CN108291195B - 用于适应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及细菌的生长。更具体地，本发明涉及厌氧微生物的氧化环境适应的方法及其在开发新的益生菌中的用途。具体而言，本发明提供了用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的配对物浓度比的逐步改变来培养所述微生物的步骤。还提供了新的菌株。

Description

用于适应的方法
发明领域
本发明总体涉及细菌的生长。更具体地，本发明涉及厌氧微生物的氧化环境适应的方法及其在开发新的益生菌中的用途。还提供了通过本发明的方法获得的新(经适应的)菌株。
发明背景
成人肠道微生物群由最多达100万亿个微生物(等于我们体细胞和生殖细胞总数的十倍)组成。我们的肠道微生物(微生物组)的宏基因组(collective genomes)可以含有是我们自己的基因组的150倍以上的基因，并且为我们赋予不需要凭我们自身进化得到的生理能力。然而，这些群落在很大程度上仍未被研究，几乎完全不知道它们对人类发育、生理、免疫、营养和健康的影响。微生物群落具有巨大的影响宿主生物学的能力，并且除了是维生素和激素产生等的来源之外，对于我们的免疫系统的发育、处理以其他方式不易消化的膳食多糖的能力是重要的。大肠中的微生物群落在调节肠道健康和几种疾病的发病机制中具有至关重要的作用。
传统的微生物学已经集中于将个别物种作为分离的单位进行研究。然而，许多（如果不是大部分）从未成功被分离为活样本用于分析，这据推测是因为它们的生长依赖于未经实验再现的特定微环境。DNA测序技术的进展已经创造了一个新的研究领域，称为宏基因组学，其允许全面检查微生物群落，甚至是由不可培养的生物体构成的那些。宏基因组学方法允许分析源自从自然环境中收获的完整微生物群落的遗传物质，而不是检查已在实验室中生长的个别细菌菌株的基因组。
人类肠道微生物组充当有益微生物、潜在益生菌的资源。尽管在疾病诸如炎性肠病、心血管疾病、糖尿病和自闭症谱系病症中预防和促进肠道微生物群的作用，但如几种宏基因组学研究表明，没有可用的治疗含有新型益生菌或所谓的下一代益生菌。即使成功分离，许多从肠道分离的微生物也需要严格的厌氧条件用于生长，并且当暴露于环境空气时不能存活超过几分钟。这使得开发稳定和稳健的益生菌制剂是有挑战的。因此需要更耐氧的厌氧微生物，并且本发明提供了使厌氧微生物适应的方法，以及已使用此类方法获得的新微生物菌株。
发明概述
本发明提供了用于使厌氧微生物适应氧化环境、因此实现此类生物体当暴露于环境空气时相对更耐氧的方法。这具有实现微生物的改善的培养和储存(例如，更长期储存)的进一步优点。
本文提供了模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)，其中进行经由施加电压和氧扩散来逐步双重诱导氧化应激和为了调节氧化还原状态而逐步改变抗氧化剂/氧化的对应物浓度比。
氧对于厌氧微生物是致命的，因此用于氧化应激的溶解氧(氧浓度)将增加，但保持在亚致死浓度，而使用抗氧化剂/氧化的对应物对来调节环境的氧化还原状态。还经由施加电压诱导氧化应激。氧化应激增加细菌对氧化环境的耐受性，并使得可以使微生物在环境空气中存活相对更长的时间段。
可以容易地确定适当的亚致死氧浓度(不导致杀死存在的所有细菌的浓度，或者换言之，其中一些、但不是所有细菌被杀死的浓度)，例如，使得至少一些(但通常不是所有)细菌可以存活，然后可以选择用于该方法中的下一步骤。然后使存活的细菌再次生长，例如用氧化应激的增加(例如通过增加溶解氧浓度)，使得再次至少一些(但通常不是所有)细菌可以存活并且然后可以选择用于该方法中的下一步骤。然后可以根据需要或期望多次再重复增加氧化应激的这一步骤以获得更耐氧的微生物。
本发明提供了用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括以下步骤：用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和氧化还原状态的逐步改变来培养所述微生物，其中优选地使用调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变来进行氧化还原状态的逐步改变。
本发明提供了用于使厌氧微生物适应(或训练厌氧微生物)和选择更耐氧(例如相对更耐氧)的厌氧微生物的方法，其中用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变的组合来培养所述微生物。
本发明进一步提供了用于增强产生厌氧微生物的方法，其中用恒定氧化电位/施加电压、氧扩散和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的组合来培养所述微生物，因此实现选择压力并产生高产量的某些微生物菌株。所述培养处于最佳设定(setting)，或者换言之，恒定氧化电位/施加电压、氧扩散和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的组合已经被优化用于产生厌氧微生物。
附图描述
图1显示人体肠腔的氧化还原池(pool)。尽管存在经由摄入食物和从肠粘膜扩散的氧气的持续流入的事实，但肠道的净氧化还原电位仍然为负值，约为-300mV。
图2显示由氧化应激引起的对氧敏感酶的潜在损害和恢复机制。
图3显示人类肠道中的肠道微生物群采用的主要发酵途径。
图4a
定制的3室的模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)。
图4b
SHIRM中从细菌细胞朝向电子受体的电子流的示意图。以(Eo')伏特测量的氧化还原电位(还原电位和氧化电位)。
图4c
参与从细菌细胞至电子受体的电子转移的中间体(包括氧化还原电位)的SHIRM示意图。
图5
SHIRM操作的基本工作流程。
图6
与小床体积约100ml供氧器耦合的SHIRM阳极室的代表。
图7
空气呼吸SHIRM：经由侧臂从空气进入阳极室的直接氧扩散。
图8
SHIRM操作的工作流程，10个步骤
图9
经适应的菌株的选择
图10
探索经适应的菌株的耐氧性的策略。
本发明的详述及其优选实施方案
定义
“适应”是一个动态的进化过程，例如自然选择的结果，由此生物体变得更好地能够生活在其一种或多种栖息地中。微生物的适应(或训练)过程也可以有利地在非天然/人工/体外环境中进行，诸如在本发明的方法中。
“抗氧化剂”是通过清除自由基或通过修复或除去受损分子防止形成活性氧、氮、羟基和脂质物质的试剂。抗氧化剂通常可以直接充当还原剂。
“还原剂”是在氧化还原化学反应中失去(或“供给”)电子给另一种试剂的物质、元素或化合物。由于还原剂正在失去电子，称它已被氧化。
“氧化的对应物”是引起从另一物质中除去电子的化学物质。氧化的对应物是抗氧化剂的氧化形式。
“氧化还原介体”或电子穿梭物是可以经历可逆的氧化还原反应并促进电子转移/穿梭进出细菌的化合物。
“施加电压”、“外部电压”、“氧化电位”、“施加的电氧化电位”、“施加的电极电位”、“电压”和“电位电压”可以互换使用并且是指施加至生物反应器中的室的电压。
“氧扩散”是氧分子从高浓度至低浓度的运动。
“氧流量”是每单位时间递送至室(例如，含有微生物的阳极室)中的氧气量。
肠道微生物群与膳食氧化还原活性化合物和电子供体诸如碳水化合物和蛋白质一起在维持肠道中的还原环境中发挥作用。这意味着肠道微生物群适合于处理肠腔内的溶解氧流入(图1)。高浓度的溶解氧对大量肠道微生物是致命的，并且还原环境有助于从氧化损伤中恢复(图2)。更详细地，图3显示人类肠道中的肠道微生物群采用的主要发酵途径。混合的酸发酵和气体产生平衡了厌氧生长期间的电子失衡。一些微生物将电子呼吸至细胞外电子受体，诸如硝酸盐、硫酸盐或不溶性金属络合物。此外，氧气可以充当间接电子受体，因为一些肠道微生物可以消耗少量的氧气。氧化还原活性化合物诸如没食子酸盐、芦丁、白藜芦醇、咖啡因和黄素存在于常见饮食中，可能在消化道中被氧化，也可以充当电子受体(图1)。肠道的氧化还原状态可以影响某些药物或代谢物的生物利用度。尽管存在经由摄入食物和从肠粘膜扩散的氧气的持续流入的事实，但肠道的净氧化还原电位仍然为负值，约为-300mV。这种缺氧的还原环境有利于严格厌氧微生物在肠腔中的生长。
对氧气的高度敏感性是许多肠道微生物的标志，这使得这些微生物极其难以长时间培养和储存。当分离和培养肠道微生物群的代表用于开发新的潜在益生菌时的另一个障碍是在独特的生态位和栖息地方面肠道环境的复杂性。益生菌制剂应当在环境空气中稳定数月，但由于许多肠道微生物的氧敏感性，这是一个挑战。几种肠道微生物由其他微生物交叉供给，并且还可能需要来自宿主的一些生长因子，这使得体外模拟这些条件是挑战性的。
普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)是在各种代谢疾病中具有抗炎特性的潜在益生菌的实例。其占人肠中细菌的最多达超过5％，这使其成为肠道微生物群中最丰富的细菌之一。普拉梭菌(F. prausnitzii)产生相对高量的丁酸，其在肠道生理学中发挥主要作用并且是结肠腔中的主要代谢物。丁酸还刺激细胞增殖并促进从结肠粘膜分泌粘液。普拉梭菌是极端氧气敏感的细菌，并且当暴露于环境空气时仅存活几分钟。
本发明的发明人已令人惊讶地发现用于使厌氧微生物适应氧气的新方法，并且本文公开了用于所述氧气适应、因此使得此类微生物能够变得相对更耐氧且因此稳定且稳健储存并用作益生菌菌株和用于哺乳动物中干预的益生菌制剂或组合物中的方法。该新方法将特别地允许开发和使用普拉梭菌作为具有稳健特征的益生菌菌株以耐受工业规模生产并能够适应在肠道疾病(其中氧化应激为主要标志)下的人肠道环境。
本发明提供了用于使厌氧微生物适应和选择相对更耐氧的厌氧微生物的方法，其中用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变的组合来培养所述微生物。因此，本发明的方法通常在体外进行。
氧化应激的双重诱导增加了微生物对氧化环境的耐受性，因此使得微生物能够更耐氧或相对更耐氧(例如当暴露于环境空气时)。更耐氧(或相对更耐氧)(例如当暴露于环境空气时)的微生物可以方便地指与本发明的适应方法中使用的起始菌株(或亲本菌株)的比较。
增加的耐氧性使得可能使微生物在环境空气中存活相对较长的时间段，这显然是有利的。
施加电压或施加的外部电压通常施加至阳极，例如在石墨、石墨毡或碳毡或碳纤维阳极上，经由例如恒电位器，并逐步增加。对于施加至微生物的电压，它们被方便地提供于适当的阳极室或施加电压的其他容器(例如，生物反应器)中。例如，通过将阴极室连接至阳极室，例如，经由阳极室的一个侧臂（优选地通过离子交换膜(例如阳离子选择性膜或质子交换膜)隔离），完成细胞电路(cell circuit)。施加电压可以增加(优选通过逐步增加的方式)至0.6V、更具体地相对于Ag/AgCl为0.6V的最大值。
方便地，所述方法涉及使用氧扩散，例如通过向微生物施加氧流量。氧流量(例如通过阳极室的氧流量)可以通过用纯氧气或空气吹扫供氧器来保持，以便将实现期望的溶解氧浓度(特别是与微生物接触的期望的溶解氧浓度)。溶解氧将通过供氧器扩散至阳极室，由此产生所述方法的氧扩散(或氧流量)。氧流量(或扩散)可以例如通过任何适当的方式来控制，例如通过将供氧器或其他氧气源连接至阳极室，例如阳极室的另一个侧臂，其经由例如具有不同氧扩散常数的可变隔膜(例如可变膜，诸如半透膜)隔离。另外或可替代地，可以通过改变供氧器的床体积来控制氧流量。例如100ml和250ml供氧器显示于图中(参见图6和4a)。也可以移除供氧器以允许氧气直接扩散至阳极室中，如例如图7中所示。在阳极室和供氧器(或氧气源)之间的膜(例如隔膜)可以进一步涂覆粘蛋白琼脂以允许氧气从供氧器至阳极室的更好控制的扩散。另外，培养基中存在的还原剂或抗氧化剂将清除溶解氧并因此影响氧扩散动力学并因此影响氧流量。例如，在本发明的方法中，可以使用存在于微生物培养基中的抗氧化剂(特别是抗氧化剂的量或水平)来清除氧气，且因此可以用作控制存在于微生物培养物中的氧(溶解氧)的水平或量或浓度的方式。例如，微生物培养物中的低(或较低)水平的抗氧化剂通常意味着更多的氧气可用(或存在更多的氧化应激)，而高(或较高)水平的抗氧化剂通常意味着更少的氧气(或低水平的氧气)可用(或存在较少的氧化应激)。
任何这些用于控制氧扩散或流量的方法或其组合都可以容易地用于实现微生物培养基中期望的溶解氧的量或浓度，并因此实现用于在本发明的方法中诱导氧化应激的氧扩散、氧流量或溶解氧浓度(或者溶解氧的量或水平)的逐步改变(优选地逐步增加)。
因此，在本发明的方法中，起始条件优选为低(或零)氧流量(或氧扩散或氧浓度)，并且所述方法包括氧流量(或氧扩散或氧浓度)的逐步增加，例如直至高氧流量(或氧扩散或氧浓度)。零氧流量(或氧扩散或氧浓度)是指存在于微生物培养基(例如在阳极室中)中的0摩尔氧。示例性的低氧流量(或氧扩散或氧浓度)是指存在于微生物培养基(例如在阳极室中)中约10μM的溶解氧，其例如在一小时内(每小时)扩散至微生物培养基/阳极室中。示例性的高氧流量(或氧扩散或氧浓度)是指存在于微生物培养基(例如在阳极室中)中约50μM至约250μM的溶解氧，其例如在一小时内(每小时)扩散至微生物培养基/阳极室中。
由氧流量(或氧扩散或氧浓度)生成的实际氧化应激也取决于生长培养基中抗氧化剂的存在。例如，如果你具有高抗氧化剂，则高氧流量将产生较少的氧化应激。如果你在培养基中具有非常低的抗氧化剂，则小氧流量可以生成高氧化应激。再次控制这些条件完全在技术人员的能力范围内，以实现氧化应激的逐步诱导。
为了控制溶解氧的起始浓度(例如将氧的起始浓度降低至低(或零)水平)，可以例如通过用无氧氮气吹扫来将生长培养基脱氧。
培养基中包括抗氧化剂，以保护微生物免受致死浓度的氧气影响和模拟肠道氧化还原环境。例如，抗氧化剂可以是半胱氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸、二硫苏糖醇或没食子酸。将使用抗氧化剂，例如半胱氨酸或任何其他合适的抗氧化剂，以影响或调节氧化还原电位或氧化还原状态。许多细菌需要半胱氨酸作为硫的来源。当半胱氨酸(如在本发明的一些方法中)减少时，这将导致生长培养基的总硫池下降。为了补偿该下降，添加氧化的对应物，例如胱氨酸(在半胱氨酸的情况下)。当适当时，其他氧化的对应物(例如对于上述抗氧化剂)可以是谷胱甘肽氧化的状态、脱氢抗坏血酸、氧化的二硫苏糖醇或氧化的没食子酸。另外，在培养基中也可以包括合适的氧化还原介体。
进行氧化还原状态的逐步改变，例如抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变以调节生长环境的氧化还原状态。氧化还原电位可以根据能斯特方程(a)计算。这可以用于任何合适的抗氧化剂及其氧化的对应物。
Figure 204388DEST_PATH_IMAGE001
其中：
Eh = 氧化还原电位 = V
Eo = (还原剂/抗氧化剂)/氧化的对应物对的标准氧化还原电位
R = 一般气体常数 = 8.31451 J K-1 mol-1
F = 法拉第常数 = 96,485 C/mol
T = 绝对温度 (K)
n = 涉及的电子数量。
因此，本领域技术人员可以容易地计算任何抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的氧化还原电位。通过实例的方式，针对不同浓度的半胱氨酸/胱氨酸氧化还原对计算的氧化还原电位(Eh)值呈现于表1中。
在pH 7.4，胱氨酸/半胱氨酸对的Eo = 0.25V，且n = 2。
如果使用半胱氨酸/胱氨酸作为抗氧化剂/氧化的对应物对，优选的半胱氨酸起始浓度可以基于反应式(b)计算。
Figure 59211DEST_PATH_IMAGE002
根据方程(b)，4摩尔半胱氨酸(R-SH)与1摩尔氧反应以产生2摩尔胱氨酸(R-SS-R)。
在25℃下水中的溶解氧浓度为约200 μM，且当在实验前未用氮气吹扫生长培养基时，约800μM的半胱氨酸将与200μM的氧气反应，生成400μM的胱氨酸。因此，对于具有8mM半胱氨酸的生长培养基，将观察到约-223mV的初始氧化还原电位。然而，用无氧氮气在生长培养基中完全脱氧提供约-283mV的氧化还原电位，其接近于肠腔氧化还原电位(约-300mV)。因此，在半胱氨酸/胱氨酸用作一对的情况下，半胱氨酸(或其他抗氧化剂对应物对)的优选起始浓度为8mM。这是其中半胱氨酸/胱氨酸用作一对的高浓度的抗氧化剂的一个实例，然而应理解的是，可以其他对容易地计算等量高浓度的抗氧化剂。另外，胱氨酸(或其他氧化的对应物对)的优选起始浓度为0 mM或其他低浓度以实现期望的起始氧化还原电位。还优选的是，使用的生长培养基已经完全脱氧(或者氧已经从生长培养基中完全除去)。换言之，优选的条件被选择为在开始方法时尽可能接近于-300mV的肠腔氧化还原电位。当实施该方法时，优选的是，发生抗氧化剂浓度的逐步降低，以及氧化的对应物浓度的逐步增加，以导致氧化还原电位的总体逐步增加。方便地，对于半胱氨酸/胱氨酸(或其他抗氧化剂/氧化的对应物对)，这可以是半胱氨酸浓度的1mM的逐步减少，和胱氨酸浓度的1mM的增加。然而，如果发生氧化还原状态的逐步改变，也可以使用不同的逐步增加/降低。
该推理可适用于任何合适的抗氧化剂/氧化的对应物对。当降低抗氧化剂浓度时，这用等量的相应的氧化的对应物平衡。
该方法可以方便地在合适的生物反应器中进行，并且通常涉及细菌培养物的重新接种(例如至新培养基中)的几个步骤。在本发明的一些优选实施方案中，如本文所述的逐步改变或诱导的每个步骤，例如，经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导，以及逐步改变抗氧化剂/氧化的对应物浓度比以调节氧化还原状态，例如，抗氧化剂浓度的逐步降低以及氧化的对应物浓度的逐步增加，施加电压的逐步增加以及氧流量(或氧扩散或氧气浓度)的逐步增加中的每个步骤，可以涉及重新接种。重新接种在本文中也可以称为继代培养步骤或培养步骤。
首先，可以将细菌的单菌落接种至本领域已知的适当的培养基中，并使其生长，直至培养物达到稳定期。起始条件可以是以下中的一种或多种或全部：低氧流量(或氧扩散或氧浓度)，优选零氧流量(或氧扩散或氧浓度)，低施加电压，优选0.1V，更具体0.1V vs Ag/AgCl，高浓度的抗氧化剂(参见上面的能斯特方程计算)，低浓度或零浓度的氧化的对应物(参见上面的能斯特方程计算)。对于以下重新接种，可以进行抗氧化剂浓度的逐步降低，氧化的对应物的增加，施加电压的增加，和氧流量(或氧扩散或氧浓度)的增加。
当微生物的生长显著降低时，可以在达到的优化(或最终)条件下将条件保持恒定(这可以分别用3mM半胱氨酸、5mM半胱氨酸、0.6 V vs Ag/AgCl和0.2nmolml-1min-1例举(参见图5和8))，以使菌株适应。换言之，一旦逐步改变导致微生物的生长显著降低，则停止这些逐步改变，并使用对应于在逐步改变的结束时达到的那些条件的恒定条件(或优化或最终条件)培养微生物一个或多个步骤。这些恒定的步骤使菌株适应。在恒定条件下重复接种之后，一旦菌株已适应，在一些实施方案中，可以用以下中的一种或多种(或优选全部)继续接种：抗氧化剂浓度的进一步逐步降低，氧化的对应物的增加，施加电压的增加，和氧流量(或氧扩散或氧浓度)的增加(参见图5)。
可以立即分析从该方法的每个步骤获得的所有继代培养物以选择最适应的菌株，或者可以在回收后直接分析继代培养物以确定接种是否应该继续。如果继代培养物尚未适应，则继续接种是适当的，否则，如果菌株已适应，则可以选择该菌株并且可以停止该方法(参见例如图8)。例如，可以分析获得的继代培养物的耐氧性，并且如果它们显示出期望水平的耐氧性，例如，与相关对照菌株(例如起始或亲本菌株)相比增加(优选显著增加)水平的耐氧性或当暴露于氧(例如在环境空气中)时足够水平的稳定性(例如储存时间)，则菌株已适应并可以选择。可以通过评价需氧条件下微生物的生长(例如暴露于环境空气)获得耐氧性的方便测量。例如，当菌株暴露于氧气时，可以进行菌落形成单位(CFU)数量的测量，例如，以CFU/ml的量度形式。当暴露于氧(例如环境空气)时，示例性的经适应的(耐氧)菌株将具有至少1x102或1x103 CFU/ml，优选至少1x104或1x105 CFU/ml。实施例中描述了适当的方法(参见例如表3)。如果菌株尚未适应，则可以继续接种。
因此，在本发明的优选实施方案中，起始条件选自以下中的一种或多种或全部：8mM半胱氨酸(或等同浓度的替代抗氧化剂)、0mM胱氨酸(或替代的氧化的对应物)、施加电压为0.1 V、和零或低氧流量。在此类实施方案中，可以持续逐步改变，直至以下中的一种或多种或全部：3mM的最小半胱氨酸浓度(或等同浓度的替代抗氧化剂)，5mM的最大胱氨酸浓度(或等同浓度的替代氧化的对应物)，最大施加电压为0.6V，以及高氧流量。
因此，在本发明的优选方法中，施加电压不超过0.6V，和/或半胱氨酸浓度不低于3mM，和/或胱氨酸浓度不高于5mM，和/或培养基中的溶解氧浓度维持在亚致死浓度。
从上面的讨论中可以清楚地看出，在本发明的一些实施方案中，一旦已完成逐步改变，该方法包括在逐步改变后所达到的施加电压、氧扩散(氧流量或氧浓度)和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的最终(优化或恒定)条件下培养(继代培养)所述微生物的一个或多个进一步的步骤(参见例如图8)。
在其他实施方案中，该方法进一步包括其中进行进一步逐步改变的后续步骤(参见例如图5)。
本领域技术人员可以通过监测微生物的行为或筛选微生物(例如，如本文别处所述)(同时它们正在经历适应)确定待进行的逐步改变的步骤的数量确定。例如，本方法的优选实施方案可以涉及最多达5或6个逐步改变的步骤，例如，3、4、5或6个逐步改变的步骤，或至少5个逐步改变的步骤，例如，最多达10个逐步改变的步骤，例如7、8、9或10个步骤。
本领域技术人员可以通过监测微生物的行为或筛选微生物(例如，如本文别处所述)(同时它们正在经历适应)确定步骤、例如培养步骤(包括逐步改变的步骤和在恒定或优化条件下进行的步骤)的总数确定以实现厌氧微生物的适应和更耐氧的厌氧微生物的选择。例如，本方法的优选实施方案可以涉及最多达6、7、8、9、10或12个步骤，或最多达15、20、25、30或35个步骤。
在涉及在恒定或优化条件下进行的培养步骤的方法中，本领域技术人员可以通过监测微生物的行为或筛选微生物(例如，如本文别处所述)(同时它们正在经历适应)确定待进行的步骤、例如培养步骤的数量确定。例如，本方法的优选实施方案可以涉及在恒定或优化条件下进行的最多达3、4、5、6、7、8、9、10或12个步骤，或最多达15、20、25、30或35个步骤。
在一些实施方案中，厌氧微生物的适应和更耐氧的厌氧微生物的选择可以在恒定或优化条件下进行的这些步骤结束时(或者甚至有时在逐步改变的步骤结束时)实现。因此，本领域技术人员可以容易地确定待进行的此类步骤的数量，例如，通过监测何时发生显著的或充分的或最大适应(耐氧性)。
该方法也可以用于生产经适应和选择的菌株(例如用于生产或生长通过该方法选择的微生物)。在此类方法中，培养条件在最佳设定下保持恒定，例如，如使用本发明的上述方法建立的优化(或恒定)条件，例如，3mM抗氧化剂，5mM氧化的对应物，0.6 V和0.2nmolml- 1min-1。这导致选择的细菌菌株的高产量。
该方法在称为'模拟的人肠道氧化还原模型'(SHIRM)的生物反应器中方便地进行，图4a、b和c。在SHIRM中，经由外部电压(施加电压)和氧扩散(氧流量)施加双重氧化应激，并且系统的氧化还原电位/氧化还原状态由抗氧化剂/氧化的对应物对控制。由于氧对培养的生物体是致死的，所以溶解氧将增加但维持在亚致死浓度，而抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变用于调节环境的氧化还原状态(参见例如图5或图8，其显示示例性半胱氨酸/胱氨酸浓度，其可以容易地适应其他抗氧化剂/氧化的对应物对)。经由施加电压和氧扩散的氧化应激增加了细菌对氧化环境的耐受性，并且针对新氧化条件细胞被重复攻击(例如图5或图8)。筛选经适应或进化的菌株的耐氧性。还可以筛选菌株的代谢特征，诸如脂肪酸概况(例如在生产丁酸的细菌诸如普拉梭菌的情况下的丁酸生产)和生长动力学的评价，以便选择最适应的菌株。因此，经适应或进化的菌株适应于更好地耐受(例如与相关的起始或亲本微生物相比)含氧环境或更好地耐受应激条件，诸如暴露于环境空气(氧化应激)或例如胆汁盐。因此，在例如菌株为普拉梭菌的情况下，选择这样的菌株，其中代谢特征诸如丁酸生产或其他脂肪酸生产得到维持或改善，但该菌株显示改善的耐氧性(例如与相关的起始或亲本普拉梭菌菌株相比)。
在一个优选实施方案中，本发明提供了用于使厌氧微生物适应和选择相对更耐氧的厌氧微生物的方法，其中用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变的组合来培养所述微生物。
在又另一个优选实施方案中，厌氧微生物的氧适应的方法使用称为模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)的生物反应器进行，并且包括但不限于以下步骤：
a) 在培养基(如本领域已知)(包括合适的氧化还原介体和还原剂)中接种细菌的单菌落，以保护细菌细胞免受致死浓度的氧气影响并模拟肠道氧化还原环境。
b) 当培养物达到后指数期时，一部分培养物可用于分析，且另一部分可用于可能重新接种至SHIRM反应器中。
c) 在含有与初次分离和常规培养细菌菌株所用的相同的培养基的SHIRM反应器中接种培养物。现在称为Shirm床培养基(SBCM)的生长培养基
I. 还原剂/抗氧化剂浓度(例如但不限于半胱氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸、二硫苏糖醇和没食子酸)降低并用等量的相应“氧化的对应物”(例如但不限于胱氨酸、谷胱甘肽-氧化态、脱氢抗坏血酸、氧化的二硫苏糖醇和氧化的没食子酸)平衡。
II. 施加的电氧化电位(例如，经由恒电位器在石墨、石墨毡或碳毡或碳纤维阳极上)经由外部电压维持。例如通过将阴极室连接至通过质子交换膜隔离的阳极室的一个侧臂来完成细胞电路。
III. 通过将供氧器连接至经由具有不同氧扩散常数的可变隔膜隔离的阳极室的另一侧臂来控制氧流量。瞬时氧流量例如通过Clark's型DO探头来测量，参见图4A。
IV. 通过用纯氧气或空气吹扫供氧器来维持氧流量，并且遵循气体溶解度的亨利定律来实现期望的溶解氧浓度。然后溶解氧通过供氧器扩散至阳极室。
V. 另外，通过改变供氧器的床体积来控制氧流量。也可以移除供氧器以允许氧气直接扩散至阳极室中。
VI. 在阳极室和供氧器之间的隔膜可以进一步涂覆粘蛋白琼脂以允许氧气从供氧器至阳极室的更好控制的扩散。
VII. SHIRM含有Shirm床培养基(SBCM)，其用无氧氮气吹扫以除去溶解氧。
VIII. 运行SHIRM生物反应器，直至培养物达到静止期。
d) 第一继代培养物的一部分用于在SHIRM反应器中接种。
e) 开始SHIRM反应器中的重新接种，其具有逐步降低的抗氧化剂浓度、增加的氧化的对应物浓度和增加的施加电压(最大0.6V)。较少的抗氧化剂将清除较少的氧气，因此将获得更多的氧气并且细胞经历更多的氧化应激。供氧器进一步调节氧扩散流量。
重复该步骤，直至生长降低。
f) 保持所有条件恒定，重复重新接种并分析新的继代培养物的比较代谢表征、生长动力学、稳定性和耐受性。如果分析令人满意，则选择该继代培养物，如果不是，则重复步骤f)。
在此类方法中，可以在随后的重新接种之前分析每种继代培养物(或每个步骤之后分析)，并且当菌株已合适地适应氧气时停止该方法。然后选择该菌株。在此类方法中，可以在停止该方法之前分析最多达约30种继代培养物，或最多达约10种继代培养物(或如本文别处所述的其他数量的继代培养物)。
适当时，可以在本文所述的本发明的任何方法中使用上述步骤中的一个或多个。
在另一个优选实施方案中，回收约30种继代培养物(参见例如图5)或回收约10种继代培养物(参见例如图8)或回收其他数量的继代培养物(如本文别处所述)，且然后分析全部以便找到最佳的合适菌株。以这种方式，没有必要在每个步骤之后分析继代培养物，而是可以一次进行所有分析，例如，以评价哪种继代培养物最适应或耐受氧气。厌氧微生物的氧气适应的方法使用称为模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)的生物反应器进行，并且包括但不限于以下步骤：
a) 在如本领域已知的常规培养基(包括合适的氧化还原介体和还原剂)中接种细菌的单菌落，以保护细菌细胞免受致死浓度的氧气影响并模拟肠道氧化还原环境。
b) 当培养物达到后指数期时，一部分培养物用于接种至SHIRM反应器中，而另一部分保存用于分析。
c) 在含有与初次分离和常规培养细菌菌株所用的相同的培养基的SHIRM反应器中接种培养物。现在称为Shirm床培养基(SBCM)的生长培养基
I. 还原剂/抗氧化剂浓度(例如但不限于半胱氨酸、谷胱甘肽、抗坏血酸、二硫苏糖醇和没食子酸)降低并用等量的相应“氧化的对应物”(例如但不限于胱氨酸、谷胱甘肽-氧化态、脱氢抗坏血酸、氧化的二硫苏糖醇和氧化的没食子酸)平衡。
II. 施加的电氧化电位经由恒电位器在石墨、石墨毡或碳毡或碳纤维阳极上经由外部电压维持。通过将阴极室连接至通过质子交换膜隔开的阳极室的一个侧臂来完成细胞电路。
III. 通过将供氧器连接至经由具有不同氧扩散常数的可变隔膜隔离的阳极室的另一侧臂来控制氧流量。瞬时氧流量例如通过Clark's型DO探头来测量，参见图4A。
IV. 通过用纯氧气或空气吹扫供氧器来维持氧流量，并且遵循气体溶解度的亨利定律来实现期望的溶解氧浓度。然后溶解氧通过供氧器扩散至阳极室。
V. 另外，通过改变供氧器的床体积来控制氧流量。也可以移除供氧器以允许氧气直接扩散至阳极室中。
VI. 在阳极室和供氧器之间的隔膜可以进一步涂覆粘蛋白琼脂以允许氧气从供氧器至阳极室的更好控制的扩散。
VII. SHIRM含有SBCM，其用无氧氮气吹扫以除去溶解氧。
VIII. 然后用于首次接种的SBCM可以被命名为SBCM X,Y/ VZ，其中X是指抗氧化剂浓度(mM)，且Y是指氧化的对应物浓度(mM)，且‘VZ’指示施加电压vs Ag/AgCl (V)。运行SHIRM生物反应器，直至培养物达到静止期。
IX. 在第一次孵育之后回收的培养物可以命名为“群体P1”。
d) 开始SHIRM反应器中的下一次接种，其具有降低的抗氧化剂浓度、增加的氧化的对应物浓度和增加的施加电压。较少的抗氧化剂将清除较少的氧气，因此将获得更多的氧气并且细胞经历更多的氧化应激。供氧器进一步调节氧扩散流量。
e) 继续重新接种，直至约第6次继代培养，参见例如图5和8(当抗氧化剂/氧化还原介体、氧流量和电压的组合效应显著影响(降低)生长时)。
f) 因为过电位，施加电压将一般不会增加超过0.6V vs AgAgCl。较高的电位可以引起电极的快速结垢，并且另外微生物细胞色素、例如细胞色素a3的致死氧化具有约+0.385V vs SHE的还原电位。
g) 保持所有条件恒定，进行重复接种，直至约第27次继代培养(参见例如图5)或直至约第10次继代培养(参见例如图8)，更准确地，足够数量的继代培养(以增加适应的可能性)，直至菌株已适应该条件，而在每次继代培养时使用新鲜培养基。
h) 在第27次继代培养后，继续接种，直至约第30次继代培养，如图5中所示。或者，在第10次继代培养后，停止接种，如图8中所示。
i) 当回收所有继代培养物后，分析它们的比较宏基因组学、代谢表征、生长动力学、稳定性和氧化应激耐受性，以便选择最佳的经适应的菌株。
适当时，可以在本文所述的本发明的任何方法中使用上述步骤中的一个或多个。
在又另一个实施方案中，厌氧微生物的氧适应的方法使用称为模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)的生物反应器进行，并且包括但不限于以下步骤：
a) 在常规培养基中接种细菌的单菌落，如本领域已知。采用半胱氨酸以模拟生长培养基的结肠氧化还原电位和刃天青作为使用的氧化还原指示剂。
b) 当培养物达到后指数期时，一部分培养物用于接种至SHIRM反应器中，而另一部分保存用于分析。
c) 在含有与初次分离和常规培养细菌菌株所用的相同的培养基的SHIRM反应器中接种培养物。现在称为Shirm床培养基(SBCM)的生长培养基
I. 还原剂/抗氧化剂浓度（半胱氨酸）减少并用等量的相应的“氧化的对应物”胱氨酸平衡。
II. 施加的电氧化电位经由恒电位器在石墨、石墨毡或碳毡或碳纤维阳极上经由外部电压维持。通过将阴极室连接至通过质子交换膜隔开的阳极室的一个侧臂来完成细胞电路。
III. 通过将供氧器连接至经由具有不同氧扩散常数的可变隔膜隔离的阳极室的另一侧臂来控制氧流量。瞬时氧流量例如通过Clark's型DO探头来测量，参见图4A。
IV. 通过用纯氧气或空气吹扫供氧器来维持氧流量，并且遵循气体溶解度的亨利定律来实现期望的溶解氧浓度。然后溶解氧通过供氧器扩散至阳极室。
V. 另外，通过改变供氧器的床体积来控制氧流量。也可以移除供氧器以允许氧气直接扩散至阳极室中。
VI. 在阳极室和供氧器之间的隔膜可以进一步涂覆粘蛋白琼脂以允许氧气从供氧器至阳极室的更好控制的扩散。
VII. SHIRM含有SBCM，其用无氧氮气吹扫以除去溶解氧。
VIII. 然后用于首次接种的SBCM可以被命名为SBCM 8,0/ V0.1，前者指示以mM表示的半胱氨酸浓度，而后者指示以mM表示的胱氨酸浓度，且‘V’指示施加电压vs Ag/AgCl。运行SHIRM生物反应器，直至培养物在+100mV的氧化电位下达到稳定期。
IX. 在第一次孵育之后回收的培养物可以命名为“群体P1”。
d) 开始SHIRM反应器中的下一次接种，其具有降低的半胱氨酸浓度、增加的胱氨酸浓度和增加的施加电压，参见图5和图8。较少的抗氧化剂将清除较少的氧气，因此将获得更多的氧气并且细胞经历更多的氧化应激。供氧器进一步调节氧扩散流量。
e) 继续重新接种，直至第6次继代培养。在该阶段，抗氧化剂降低至3mM，且“氧化的对应物”增加至5mM，而氧化电位升高至0.6V (vs AgAgCl)。因为过电位，电位电压将不会增加超过0.6V vs AgAgCl。较高的电位可以引起电极的快速结垢，并且另外微生物细胞色素、例如细胞色素a3具有约+0.385V vs SHE的还原电位。
f) 保持所有条件恒定，进行重复接种，直至第27次继代培养(图5)或第10次继代培养(图8)，而在每次继代培养时使用新鲜培养基。
g) 在如图5中所示的情形中，在第27次继代培养后，继续接种，直至第30次继代培养，如图5中所示。或者，例如如图8中所示，在第10次继代培养后，停止接种。
适当时，可以在本文所述的本发明的任何方法中使用上述步骤中的一个或多个。
根据能斯特方程，逐步改变抗氧化剂/氧化的对应物浓度比来调节氧化还原状态。以下是半胱氨酸/胱氨酸氧化还原对的一个实例：
Eh = Eo + RT/2Fln([胱氨酸] / [Cys]2) (a)
其中：
Eh = 氧化还原电位 = V
Eo = 在pH 7.4下的 胱氨酸/半胱氨酸对的标准氧化还原电位 = 0.25V
R = 一般气体常数 = 8.31451 J K-1 mol-1
F = 法拉第常数 = 96,485 C/mol
T = 绝对温度(K)。
针对不同浓度的半胱氨酸/胱氨酸氧化还原对计算的氧化还原电位(Eh)值呈现于表1中。
Figure 25899DEST_PATH_IMAGE003
表 1。
Figure 421108DEST_PATH_IMAGE004
根据方程(b)，4摩尔半胱氨酸(R-SH)与1摩尔氧反应以产生2摩尔胱氨酸(R-SS-R)。
在25℃下水中的溶解氧浓度为约200 μM，且当在实验前未用氮气吹扫生长培养基时，约800μM的半胱氨酸将与200μM的氧气反应，生成400μM的胱氨酸。因此，对于具有8mM半胱氨酸的生长培养基，将观察到约-223mV的初始氧化还原电位。然而，用无氧氮气在生长培养基中完全脱氧提供约-283mV的氧化还原电位，其接近于肠腔氧化还原电位(约-300mV)。
本发明进一步提供了通过本发明的方法制备的经适应的微生物的实例。
因此，本发明的又进一步的方面提供了通过本发明的方法获得、可获得、制备、产生、鉴定或选择的微生物(经适应的微生物)，例如，微生物菌株。此类菌株可以是益生菌微生物或细菌菌株。如本文所用的“益生菌”是指在消耗时提供健康益处的微生物。例如，联合国粮食和农业组织(The Food and Agricultural Organization of the UnitedNations)将益生菌定义为“当以适量施用时赋予对宿主的健康益处的活微生物”。此类微生物或菌株可以是分离的菌株或纯培养物，并且不会对应于天然存在的微生物或菌株，因为它们已经经历了本发明的适应方法。优选的微生物或菌株是普拉梭菌。
通过本发明的适应方法获得的经适应的菌株等的实例是本文表示为TCS1、OCS-1和OCS-2的普拉梭菌菌株。这些菌株已于2016年10月12日根据布达佩斯条约保藏于DSMZ(Leibniz Institute DSMZ – 德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)，Inhoffenstr.7B, D-38124 Braunschweig，德国)，并且已分别给予登记号DSM 32380、DSM 32378和DSM 32379。
通过本发明的方法获得的微生物或菌株等(例如一种或多种保藏菌株)可以采用化合物(试剂)或组合物(例如，药物化合物或组合物或营养化合物或组合物)的形式。
本发明因此还提供了组合物或制剂，其包含：
(i) 通过本发明的方法获得、可获得、制备、产生、鉴定或选择的微生物或菌株，或本文另外定义的本发明的微生物或菌株(例如一种或多种保藏的菌株)；和
(ii) 至少一种选自载体、稀释剂或赋形剂(例如药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)、食物或食品补充剂或另外的治疗剂或营养剂的额外组分。因此，所述组合物可以配制成药物组合物或营养组合物，例如，作为食品。
还提供了如本文定义的本发明的微生物、菌株、组合物和制剂(例如一种或多种保藏的菌株)的治疗用途。
根据疾病部位选择微生物、菌株、组合物、制剂等的适当的施用和配制模式。优选的施用模式是口服或直肠的，然而，同样地，静脉内或肌肉内注射可以是适当的。
技术人员可以容易地根据待治疗的病症、施用模式和涉及的制剂选择或确定如本文定义的本发明的微生物、菌株、组合物和制剂的适当剂量。例如，选择剂量和施用方案，使得施用于主体的本发明的微生物、菌株、组合物或制剂可以导致治疗或健康益处。例如，可以使用104至1012，例如105至1010，或106至108，或108至1010总CFU的细菌的每日剂量的微生物。
因此，提供了含有通过本发明的方法获得的或以本文其他方式定义的更耐氧的厌氧微生物等的产品或组合物或制剂或试剂盒。有利地，此类产品具有增加的储存期限或增加的长期储存。
优选的产品或组合物包含冷冻的、冷冻干燥的、冻干的或干燥的细菌(也参见实施例)并且优选呈单位剂量形式，例如胶囊或片剂或凝胶。用于此类产品的适当剂量(例如，呈细菌或CFU的数量的形式)等在本文别处和实施例中描述。在此类产品中也可以包括其他组分等，例如防腐剂(例如甘油)、稳定剂、胶凝剂和/或冷冻保护剂。在一些实施方案中，此类额外组分是非天然试剂。
在本文中提及浓度、水平或生长减少(或降低)的情况下，则优选地，当与适当的对照水平或值比较时，此类减少或降低(以及甚至如本文别处提及的其他减少或降低或负面影响)是可测量的减少，更优选它们是显著的减少，优选统计学显著的减少，例如概率值≤0.05。
在本文中提及浓度、水平、电压、耐受性或生长等增加(或升高)(例如，氧化应激、氧流量(或扩散或浓度)或耐氧性的逐步增加或增加)的情况下，则优选地，当与适当的对照水平或值比较时，此类增加(以及甚至如本文别处提到的其他增加或积极影响)是可测量的增加，更优选它们是显著的增加，优选统计学显著的增加，例如概率值≤0.05。
事实上，在本文描述显著改变的情况下，优选的是，当与适当的对照水平或值相比时，此类改变是统计学显著的改变，例如概率值≤0.05。
以下是本发明的一些实施例，其不意味着限制本文发明的使用，而是详细显示可以如何使用本发明的实施例。
实施例
实施例1
使厌氧微生物适应氧化的环境
在Coy室中采用的严格厌氧条件(5% H2、15%CO2和80% N2)下通过微生物纯培养技术从健康志愿者的粪便中分离普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)菌株并命名为FBT-22 (DSM 32186)。(FBT-22已于2015年10月20日根据布达佩斯条约保藏于DSMZ(Leibniz Institute DSMZ – 德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)，Inhoffenstr.7B, D-38124 Braunschweig，德国)，并且已给予登记号DSM 32186)。用于分离的常规培养基含有以下(g/L)；酵母提取物：2.5；酪胨：10；葡萄糖：4.5；氯化钠：0.9；磷酸氢二钾：0.45；磷酸二氢钾：0.45；硫酸铵：1.32；碳酸氢钠：4g；半胱氨酸：1. 刃天青：0.001；氯高铁血红素：0.01. 维生素混合物含有：10 µg生物素，10 µg钴胺素，30 µg对氨基苯甲酸，50 µg叶酸和150 µg吡哆胺。培养基中的短链脂肪酸(SCFA)的最终浓度为33 mM乙酸、9 mM丙酸以及异丁酸、异戊酸和戊酸各1 mM。所有组分均无菌添加，而管用CO2冲洗。将热不稳定的维生素用0.22 μm过滤器过滤除菌并在将培养基高压灭菌后添加以得到0.05 µg硫胺素ml-1和0.05 µg核黄素ml-1的最终浓度。培养基的最终pH用1N NaOH或1N HCl调节至7.2± 0.2。将培养基在100 kPa和121℃下高压灭菌15分钟。采用半胱氨酸以模拟生长培养基的结肠氧化还原电位和刃天青作为氧化还原指示剂。通过在7 ml培养基中接种单菌落来制备SHIRM生物反应器的接种物。在37℃下孵育12h-16h之后，培养物达到后指数期(OD600 ~0.7)。将约0.5 ml主培养物的两个管在-80℃下保存在20％甘油中，并命名为FFR。这些FFR储备物被命名为FFR-M1.1和FFR-M1.2。将FFRM1.1在不解冻的情况下直接接种至7ml培养基中。当培养物达到后指数期(OD600 ~0.7)时，将接种物在37℃孵育下厌氧孵育12h-16h，将2.5ml培养物接种于250ml SHIRM生物反应器中。将一定比例的该主培养物一式两份保存(如前所述)，并命名为FFR-M2.1和FFR-M2.2。在任何污染或事故的情况下，实验可以经由相应的FFRM培养物来挽救。然而，SHIRM床培养基(SBCM)的组成与用于初次分离菌株FBT-22 (DSM 32186)的相同；随后，半胱氨酸浓度降低并用等量的胱氨酸平衡。施加的电氧化电位经由恒电位器经由石墨阳极(8.5cm X 0.25cm X2.5cm)上的外部电压维持。通过将阴极室连接至通过质子交换膜隔离的一侧臂完成细胞电路。通过将供氧器连接至经由具有不同氧扩散常数的可变隔膜分离的阳极室来控制氧流量。瞬时氧流量通过Clark's型DO探头测量。氧流量通过经由纯氧吹扫供氧器来控制，所述纯氧经由半透膜扩散至阳极室中。氧气在膜上的扩散率(DOm)和质量传递常数(KOm)分别为2.4x10-6 cm2/s和1.3x10-4cm/s。此外，通过改变供氧器的床体积(例如250ml或100ml)来控制氧流量，如图6中所示。也可以移除供氧器以允许氧气直接扩散至阳极室中，如图7中所示。隔膜的琼脂粘蛋白涂层进一步控制氧扩散至阳极室。琼脂粘蛋白通过将以下组分(g/L)溶解和高压灭菌来制备：琼脂：2；NaCl：8；KCl：0.2；Na2HPO4：1.42；KH2PO4：0.24；粘蛋白II型：5。将培养基在100 kPa和121℃下高压灭菌15分钟。SHIRM含有SBCM，其用无氧氮气吹扫15分钟以除去溶解氧。将SHIRM反应器中的最终细胞浓度调整为约OD600 ~0.005。
然后将用于用FFR-M2.1首次接种的SBCM命名为SBCM 8,0/ V0.1，其中前一数字(“8”)指示半胱氨酸浓度(mM)，且后一数字(“0”)指示胱氨酸浓度(mM)，且‘V’指示相对于Ag/AgCl的施加电压。每次实验将以零氧气流量开始，且氧气以预定的恒定速率从供氧器扩散。SHIRM生物反应器在37℃下运行24小时，直至培养物在+100mV的氧化电位下达到稳定期。
首次接种后回收的培养物被命名为“群体P1”，其为约5代龄。来自该批次的冷冻储备物被称为FFR-P1.1和FFR-P1.2。将2.5ml FFR-P1.1接种于具有SBCM 7,1/V0.2的新的SHIRM反应器中。继续重新接种，直至在每次中间继代培养时储存产生FFR-P6和相应的FFR-P的第6次继代培养物。在该阶段，半胱氨酸浓度降低至3mM，且胱氨酸增加至5mM，而氧化电位相对于AgAgCl升高至600mV。在该阶段，进行重复接种，直至第27次继代培养保持所有条件恒定，而在每次继代培养时，使用新鲜培养基。在第27次继代培养后，继续接种，直至第30次继代培养，如图5中所示。
实施例2
适应氧化环境的进化菌株的选择
分析来自实施例1的各种FFR-P以选择适应氧化环境和氧气的菌株，其可用于进一步生产。
该分析基于比较宏基因组学、代谢表征、生长动力学、稳定性和耐受性。
经由脂肪酸概况分析(更准确地，在各种益生元诸如菊粉和抗性淀粉上生产丁酸)进行比较代谢表征。
在具有或不具有胆汁盐和益生元的正常培养基中进行比较生长动力学，包括生物量产率和生长速率。
在存在具有或不具有酶的模拟胃液/模拟肠液和暴露于环境空气30分钟的情况下进行比较稳定性和耐受性。
根据美国药典(USP)指南，通过将2.0 g氯化钠和3.2 g纯化的胃蛋白酶(源自猪胃粘膜，具有800至2500单位/mg蛋白的活性)溶解于7.0 mL盐酸和水中直至1000 mL来制备模拟的胃液测试溶液(TS)。该测试溶液具有约1.2的pH。
通过将6.8 g磷酸二氢钾溶解于250 mL水中且然后添加77 mL 0.2N氢氧化钠和500 mL水来制备模拟的肠液测试溶液(TS) USP。添加10.0 g胰酶制剂，并将所得溶液用0.2N氢氧化钠或0.2 N盐酸调节至6.8 ± 0.1的pH，且最后稀释至1000 mL。
使用5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸的微生物燃料电池和黄素依赖性还原来评价细胞的FFR-M和FFR-P群体中的细胞色素表达，同时通过硝基蓝四唑鎓盐来测试心肌黄酶活性。
选择最佳的经适应的菌株。
实施例3
使厌氧微生物适应氧化的环境的进一步实例
遵循实施例1的所有步骤，直至首次接种后回收的培养物被命名为“群体P1”（其为约5代龄）的步骤。来自该批次的冷冻储备物被称为FFR-P1.1和FFR-P1.2。将2.5ml FFR-P1.1接种于具有SBCM 7,1/V0.2的新的SHIRM反应器中。继续重新接种，直至在每次中间继代培养时储存产生FFR-P6和相应的FFR-P的第6次继代培养物。在该阶段，半胱氨酸浓度降低至3mM，且胱氨酸增加至5mM，而氧化电位相对于AgAgCl升高至600mV。
但在本实施例3中，与实施例1相比，进行重复接种的这一阶段，直至总共第10次继代培养，保持所有条件恒定，而在每次继代培养时，使用新鲜培养基，如图8中所示。
实施例4
来自实施例3的进化菌株的选择
分析来自实施例3的各种FFR-P以选择适应氧化环境和氧气的菌株，其可用于进一步生产。
适应的菌株选择基于以下步骤：
a. 在图8中所示的每个步骤中，收集100 μl的等分试样。
b. 将来自‘步骤a’的样品在空气饱和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中系列稀释(直至103)，如图9中所示，并在环境温度下在气密小瓶中孵育。
c. 将小瓶带到厌氧室中，并将50 μl等分试样接种在YCFAG培养基(表4)上。
d. 将板厌氧孵育24-72小时
e. 在孵育之后，目视评价活计数。
f. 基于菌落形态类型，经由经典纯培养技术选择和纯化训练后出现的任何变体
g. 经由革兰氏染色检查经适应的菌株的纯度
h. 选自步骤-f的5种经适应的菌株被命名为TCS1、LTCS、STCS、OCS-1和OCS-2。
i. 表2中呈现分离的经适应的菌株的完整细节，包括各自的分离条件和步骤。
j. 经适应的菌株的初步鉴定基于革兰氏染色、代谢表型分析(短链脂肪酸概况)和使用普拉梭菌(F. prausnitzii)特异性引物的定量PCR(qPCR)。
k. 经由16SrDNA测序证实菌株鉴定。
l. 评价经适应的菌株的耐氧稳定性，如图10中所示。将各自适应的菌株在YCFAG培养基中厌氧培养12h-4h并以101、102、103、104和/或105系列稀释。将100μl或50μl系列稀释的培养物一式两份接种在YCFAG培养基板上。将一组板在厌氧条件下孵育并充当对照，而另一组有氧孵育20分钟。在暴露于环境空气20分钟期间，氧气完全扩散至琼脂平板上，将其颜色变成粉红色。在还原状态下是无色的氧化还原指示剂染料刃天青在氧化后变成粉红色。这确保氧气完全扩散至培养板培养基中。在如图10中所示暴露于相应处理之后，将测试板和对照板在厌氧条件下孵育48小时-72小时，并视觉评价活计数。
m. 在经由16SrDNA测序证实菌株之后，普拉梭菌的经适应的菌株TCS1、OCS-1和OCS-2基于其耐氧性得到选择，并且已根据布达佩斯条约保藏于DSMZ (Leibniz InstituteDSMZ - 德国微生物和细胞培养物保藏中心，Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig，德国)，并且已分别给予登记号DSM 32380、DSM 32378和DSM 32379。
n. 表3中描述普拉梭菌型菌株、亲本菌株和经适应的菌株的耐氧性。
Figure 235481DEST_PATH_IMAGE005
表 2：在不同周期的分离的经适应的菌株。
Figure 261206DEST_PATH_IMAGE006
表 3：暴露于空气之后的经适应的菌株的稳定性概况
Figure 528239DEST_PATH_IMAGE007
调整最终约pH 7.2
表 4：普拉梭菌的YCFAG培养基。
实施例5
进化菌株的遗传表征
实施例1中每次继代培养期间生成的进化菌株通过下一代测序(NGS)来表征。FFR-M和所有FFR-P培养物进行NGS用于深入的基因组分析，以摆脱经进化/适应的FFR-P后代中存在的任何可能的突变。还经由RNA-seq在转录组水平上研究FFR-M和FFR-P菌株之间的差异。
实施例6
厌氧微生物的增强产生
产生设置将涉及从实施例1获得的优化条件。来自实施例2的微生物的培养设置将与实施例1中相同，但将在固定氧化条件下仅涉及一个步骤，包括电压、半胱氨酸/胱氨酸对和氧流量。
优化的发酵条件如下；膜隔膜，其具有氧的质量传递系数(KOm)为1.3x10-4cm/s且进入阳极室的氧扩散速率为约0.2nmol ml-1min-1，施加电压为0.6V vsAgAgCL，半胱氨酸3mM，胱氨酸5mM，生长培养基SBCM的初始氧化还原电位为约-188mV。
在三室结构的由基于含氟聚合物(flouropolymer)的塑料材料制成的150-升电绝缘容器中进行发酵步骤。图4c。其使用如来自上述实施例2的制备物接种。
来自发酵的细胞浆液在来自Alfa Laval的连续离心机中分离并与标准冷冻保护剂混合，如本领域已知。进行洗涤步骤以避免冷冻干燥过程中的任何凝固点降低。
在冷冻干燥部位，将细胞浆液倒至冷冻干燥器中的每个板上。普拉梭菌的细胞浆液具有18％的干物质含量，并冷冻干燥4至5天。
否则，如本领域已知的那样进行微生物的发酵和冷冻干燥。

Claims (15)

1.用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括用经由逐步增加施加的电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了改变抗氧化剂/氧化的对应物浓度比以调节氧化还原状态的抗氧化剂浓度的逐步降低组合氧化的对应物浓度的逐步增加来培养所述微生物的组合步骤，其中培养基中的溶解氧浓度维持在亚致死浓度，在所述浓度下一些但不是所有微生物被杀死，并且其中所述厌氧微生物变得更耐氧且因此稳定且稳健储存。
2.权利要求1的方法，其中所述抗氧化剂/氧化的对应物选自半胱氨酸/胱氨酸、谷胱甘肽/谷胱甘肽-氧化态、抗坏血酸/脱氢抗坏血酸、二硫苏糖醇/氧化的二硫苏糖醇和没食子酸/氧化的没食子酸。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中用于所述方法的起始条件选自以下中的一种或多种或全部：低或零氧流量、低施加电压、高浓度的抗氧化剂和低浓度或零浓度的氧化的对应物、以及已经除去氧的培养基。
4.权利要求3的方法，其中所述起始条件选自以下中的一种或多种或全部：8mM半胱氨酸、0mM胱氨酸、0.1V的施加电压和零或低氧流量。
5.权利要求4的方法，其中持续逐步改变，直至以下中的一种或多种或全部：3mM的最小半胱氨酸浓度、5mM的最大胱氨酸浓度、0.6V的最大施加电压、以及高氧流量。
6.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述施加电压不超过0.6V，和/或半胱氨酸浓度不低于3mM，和/或胱氨酸浓度不高于5mM。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中一旦已经完成所述逐步改变，则所述方法包括在逐渐改变后达到的施加电压、氧扩散和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的最终条件下培养所述微生物的一个或多个进一步的步骤。
8.权利要求7的方法，其进一步包括其中进行进一步的逐步改变的步骤。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述方法或进一步的步骤涉及将所述厌氧微生物重新接种至新的培养基中。
10.权利要求9的方法，其中所述重新接种涉及培养条件中的所述逐步改变。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述微生物是普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述方法涉及进一步的步骤，其中筛选经适应的菌株的耐氧性、丁酸生产和/或生长动力学的评价，以选择具有维持的代谢特征的最佳的经适应的菌株。
13.用于增强产生厌氧微生物的方法，包括通过权利要求1-10中任一项的方法适应厌氧微生物并且选择更耐氧的厌氧微生物，并且进一步用恒定氧化电位/施加电压、氧扩散和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的组合来培养所述微生物，所述组合经过优化用于产生氧适应的微生物，其中培养基中的溶解氧浓度维持在亚致死浓度，因此实现选择压力并产生高产量的微生物。
14.权利要求13的方法，其中：(i)所述培养条件包括3mM半胱氨酸、5mM胱氨酸、0.6V的施加电压和0.2nmol ml-1min-1的氧流量；和/或(ii)所述微生物是普拉梭菌。
15.选自DSM 32380、DSM 32378和DSM 32379的普拉梭菌菌株。
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