CN101945991A - 通过发酵过程中氧化还原电位和溶解氧的联合调节来增加生物量和微生物代谢活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及培养微生物的方法，尤其这样类型的方法，其包括用一种或更多种微生物菌株接种培养基的步骤，和培养接种的培养基的步骤，所述方法的特征在于，在培养的全程或部分过程中，其包括两个下面的同时调节：调节培养基中溶解氧的量到给定的溶解氧设定点；调节培养基的氧化还原电位Eh值到给定的设定值Eh。
Description
本发明涉及用于培养微生物的方法，该方法通过氧化还原电位和溶解氧的联合调节，增加生物量和/或微生物代谢活性(也就是增加特定代谢产物，即微生物产生的特定分子的产生)。
作为说明，本发明可涉及例如乳酸菌，以及优选具有厌氧代谢的微生物，例如酵母。
本发明也涉及特定成品(例如葡萄酒或啤酒)的领域，所述成品的生产方法采用了发酵步骤。
实际培养步骤在容器里培养基中进行，伴随或不伴随搅拌，所述培养基的组成适合于各微生物的特定需求。培养基的组成可能极端不同，但提及的培养基通常由存在的多糖、甘油、奶、葡萄糖等的一种或更多成分构成。
相似地，可调节例如pH、温度、溶解氧分压等参数。
存在多种类型的培养方法：
-非连续性或“分批”培养，特别用于乳酸发酵或面包制造酵母的生产。
-半连续性“补料分批”培养，用于例如对发酵产物敏感的发酵生产，或对发酵底物抑制敏感的生物量的生产。
-包括或不包括回收的连续培养，后者特别用于酶和目标分子的生产，以及废水的生物净化。
保存生物量的步骤可以以液体形式、通过冷冻、低温保存、冷冻干燥或干燥下进行。使用保护剂来保护微生物不受保存措施的有害影响。
已知冷冻干燥是低温脱水操作，其包括在冷冻后通过升华除去产物中含有的大部分水分。
如所述，微生物广泛应用于食物领域，特别是乳酸菌用于如益生菌培养或发酵。这些以其技术能力标准大规模生产的乳酸菌的活力和代谢活性可能受其生产(接种、培养和浓缩)及其保存(冷冻或冷冻干燥)过程中经历的多个步骤的影响。
微生物也可用于生物燃料的生产，特别是通过将糖转变为乙醇。微生物也使得能够产生目标分子，特别是在制药领域。
因此，这些培养物的生物量和/或代谢活性的优化非常重要，且必然具有技术和经济上的重要性。
环境参数在微生物生长、代谢反应和负责微生物活性的生理机制中扮演关键角色。
如pH、温度或培养基组成、氧化还原电位值等，显示出对细菌菌株生长和活力的影响。实际上，一些对乳酸菌的研究已经显示了氧化还原电位对代谢流、益生菌发酵的存活以及目标分子的产生和/或稳定性的影响。在这方面，可参考以下文件：文件EP-1 856 241和EP-1 649 755，以及以申请人名义的WO 2007/036693 A1，或者专利US-7 078 201。
应当指出，文件WO 2007/036653涉及用于生产食物或生物技术产物的包含发酵步骤的方法中一个或更多步骤的氧化还原电位的调节，以便在还原条件下进行该方法的至少一个步骤，并在氧化条件下进行该方法的至少一个步骤，特别是使其有可能在还原条件下考虑的发酵的阶段与氧化条件下考虑的发酵的阶段交替进行。
多种化合物可用作还原剂，用于诱导氧化还原电位的降低和/或保持。其中，可提及亚硫酸盐类和氨，以及还原性气体，例如氢气或含氢混合气。
现有技术的这些研究已使其可能阐明，还原性培养基(氧化还原电位低的培养基)的使用，使其能够增加产生的生物量和产物在其后续保存中的活力，并使其能够增加代谢产物的产生。
现有技术报道的另一种增加所产生生物量的方法是使用少量的氧。虽然氧对兼性厌氧菌乳酸菌有抑制作用，文献中描述氧能够对其生长有利。因此，研究显示对于乳乳球菌的MG1363菌株，氧的添加使其能够增加所产生的生物量。以这种方式，生物量浓度从厌氧培养物中的0.54g/l(干重)升高到添加5％溶解氧的培养物中的0.68g/l(可参考Jensen等人的研究，题为“Metabolic behavior of Lactococcus lactis MG1363in microaerobiccontinuous cultivation at a low dilution rate”，载于AEM 2001，Vol.67，No.6)。
随即显示，现有技术推荐的两种方法，即前例中低氧化还原电位的建立和后例中对溶解氧量的作用，显然看来是不相容的。实际上，因为氧是强氧化剂，将其加入培养基中将显著增加氧化还原电位。
因此，如下详述所示，本发明的优点在于显示出，可能提供并调节溶解氧的量，同时将氧化还原电位调节至需要的固定低值，这就以极其有利的方式带来了培养菌株生产力的显著提高，尽管在本领域技术人员初步看来，考虑到上面提及的现有技术，调节前述的两个参数逻辑上很可能是破坏性的。
因此本发明提供了采用同时调节的方法，优选地使用气体或气体混合物来保证这些调节：
-氧化还原电位的调节将有利地使用向培养基中注射还原性气体或气体混合物(例如含有氢气的气体混合物)。考虑到例如抗坏血酸(维生素C)等化学品的添加也可用于引起氧化还原电位的这一调整，但正如所述的那样，优选使用合适气体的注射。
-然而有利地，溶解氧值的调节将通过向培养基注入空气或纯氧或富含氧气的空气，或任意能够释放氧气的气体(例如含有氧气和CO2的混合气等)进行。
-在发酵的全程或部分过程，即在细菌菌株培养的全程或部分过程中进行这些调节。
应当指出，上面参考的文件US-7 078 201表明，与常规发酵相比，氧化还原电位的最佳值会增加乙醇的产生、减少甘油的形成并减少发酵时间。该文件提出的方法提议，通过用空气注入向培养基连续充气的方法，将发酵罐中氧化还原电位的值保持在-250和+50mV之间。该文件作者寻求的目标是与氧化还原电位的降低反向进行，并且为此，根据该文件推荐的方法之一，作者推荐添加氢氧化钠以限制氧化还原电位值的降低，以此代替传统使用氨(被认为过于还原)来调节生长过程中的pH。
因此应当理解，作者根本没有提及氧化还原电位的稳定和连续调节至固定值(微调)，更没有涉及在调节溶解氧量同时调节氧化还原电位到需要的固定低值的事实(溶解氧含量，其将天然具有提高氧化还原电位的趋势)。
其次本发明涉及培养微生物的方法，所述方法属于这样的类型，其中，特别地，进行用一种或更多微生物菌株接种培养基的步骤，和培养以该方式接种的培养基的步骤，所述方法的特征在于，在培养的全程或部分过程中，同时进行以下两种调节：
-培养基中溶解氧的量调节到给定的溶解氧设定点，
-培养基的氧化还原电位Eh值调节到给定的Eh设定点值。
阅读以上描述时应当理解，根据本发明，调节培养基氧化还原电位Eh值到设定点值，所述设定点值小于仅仅调节溶解氧将天然达到的值。
此外，本发明可采用一种或更多以下技术特征：
-以此方式调节的氧化还原电位值是负数；
-氧化还原电位在-400到0mV的范围内进行调节；
-溶解氧的值在1到30％的范围内进行调节；
-根据有关的生长期来执行不同的调节顺序，是通过根据考虑的所述菌株生长期来采用不同的对(氧化还原电位设定点值，溶解氧设定点)；
-氧化还原电位的调节使用向培养基中注射还原性气体或气体混合物(例如含有氢气的气体混合物)的方法；而溶解氧值的调节使用向培养基中注射空气或者能够释放氧气的气体或气体混合物(例如纯氧或富含氧气的空气)的方法；
-氧化还原电位的调节使用向培养基进行化学化合物注射的方法；
-根据以下程序通过PID型调节进行两个同时发生的调节：
-首先通过采用向培养基注射可变气流进行初步测试，进行空气或氧气或能够释放氧气的混合物，以及还原性气体或气体混合物，一方面对溶解氧值，另一方面对氧化还原电位的影响评估；
-使用两个流速控制器，所述控制器能够调节有能力释放氧气的气体的流速，以及还原性气体或气体混合物进入培养基的流速。这些控制器构成了调节系统的执行器；
-使用带有数据采集的控制系统，如自动机，其周期性检查各流速控制器关于其设定点值及其相关的参数测量值，并据此修正其输出；
-各控制器的校正措施由所述的影响评估作为对氧化还原电位和溶解氧给定设定点的系统扰动的函数决定。
阅读参考图1的以下实施例可以更好地理解本发明，图1以示意图形式显示了用于进行试验的实验装置。
在容积1.5升的发酵罐中对嗜中温菌株乳乳球菌进行试验。
对氧化还原电位和溶解氧的固定目标值(设定点)分别是-200mV和10％。
对此10％溶解氧值应当这样理解：所用装置能够通过探头的方式测定培养基的氧浓度。这个探头用以下方式校准：向培养基注入H2/N2混合气(4/96)以排出存在的所有氧气。这个阶段，探头即应指示0％的溶解氧浓度。第二，用空气代替前述的H2/N2混合气，所述空气大量(通常以系统所能提供的最大流速)注入。等待直至测量值稳定后，系统即应指示100％的溶解氧值。如果不是这样，通过给予探头100％的值来校准探头。这个“100％溶解氧”即与所考虑培养基可以溶解的最大氧量相对应。一旦进行这一校准，即可用希望在培养基中建立的设定点(此处例如10％)来激活溶解氧的调节。随后在所考虑培养基可溶解最大值的10％下进行试验。
相似地，在下文中详细解释根据本发明的两种同时的调节的一个实施方案。
使用自动机，其周期性(根据施加给自动机的时间段，例如少于一秒)检查各质量流量控制器，即其设定点值和考虑的参数测量值，并据此修正其输出(即其作为反馈给出的指令)。这种情况下，应用PID型控制，其在此处使得可能调节氧化还原电位和溶解氧两者。如下文中将更详细解释的那样，实际上应当指出，氧化还原电位和溶解氧不具有相同行为，对同一流速变化也不具有相同的时间常数或者相同的反应幅度。因此，各控制器的参数不相同，对各PID采用的微调使控制器不震动，该实施方法从而限制了它们之间的干扰。
以上描述的实施方法只是一个实施方案的说明，其当然不会排除其他调节方法，并且其任何时候均不脱离本发明的范围。
通常安装的控制器输入和输出如下所述：
对氧化还原：
-作为输入
i)从人机界面(MMI)给定的氧化还原设定点(毫伏)
j)浸没在培养基中的传感器按毫伏传输的氧化还原测量值；
-作为输出：
k)输送到培养基中的H2/N2流速。
对溶解氧
-作为输入
i)从人机界面(MMI)输入的，表达为百分比(0-100％)的溶解氧设定点；
j)相应探头按毫伏传输的溶解氧测量值，并为了与设定点有相同的单位而转换为百分比。
-作为输出
k)输送到培养基的空气流速。
更精确地，作为上面显示的实施方法的实例：
-所用PID型控制器实际上是比例积分控制器。也可以使用其他类型的控制器，例如内模或模糊逻辑控制器，
-如上所示，氧化还原电位和溶解氧不具有相同行为，对同一流速变化也不具有相同的时间常数或者相同的应幅度。因此，各控制器的参数不相同，对各PID采用的合适调节令控制器能够不震动，其以这种方法限制它们之间的干扰。更精确地，根据本发明使区分各控制器参数成为可能的，是对空气或能够释放氧气的其他气体以及含氢混合气，一方面对溶解氧，另一方面对氧化还原电位的影响的先前定量。这一定量是通过初步测试进行的，所述测试中注射入培养基的气流确立了变化。这些测试使得能够决定空气注射对氧化还原电位和溶解氧的影响，并且随后决定注射含氢混合气对氧化还原电位和溶解氧的影响。这些测试使得能够了解各种气体对其测量的参考量的影响，及其(或其产生的扰动)对其他测量量的影响。这些实验使得能够得出结论，在研究的情况(气体混合物、处理的培养基等)下：
-含氢混合气对溶解氧的影响大约比空气小四倍，
-关于氧化还原电位，空气的影响比含氢混合气的小10倍。
考虑到转移函数的这一鉴定，因此可能决定各校正器的参数，其目标是系统正确地对固定点的系统扰动作出反应。实际上，根据本发明，在生长的全程或部分过程建立给定的设定点，并且另一方面细菌在培养基中的生长效应应包括在校正器参数的决定之中。实际上已知细菌的生长对氧化还原电位有影响：生长过程中氧化还原电位下降，并且耗氧量增加。其由扰动调节的现象组成：使校正器的调节对这一扰动尽可能作出最好的反应。
以这种方式，是进行鉴定和其中调解校正器(对扰动而不是设定点的变化作出反应)方式的组合，使得可能通过使用“简单”的PID(单变量)型控制器观察得到结果。
上面涉及的试验过程中的调节目标，是在至少部分的菌株生长过程中，保持氧化还原电位的恒定值和恒定的溶解氧值(这确实将在下文注释的图2见到更多)。
在发酵结束(培养结束)以及冷冻沉淀和冻干产物上测量每次操作的生物量、酸化活性和生产力。这些结果与氧化还原电位和溶解氧都不作调节的对照培养物(在发酵罐顶部空间用氮气以0.5l/min简单冲洗制备的好氧培养物)进行比较。
图2中展示的结果显示了对乳乳球菌株溶解氧值(pO2)和氧化还原电位(Eh)调节的追踪。
下表中描述了各生产步骤中取得的多种增量。
根据其可能，显示了本发明的基本结果，通过控制调节的系统分开并同时调节两个参数：氧化还原电位和溶解氧。
随即发现冻干产物步骤取得的增量大于50％，这很令人满意。通过同时调节氧化还原电位和溶解氧两个参数，生物量和酸化活性得到大幅度增长。
所得结果表格
| 发酵结束 | 冷冻的沉淀 | 冻干产物 | |
| 生物量的增量(按％) | 28％ | 45％ | 55％ |
| 酸化活性的增量(按％) | 17％ | 19％ | 71％ |
| 生产力的增量(按％) | 17％ | 未测定 | 71％ |
如本领域技术人员明白的，最佳溶解氧和氧化还原电位值将必须根据菌株和靶定目标(生物量的生产和/或代谢产物的生产)进行调节。
不同调节顺序的性能也可以看做相关生长期的函数，那就是说不同对(氧化还原/pO2的值)作为菌株生长期的函数而建立，并且下面给出数字实例作为说明：
-在生长的初始期，低氧化还原值接近-400mV，并且溶解氧值接近10％，
-随后，在指数期，氧化还原值接近-400mV，并且溶解氧值接近5％，
-在稳定期，氧化还原值接近-400mV，并且氧值接近0％。
Claims (8)
1.培养微生物的方法，所述方法属于这样的类型，其中，特别地，进行用一种或更多种微生物菌株接种培养基的步骤，和培养以该方式接种的培养基的步骤，所述方法的特征在于，在培养的全程或部分过程中，同时进行以下两个调节：
-调节培养基中溶解氧的量到给定的溶解氧设定点，
-调节培养基的氧化还原电位Eh值到Eh给定的设定点值。
2.权利要求1的培养方法，其特征在于以该方式调节的氧化还原电位值是负数。
3.权利要求1或2的培养方法，其特征在于氧化还原电位在-400到0mV的范围内进行调节。
4.权利要求1到3的培养方法，其特征在于溶解氧值在1到30％的范围内进行调节。
5.前述权利要求之一的培养方法，其特征在于根据有关的生长期，通过根据考虑的所述菌株生长期使用不同的对(氧化还原电位设定点值，溶解氧设定点)来进行不同的调节顺序。
6.前述权利要求之一的培养方法，其特征在于氧化还原电位的调节使用向培养基中注射还原性气体或气体混合物(例如含有氢气的气体混合物)，而溶解氧值的调节使用向培养基中注射空气或者能够释放氧气的气体或气体混合物(例如纯氧或富含氧气的空气)。
7.权利要求1到5之一的培养方法，其特征在于氧化还原电位的调节使用向培养基中注射化学化合物。
8.权利要求1到6之一的培养方法，其特征在于根据以下步骤通过PID型调节进行两个同时发生的调节：
-首先通过使用向培养基注射可变气流进行初步测试，进行空气或能够释放氧气的混合物以及还原性气体或气体混合物的注射，一方面对溶解氧值，另一方面对氧化还原电位的影响的评估；
-使用两个流速控制器，所述控制器能够调节能够释放氧气的气体的流速以及还原性气体或气体混合物进入培养基的流速；
-使用带有数据采集的控制系统，如自动机，其周期性检查各流速控制器关于其设定点值及其相关的参数测量值，并据此修正其输出；
-各控制器的校正措施由所述的影响评估作为对氧化还原电位和溶解氧给定设定点的系统扰动函数决定。
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