィーダーは、アノードチャンバに酸素を直接拡散させるために取り外すこともできる。
VI.アノードチャンバと酸素フィーダーとの間の隔膜は、酸素フィーダーからアノードチャンバへの酸素拡散をより良く制御するために、ムチン寒天でさらにコーティングされていてもよい。
VII.SHIRMは、SBCMを含み、酸素を含まない窒素をパージし、溶存酸素を除去する。
VIII.次いで、最初の接種に使用したSBCMをSBCM X,Y/VZと命名することができ、ここで、Xは、酸化防止剤の濃度(mM)を指し、Yは、酸化された対応物の濃度(mM)を指し、「VZ」は、Ag/AgClに対する印加電圧(V)を示す。SHIRMバイオリアクターは、培養物が静止期に達するまで実行される。
IX.最初のインキュベート後に回収された培養物を「集合P1」と命名することができる。
d)SHIRMリアクターにおける次の接種は、酸化防止剤の濃度の減少、酸化された対応物の濃度の増加及び増加した印加電圧を有するように開始される。酸化防止剤が少ないほど、捕捉する酸素が少ないため、より多くの酸素が利用可能であり、細胞は、多くの酸化ストレスを経験する。酸素フィーダーは、酸素拡散の流れをさらに制御する。
e)再接種は、約6継代培養まで継続される。図5及び図8を参照(酸化防止剤/酸化還元メディエーターの効果を合わせたとき、酸素の流れ及び電圧は、成長に著しく影響を及ぼす(低下する))。
f)過電圧のため、印加電圧は、一般的に、AgAgClに対して0.6Vを超えて上昇しないだろう。さらに高い電位は、電極の急速な汚れを引き起こし、さらに、例えばSHEに対して約+0.385Vの還元電位を有するシトクロムa3などの微生物シトクロムの致命的な酸化を引き起こす。
g)全ての条件を一定に保ち、約27継代培養まで(図5を参照)又は約10継代培養まで(図8を参照)まで、より正確には、株がその条件に適応するまでの(適応の可能性を上げるための)十分な継代数の継代培養までの繰り返し接種を行ったが、全ての継代培養で新鮮な培地を使用した。
h)第27継代培養の後、図5に示すように接種は約第30継代培養まで続けられた。又は、図8に示すように、第10継代培養の後、接種を停止した。
i)全ての継代培養物を回収するとき、最良の適応株を選択するために、これらの継代培養物を、比較メタゲノミクス、代謝特性決定、成長速度、安定性及び酸化ストレス耐性について分析する。
a)当技術分野で知られているように、通常の培地に細菌の1個のコロニーを接種する。システインは、成長培地の結腸酸化還元電位を模擬的に再現するために使用され、レサズリンを酸化還元指示薬として使用する。
b)培養物が後期対数期に達したら、培養物の一部分をSHIRMリアクターへの接種のために使用し、別の部分を分析のために保存する。
c)細菌株の一次単離及び通常の細菌株の栽培に使用されるのと同じ培地を含むSHIRMリアクター中での培養物の接種。ここで、成長培地は、Shirm Bed Culture Medium(SBCM)と呼ばれる。
I.還元剤/酸化防止剤(システイン)の濃度は減り、同等の量の対応する「酸化された対応物」(シスチン)を用いて均衡が保たれる。
II.印加電気酸化電位は、外部電圧によって、ポテンシオスタットを介し、グラファイト、グラファイトフェルト又はカーボンフェルト又は炭素繊維アノードで維持される。カソードチャンバを、プロトン交換膜によって分離されたアノードチャンバの片側のアームに接続することによって、セル回路が完成する。
III.酸素の流れは、異なる酸素拡散定数を有する可変隔膜を介して分離されたアノードチャンバの他の側のアームに酸素フィーダーを接続することによって制御される。瞬間的な酸素の流れは、例えば、ClarkのDO型プローブによって測定される(図4Aを参照)。
IV.純酸素ガス又は空気で酸素フィーダーをパージすることによって酸素の流れを維持し、ヘンリーのガス溶解性の法則に従って所望の溶存酸素濃度を達成する。次いで、溶存酸素が酸素フィーダーを通ってアノードチャンバに拡散する。
V.さらに、酸素の流れは、酸素フィーダーの床容積を変えることによって制御される。酸素フィーダーは、アノードチャンバに酸素を直接拡散させるために取り外すこともできる。
VI.アノードチャンバと酸素フィーダーとの間の隔膜は、酸素フィーダーからアノードチャンバへの酸素拡散をより良く制御するために、ムチン寒天でさらにコーティングされていてもよい。
VII.SHIRMは、SBCMを含み、酸素を含まない窒素をパージし、溶存酸素を除去する。
VIII.次いで、最初の接種に使用したSBCMをSBCM 8,0/V0.1と命名することができ、前者は、システインの濃度を指し、後者は、シスチンの濃度(mM)を指し、「V」は、Ag/AgClに対する印加電圧を示す。SHIRMバイオリアクターは、培養物が+100mVの酸化電位で静止期に達するまで動かす。
IX.最初のインキュベート後に回収された培養物を「集合P1」と命名してもよい。
d)SHIRMリアクターにおける次の接種は、システイン濃度の減少、シスチン濃度の増加及び増加した印加電圧を有するように開始される(図5及び図8を参照)。酸化防止剤が少ないほど、捕捉する酸素が少ないため、より多くの酸素が利用可能であり、細胞は、多くの酸化ストレスを経験する。酸素フィーダーは、酸素拡散の流れをさらに制御する。
e)再接種は、第6継代培養まで継続される。この段階で、酸化防止剤は3mMまで減少し、「酸化された対応物」は5mMまで増加し、一方、酸化電位は0.6V(AgAgClに対して)まで上昇する。過電圧のため、電位電圧は、AgAgClに対して0.6Vを超えて上昇しない。さらに高い電位は、電極の急速な汚れを引き起こし、さらに、例えばシトクロムa3などの微生物シトクロムは、SHEに対して約+0.385Vの還元電位を有する。
f)全ての条件を一定に保ち、第27継代培養まで(図5)又は第10継代培養(図8)まで繰り返し接種を行ったが、各継代培養では、新鮮な培地を使用した。
g)図5に示すシナリオでは、第27継代培養の後、図5に示すように接種は第30継代培養まで続けられた。又は、例えば図8に示すように、第10継代培養の後、接種を停止した。
Eh=Eo+RT/2Fln([シスチン]/[システイン]2) (a)
式中:
Eh=酸化還元電位=V
Eo=シスチン/システイン対の標準酸化還元電位=pH7.4で0.25V
R=一般的な気体定数=8.31451JK-1mol-1
F=ファラデー定数=96,485C/mol
T=絶対温度(K)。
(i)本発明の方法によって得られ、得ることができ、調製され、生産され、同定され、又は選択される、微生物又は株、又は本明細書にそれ以外で定義される本発明の微生物又は株(例えば、寄託された1つ以上の株)及び
(ii)担体、希釈剤又は賦形剤(例えば、医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤)、食料又は食品補助物質、又はさらなる治療薬剤又は栄養剤からなる群から選択される少なくとも1つの追加成分。従って、前記組成物は、医薬組成物として、又は栄養組成物として(例えば、食品として)製剤化することができる。
嫌気性微生物の酸化環境への適応
Coyチャンバで使用される厳密な嫌気性条件下(5%H2、15%CO2及び80%N2)、微生物の純粋培養技術によって、健康なボランティアの糞便からフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ株を単離し、FBT-22(DSM 32186)と命名した。(FBT-22は、2015年10月20日にDSMZでのブダペスト条約(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures、インホーフェンストリート.7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ)に基づいて寄託され、寄託番号DSM 32186が与えられている)。単離に使用される通常の培養培地は、以下のものを含有する(g/L)。酵母抽出物:2.5;カシトン:10;グルコース:4.5;塩化ナトリウム:0.9;リン酸二カリウム:0.45;リン酸二水素カリウム:0.45;硫酸アンモニウム:1.32;重炭酸ナトリウム:4g;システイン:1、レサズリン:0.001;ヘミン:0.01。ビタミンミックスは、10μgのビオチン、10μgのコバラミン、30μgのp-アミノ安息香酸、50μgの葉酸及び150μgのピリドキサミンを含む。培地中の短鎖脂肪酸(SCFA)の最終濃度は、酢酸が33mM、プロピオン酸が9mM、イソ酪酸、イソ吉草酸及び吉草酸がそれぞれ1mMであった。チューブにCO2を流しながら、全ての成分を無菌的に添加した。熱不安定性ビタミンを0.22μmのフィルターで濾過滅菌し、培地をオートクレーブにかけた後に添加し、最終濃度0.05μgチアミンml-1及び0.05μgリボフラビンml-1を得た。培地の最終pHを、1N NaOH又は1N HClを用い、7.2±0.2に調整した。培地を100kPa、121℃で15分間オートクレーブ処理した。システインは、成長培地の結腸酸化還元電位を模擬的に再現するために使用され、レサズリンを酸化還元指示薬として使用した。SHIRMバイオリアクターのための接種材料は、7mlの培地に1個のコロニーを接種することによって調製した。37℃で12時間~16時間インキュベートした後、培養物は、後期対数期(OD600約0.7)に達した。約0.5mlのマスター培養物の2本のチューブを、-80℃で、20%グリセロール中に保存し、FFRと命名した。これらのFFRストックは、FFR-M1.1及びFFR-M1.2と命名される。FFRM1.1は、解凍せずに7mlの培地に直接接種した。接種材料を37℃で12時間~16時間嫌気的にインキュベートし、培養物が後期対数期(OD600約0.7)に達したら、培養物2.5mlを250mlのSHIRMバイオリアクターに接種した。このマスター培養物の一部を(上述のように)2個ずつ保存し、FFR-M2.1及びFFR-M2.2と命名した。汚染又は不具合の場合、この実験は、対応するFRM培養物によって回収することができる。SHIRM床培地(SBCM)の組成は、FBT-22株(DSM 32186)の一次単離に使用したものと同じであるが、後にシステイン濃度が減少し、同等量のシスチンを用いて均衡が保たれる。印加電気酸化電位は、外部電圧によって、ポテンシオスタットを介し、グラファイトアノード(8.5cm×0.25cm×2.5cm)で維持された。カソードチャンバを、プロトン交換膜によって分離された片側のアームに接続することによって、セル回路が完成した。酸素の流れは、異なる酸素拡散定数を有する可変隔膜を介して分離されたアノードチャンバに酸素フィーダーを接続することによって制御された。瞬間的な酸素の流れは、ClarkのDO型プローブによって測定された。酸素の流れは、半透膜を介してアノードチャンバに拡散する純粋な酸素によって酸素フィーダーをパージすることによって制御される。膜上の酸素の拡散率(DOm)及び物質移動定数(KOm)は、それぞれ2.4x10-6cm2/s及び1.3x10-4cm/sである。さらに、酸素の流れは、酸素フィーダーの床容積を、例えば、図6に示すように250ml又は100mlに変えることによって制御された。図7に示すように、酸素フィーダーは、アノードチャンバに酸素を直接拡散させるために取り外すこともできる。隔膜の寒天ムチンコーティングは、アノードチャンバへの酸素拡散をさらに制御する。寒天ムチンは、以下の成分(g/L)を溶解させ、オートクレーブにかけることによって調製された。寒天:2;NaCl:8;KCl:0.2;Na2HPO4:1.42;KH2PO4:0.24;ムチンII型:5。培地を100kPa、121℃で15分間オートクレーブ処理した。SHIRMは、SBCMを含み、酸素を含まない窒素を15分間パージし、溶存酸素を除去した。SHIRMリアクター中の最終細胞濃度をOD600約0.005に調整した。
(例2)
酸化環境に適応した進化株の選択
(例3)
嫌気性微生物の酸化環境への適応のさらなる例
(例4)
例3からの進化株の選択
a.図8に示される全ての工程で、100μlのアリコートを集めた。
b.図9に示すように、「工程a」からのサンプルを空気飽和したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で段階的に希釈し(103まで)、周囲温度で、気密バイアル中でインキュベートした。
c.このバイアルを嫌気性チャンバに持ち込み、50μlのアリコートをYCFAG培地に接種した(表4)。
d.プレートを嫌気的に24時間~72時間インキュベートした。
e.インキュベート後、生存数を視覚的に評価した。
f.コロニーの形態に基づき、訓練後に生じた変異体を選択し、古典的な純粋培養技術によって精製した。
g.適応株を、グラム染色によって純度を調べた。
h.工程fから選択された5種類の適応株をTCS1、LTCS、STCS、OCS-1及びOCS-2と命名した。
i.それぞれの単離条件及び工程を含む、単離された適応株の完全な詳細を表2に示す。
j.適応株の予備的な同定は、グラム染色、代謝表現型検査(短鎖脂肪酸プロファイル)及びF.prausnitziiに特異的なプライマーを用いた定量PCR(qPCR)に基づいていた。
k.16SrDNA配列決定法によって、株の同定を確認した。
l.図10に示すように、適応株の酸素耐性の安定性を評価した。それぞれの適応株をYCFAG培地中で12~14時間、嫌気的に培養し、101、102、103、104及び/又は105に段階的に希釈した。100μl又は50μlの連続希釈した培養物のいずれかを、YCFAG培地プレートに2個ずつ接種した。1セットのプレートを嫌気性条件下でインキュベートしてコントロールとして使用し、一方、他のセットを好気的に20分間インキュベートする。周囲空気に20分間さらしている間に、酸素は寒天プレート内に完全に拡散し、その色がピンク色に変化する。還元状態で無色である酸化還元指示薬染料レサズリンは、酸化後にピンク色になる。これにより、培養プレート培地への完全な酸素拡散が保証される。図10に示すそれぞれの処理を行った後、試験プレートとコントロールプレートを嫌気性条件下で48時間~72時間インキュベートし、生存数を目視で評価した。
m.16SrDNA配列決定法によって株を確認した後、F.prausnitziiの適応株TCS1、OCS-1及びOCS-2を、酸素耐性に基づいて選択し、DSMZでのブダペスト条約(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures、インホーフェンストリート.7B、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ)に基づいて寄託し、それぞれ、寄託番号DSM 32380、DSM 32378及びDSM 32379が与えられている。
n.F.prausnitzii型株、親株及び適応株の酸素耐性を表3に示す。
(例6)
嫌気性微生物の生産性向上
Claims (15)
- 嫌気性微生物の適応のため、及び酸素耐性が高い嫌気性微生物の選択のための方法であって、当該方法は、段階的に増加させた印加電圧と段階的に増加させた酸素濃度による酸化ストレスの段階的な二元誘発を行い、酸化された形態の酸化防止剤の濃度を段階的に増やすことと組み合わせて酸化防止剤の濃度を段階的に減らすことにより、酸化還元状態を調整するために酸化防止剤/酸化された形態の酸化防止剤の濃度比を変化させて、前記微生物を培養する工程を含み、
培地中の溶存酸素濃度が、全てではないが一部の前記嫌気性微生物が殺される濃度である亜致死濃度に維持される、
上記方法。 - 酸化防止剤/酸化された形態の酸化防止剤が、システイン/シスチン、グルタチオン/グルタチオンの酸化状態、アスコルビン酸/デヒドロアスコルベート、ジチオトレイトール/酸化ジチオトレイトール、及び没食子酸/酸化没食子酸からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法の開始条件が、(i)0~10μMの酸素濃度、(ii)0.1Vの印加電圧、並びに(iii)腸管内酸化還元電位の-300mVに近い酸化還元電位を得るように、ネルンストの方程式(a)
式中、
Eh=酸化還元電位=V
Eo=(還元剤/酸化防止剤)/酸化された対応物の対の標準酸化還元電位
R=一般的な気体定数=8.31451JK-1mol-1
F=ファラデー定数=96.485C/mol
T=絶対温度(K)
n=関与する電子の数
に基づいて計算される酸化防止剤の濃度及び酸化された形態の酸化防止剤の濃度、
のうちの1つ以上又は全てから選択され、
該開始条件が腸管内酸化還元電位の-300mVに近い酸化還元電位となる、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記開始条件が、システイン8mM、シスチン0mM、印加電圧0.1V、及び酸素濃度0~10μM、のうちの1つ以上又は全てから選択される、請求項3に記載の方法。
- 請求項1に定義される前記段階的な変化が、最小システイン濃度3mM、最大シスチン濃度5mM、最大印加電圧0.6V、及び酸素濃度50μM~250μM、のうちの1つ以上又は全てが達成されるまで続けられる、請求項4に記載の方法。
- 印加電圧が0.6Vを超えず、及び/又はシステイン濃度が3mM以上であり、及び/又はシスチン濃度が5mM以下である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 段階的な変化が終了したら、前記方法は、段階的な変化の後に達した、印加電圧、酸素濃度及び酸化防止剤/酸化された形態の酸化防止剤の濃度比の最終的な条件下で前記微生物を培養する1つ以上のさらなる工程を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- さらなる段階的な変化が行われる工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記方法又はさらなる工程が、嫌気性微生物を新しい培地に再接種することを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再接種が、印加電圧、酸素濃度、及び酸化防止剤/酸化された形態の酸化防止剤の濃度比における段階的な変化を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記微生物が、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ(Faecalibacterium prausnitzii)である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、代謝特性を維持した最良の適応株を選択するために、適応株が酸素耐性、及び酪酸産生、及び/又は成長速度の評価についてスクリーニングされる更なる工程を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 嫌気性微生物の改善された生産のための方法であって、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法によって嫌気性微生物を適応させ、より酸素耐性が高い嫌気性微生物を選択し、及び更に、酸素適応微生物株の産生に最適化された一定の酸化電位/印加電圧、酸素の流れ、及び酸化防止剤/酸化された形態の酸化防止剤の濃度比の組み合わせで、亜致死濃度に維持された溶存酸素濃度の培養条件を含む培地中で微生物を培養し、それによって選択的な圧力が可能となり、その結果高収率で微生物株が得られる、上記方法。
- (i)前記培養条件が、3mMのシステイン、5mMのシスチン、0.6Vの印加電圧、及び0.2nmoles・ml-1min-1の酸素の流れを含み、及び/又は(ii)前記微生物が、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ(Faecalibacterium prausnitzii)である、請求項13に記載の方法。
- DSM 32380、DSM 32378及びDSM 32379からなる群から選択される、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ(Faecalibacterium prausnitzii)株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022005426A JP2022048204A (ja) | 2015-10-28 | 2022-01-18 | 適応のための方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1519087.9 | 2015-10-28 | ||
GBGB1519087.9A GB201519087D0 (en) | 2015-10-28 | 2015-10-28 | Method for adaption |
PCT/EP2016/076064 WO2017072296A1 (en) | 2015-10-28 | 2016-10-28 | Method for adaptation |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022005426A Division JP2022048204A (ja) | 2015-10-28 | 2022-01-18 | 適応のための方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018532430A JP2018532430A (ja) | 2018-11-08 |
JP2018532430A5 JP2018532430A5 (ja) | 2019-11-28 |
JP7025336B2 true JP7025336B2 (ja) | 2022-02-24 |
Family
ID=55130364
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018541518A Active JP7025336B2 (ja) | 2015-10-28 | 2016-10-28 | 適応のための方法 |
JP2022005426A Pending JP2022048204A (ja) | 2015-10-28 | 2022-01-18 | 適応のための方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022005426A Pending JP2022048204A (ja) | 2015-10-28 | 2022-01-18 | 適応のための方法 |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10876092B2 (ja) |
EP (2) | EP3237603B1 (ja) |
JP (2) | JP7025336B2 (ja) |
KR (1) | KR102229260B1 (ja) |
CN (2) | CN108291195B (ja) |
AU (1) | AU2016347607B2 (ja) |
BR (1) | BR112018008391B1 (ja) |
CA (1) | CA3002606A1 (ja) |
CL (1) | CL2018001132A1 (ja) |
CO (1) | CO2018005487A2 (ja) |
DK (1) | DK3237603T3 (ja) |
ES (1) | ES2803748T3 (ja) |
GB (1) | GB201519087D0 (ja) |
HK (1) | HK1257740A1 (ja) |
HU (1) | HUE049915T2 (ja) |
IL (1) | IL258878B (ja) |
MX (1) | MX2018005300A (ja) |
PH (1) | PH12018500908A1 (ja) |
PL (1) | PL3237603T3 (ja) |
PT (1) | PT3237603T (ja) |
SG (1) | SG11201803034PA (ja) |
UA (1) | UA125020C2 (ja) |
WO (1) | WO2017072296A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201802583B (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108048342B (zh) * | 2017-10-26 | 2021-06-04 | 中国农业大学 | 一种耐压益生菌及其食品和制备方法 |
JP7349051B2 (ja) * | 2019-07-23 | 2023-09-22 | 大成建設株式会社 | 還元剤の還元状態の持続性向上方法、持続性が向上した還元剤、この還元剤を含む培地、及び、この培地を用いる嫌気性微生物の培養方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009065940A (ja) | 2007-09-14 | 2009-04-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 微生物の培養方法及び微生物の培養装置 |
WO2009120806A2 (en) | 2008-03-25 | 2009-10-01 | Cobalt Technologies, Inc. | Expression of oxidoreductases to increase volumetric productivity |
JP2010207192A (ja) | 2009-03-12 | 2010-09-24 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | 電気培養方法及び電気培養装置 |
WO2014070014A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Rijksuniversiteit Groningen | Methods and compositions for stimulating beneficial bacteria in the gastrointestinal tract |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1997880A1 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-03 | Puleva Biotech, S.A. | Breast milk bifidobacteria, compositions thereof, their use and a novel culture media to obtain them |
FR2927634B1 (fr) * | 2008-02-15 | 2011-09-30 | Air Liquide | Procede utilise pour augmenter la biomasse et l'activite metabolique de microorganismes par la regulation combinee du potentiel d'oxydo-reduction et de l'oxygene dissous durant le processus de fermentation |
JP5628288B2 (ja) * | 2010-03-09 | 2014-11-19 | 三井化学株式会社 | 生産性の高いイソプロピルアルコール生産細菌 |
CN103502434B (zh) * | 2011-05-06 | 2016-08-17 | 有机平衡医疗股份公司 | 乳酸菌以及含有该乳酸菌的组合物 |
DE102011075656A1 (de) * | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
US9700586B2 (en) * | 2012-02-28 | 2017-07-11 | Cornell University | Probiotic compositions and methods |
US20140113340A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Masdar Institute Of Science And Technology | High salinity tolerant microalgae strains, products derived therefrom, and methods of producing the same |
JP2016511272A (ja) * | 2013-03-05 | 2016-04-14 | レイクスユニフェルシテイト フローニンゲン | 炎症を抑制するためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィーhtf−f(dsm26943)の使用 |
-
2015
- 2015-10-28 GB GBGB1519087.9A patent/GB201519087D0/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-10-28 EP EP16787891.7A patent/EP3237603B1/en active Active
- 2016-10-28 CN CN201680063331.7A patent/CN108291195B/zh active Active
- 2016-10-28 US US15/771,632 patent/US10876092B2/en active Active
- 2016-10-28 UA UAA201805790A patent/UA125020C2/uk unknown
- 2016-10-28 CA CA3002606A patent/CA3002606A1/en active Pending
- 2016-10-28 EP EP20174256.6A patent/EP3712251A3/en active Pending
- 2016-10-28 HU HUE16787891A patent/HUE049915T2/hu unknown
- 2016-10-28 KR KR1020187014503A patent/KR102229260B1/ko active IP Right Grant
- 2016-10-28 AU AU2016347607A patent/AU2016347607B2/en active Active
- 2016-10-28 ES ES16787891T patent/ES2803748T3/es active Active
- 2016-10-28 MX MX2018005300A patent/MX2018005300A/es unknown
- 2016-10-28 CN CN202210544232.8A patent/CN114891713A/zh active Pending
- 2016-10-28 DK DK16787891.7T patent/DK3237603T3/da active
- 2016-10-28 BR BR112018008391-7A patent/BR112018008391B1/pt active IP Right Grant
- 2016-10-28 PL PL16787891T patent/PL3237603T3/pl unknown
- 2016-10-28 PT PT167878917T patent/PT3237603T/pt unknown
- 2016-10-28 JP JP2018541518A patent/JP7025336B2/ja active Active
- 2016-10-28 SG SG11201803034PA patent/SG11201803034PA/en unknown
- 2016-10-28 WO PCT/EP2016/076064 patent/WO2017072296A1/en active Application Filing
-
2018
- 2018-04-18 ZA ZA2018/02583A patent/ZA201802583B/en unknown
- 2018-04-23 IL IL258878A patent/IL258878B/en active IP Right Grant
- 2018-04-27 PH PH12018500908A patent/PH12018500908A1/en unknown
- 2018-04-27 CL CL2018001132A patent/CL2018001132A1/es unknown
- 2018-05-25 CO CONC2018/0005487A patent/CO2018005487A2/es unknown
-
2019
- 2019-01-04 HK HK19100114.0A patent/HK1257740A1/zh unknown
-
2020
- 2020-11-18 US US16/951,852 patent/US11976268B2/en active Active
-
2022
- 2022-01-18 JP JP2022005426A patent/JP2022048204A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009065940A (ja) | 2007-09-14 | 2009-04-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 微生物の培養方法及び微生物の培養装置 |
WO2009120806A2 (en) | 2008-03-25 | 2009-10-01 | Cobalt Technologies, Inc. | Expression of oxidoreductases to increase volumetric productivity |
JP2010207192A (ja) | 2009-03-12 | 2010-09-24 | Central Res Inst Of Electric Power Ind | 電気培養方法及び電気培養装置 |
WO2014070014A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Rijksuniversiteit Groningen | Methods and compositions for stimulating beneficial bacteria in the gastrointestinal tract |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, Vol.52, pp.2141-2146 |
Journal of Applied Microbiology, 2014, Vol.118, pp.619-628 |
PLoS One, 2014, Vol.9, No.5, e96097, pp.1-7 |
PLoS One, 2015, Vol.10, No.2, e0117331, pp.1-21 |
The ISME Journal, 2012, Vol.6, pp.1578-1585 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kitamoto et al. | Dietary L-serine confers a competitive fitness advantage to Enterobacteriaceae in the inflamed gut | |
JP7018396B2 (ja) | 糖尿病及び腸疾患の治療又は予防における使用のためのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィ及びデスルホビブリオピゲル | |
Alteri et al. | Preferential use of central metabolism in vivo reveals a nutritional basis for polymicrobial infection | |
JP2022048204A (ja) | 適応のための方法 | |
EP2925346A1 (fr) | Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de triméthylamine dans une cavité du corps humain, notamment pour le traitement de la triméthylaminurie ou d'une vaginose bactérienne et la prévention des maladies cardiovasculaires | |
JP7096933B1 (ja) | 尿酸値低下効果を有するラクトバチルスプランタルムbfa-la4菌株及びそのラクトバチルスプランタルムbfa-la4菌株の使用 | |
CN116254190A (zh) | 一种副干酪乳杆菌亚种及其应用 | |
CN107653199B (zh) | 一株健康人肠道大肠杆菌及其应用 | |
Bailey et al. | In vivo adaptation of attenuated Salmonella typhimurium results in increased growth upon exposure to norepinephrine | |
RU2778569C2 (ru) | Способ адаптации | |
Liu et al. | AroC, a chorismate synthase, is required for the formation of Edwardsiella tarda biofilms | |
KR20020069324A (ko) | 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법 | |
JP2007097536A (ja) | ピニトール高含有納豆の製造方法及びピニトール分解活性欠損納豆菌 | |
WO2023157860A1 (ja) | 腸内細菌叢再現モデル | |
CN114681492B (zh) | 改善代谢性疾病的肠道益生菌及其应用 | |
Yoo et al. | Microbiota-derived aspartate drives pathogenic Enterobacteriaceae expansion in the inflamed gut | |
CN116059256B (zh) | 长双歧杆菌、富硒微生物在制备预防和治疗肿瘤组合物的应用 | |
RU2797466C2 (ru) | Faecalibacterium prausnitzii и desulfovibrio piger для применения при лечении или предупреждении диабета и заболеваний кишечника | |
WO2023175124A1 (en) | Drug-delivering bacteria | |
CN117264839A (zh) | 唾液联合乳杆菌mb1在制备美白和缓解痛风食品药品中的应用 | |
Gonidakis | Molecular genetics of longevity in Escherichia coli | |
CZ2018101A3 (cs) | Kmeny mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, výrobek obsahující tyto kmeny |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180620 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191017 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191017 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200626 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200701 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200930 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210205 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210430 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210513 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211021 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220118 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220128 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220210 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7025336 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |